Fabrication et fonctionnement d'un insert d'oxygène pour les adhérents des cultