Automated Protocole microfluidiques lyse du sang pour l'enrichissement de cellules circulantes nucléées

Pour enrichir les cellules nucléées circulantes à partir de sang. Le dispositif microfluidique est d'abord amorcé avec un XPBS afin d'éliminer les bulles, puis de l'eau déionisée et du paraldéhyde à 2 % dans deux volumes d'XPBS sont ensuite passés à travers le dispositif à l'aide de pompes à seringue avant le chargement de l'échantillon sanguin. Le sang est ensuite traité à travers le dispositif microfluidique et, après traitement de l'échantillon, la collecte comprend une centrifugation et l'élimination du surnageant.

Enfin, l'échantillon est analysé par cytométrie en flux afin de produire des graphiques en fax. Bonjour, je suis William White du laboratoire de biotechnologie à micro-échelle du département de génie biomédical de l'Université de Wool. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'enrichissement des cellules nucléées circulantes par lyse du sang total à l'aide de la microfluidique.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'inflammation dans divers processus pathologiques afin de garantir l'enrichissement des leucocytes et des autres cellules nucléées circulantes sans perte ni activation. Commençons donc. Pour commencer cette procédure, insérez fermement un tube d'accès dont le diamètre est légèrement supérieur à celui des orifices d'accès aux canaux dans les entrées et sorties.

Ensuite, pour assurer l'interface entre le macro et le micro, fixez une aiguille de seringue de calibre 30 au tube sur chacune des entrées. Remplissez ensuite une seringue d'un millilitre avec un XPBS, en veillant à éliminer les bulles d'air. Connectez la seringue à l'entrée un et poussez doucement la seringue à la main jusqu'à ce que l'XPBS s'écoule par l'entrée deux.

Ensuite, pincez immédiatement l'entrée deux à l'aide d'un trombone de bureau. Continuez à pousser la seringue jusqu'à ce qu'une solution XPBS atteigne le port de sortie du dispositif microfluidique. Une fois la solution écoulée par la sortie, pincez le tube de sortie à l'aide d'un autre trombone.

Continuer à pousser la seringue d'un millilitre jusqu'à ce qu'un XPBS sorte de l'entrée trois, puis pincer le port de l'entrée trois avec une troisième pince à rabats. Le dispositif microfluidique est désormais complètement amorcé. Commencer l'étalonnage des pompes à seringue à l'aide de la grande pompe à seringue Harvard en réglant le diamètre sur 22,5 millimètres et le débit à 600 microlitres par minute.

Pour la petite pompe à seringue Harvard, réglez le diamètre sur 4,61 millimètres et le débit sur 20 microlitres par minute. Ensuite, remplissez une seringue de 30 millilitres avec de l'eau déionisée en aspirant directement la solution à partir du tube conique de 50 millilitres.

N'oubliez pas d'étiqueter la seringue, remplissez une autre seringue de 30 millilitres avec deux XPBS contenant une solution de paraformaldéhyde à 2 %. Retirez à nouveau directement depuis un tube conique et étiquetez la seringue. Connectez maintenant la seringue contenant de l'eau à l'entrée deux et la seringue contenant du paraformaldéhyde à 2 % dans deux XPBS à l'entrée trois, en veillant à ce qu'aucune bulle ne soit piégée dans le tube ou dans le dispositif microfluidique.

Ensuite, retirez les pinces des tubulures d'entrée deux, d'entrée trois et de la tubulure de sortie, les trois seringues restant connectées. Assemblez ensuite les deux grandes seringues sur la pompe à seringue Harvard de grande taille et placez la seringue d'un millilitre sur la pompe à seringue Harvard de petite taille. Positionnez la tubulure de sortie dans un tube conique de 50 millilitres destiné à la collecte des déchets.

Maintenant, allumez la pompe à seringue Harvard de grande taille contenant les seringues de 30 millilitres et laissez-la fonctionner pendant une minute. Vérifiez qu’il n’y a pas de bulles ni de fuites dans l’appareil ou dans les tubulures. Ensuite, allumez la pompe à seringue Harvard de petite taille et laissez-la également fonctionner pendant une minute supplémentaire.

Vérification des bulles et des fuites. Arrêter les pompes après deux minutes. Étant donné que le dispositif microfluidique est désormais prêt à être utilisé avec des échantillons sanguins, les échantillons de sang à analyser ont été collectés comme décrit dans le protocole écrit d'accompagnement et sont utilisés dans l'heure suivant leur prélèvement.

Le premier tube de sang prélevé est éliminé afin d'éviter les résultats faussement positifs. Retirez la seringue d'un millilitre de la petite pompe à seringue Harvard, puis injectez un XPBS à partir de la seringue d'un millilitre en remplissant l'aiguille de la seringue. Pour éviter l'introduction de bulles, remplissez une seringue d'un millilitre avec 50 microlitres de un XPBS sans piéger de bulles d'air.

Ensuite, remplissez la seringue avec 0,5 millilitre de sang. Maintenez la seringue verticale pendant le remplissage afin d'éviter de mélanger le PBS avec le sang. Puis, reconnectez la seringue contenant le sang à l'entrée un.

Essuyez tout excès de liquide et fixez la seringue verticalement sur la petite pompe à seringue Harvard. Veillez à ne pas faire passer le sang à travers le tube jusqu'à l'appareil. Retirez le tube de sortie du tube de rebut et placez-le dans un tube de centrifugation propre de 50 millilitres placé dans un seau à glace.

Démarrez maintenant l'interrupteur de fonctionnement sur la grande pompe à seringue Harvard en premier et laissez-la fonctionner pendant une minute. Ensuite, activez la petite pompe à seringue Harvard. L'échantillon commencera à s'écouler par le tube de sortie vers le tube à centrifuger de 50 millilitres.

Laisser l'échantillon de sang dans la seringue d'un millilitre traverser complètement le dispositif, ce qui prend environ 20 minutes. Ensuite, arrêter les deux pompes. Maintenant que l'analyse est terminée, centrifuger l'échantillon recueilli pendant cinq minutes à 350 ×g à température ambiante avec le frein désactivé.

Éliminer le surnageant en plaçant la pointe de la pipette du côté opposé au culot blanc. Retirer autant de surnageant que possible, en particulier les débris de globules rouges, sans perturber le culot blanc. Resuspendre l'échantillon dans un millilitre de tampon d'écoulement contenant 1 % de BSA et 2 % de paraformaldéhyde dans un XPBS à l'aide d'une pipette.

Haut et bas, transférez l'échantillon dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre (eppendorf), puis centrifugez l'échantillon recueilli pendant cinq minutes à quatre fois g. À température ambiante, retirez le surnageant aussi soigneusement qu'à l'étape précédente de centrifugation. Enfin, ajoutez un millilitre de tampon d'écoulement et vortexez pour remettre en suspension l'échantillon, puis procédez à l'analyse de l'échantillon par cytométrie en flux.

Nous allons maintenant présenter quelques résultats représentatifs sous forme de diagrammes Fax provenant d'un échantillon sanguin enrichi par le dispositif microfluidique, avec une analyse réalisée par cytométrie en flux. L'importance de l'enrichissement par lyse peut être observée sur un diagramme Fax où les globules rouges forment un nuage. Le nuage de points produit par le protocole d'enrichissement microfluidique est un nuage propre, avec des populations cellulaires nuclées bien définies présentes en circulation.

La région rouge représente les lymphocytes, la verte représente les monocytes, la bleue représente les granulocytes, et la région violette n’a pas encore été caractérisée. L’incapacité à éliminer les débris de globules rouges dans le protocole produit un regroupement d’événements dans le tracé fax observé dans la région cyan. Les populations cellulaires peuvent être visualisées sur des tracés fax séparés.

Les lymphocytes maintenus avec CD3 et CD4. Les monocytes maintenus avec CD14 et les granulocytes maintenus avec CD66b. Nous venons de vous montrer comment préparer et exécuter un échantillon sanguin à l’aide du dispositif microfluidique de lyse sanguine. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’analyser immédiatement l’échantillon sanguin afin d’éviter que le PBS ne se mélange au sang avant son entrée dans le dispositif, et de prévenir l’introduction de bulles dans les canaux du dispositif.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.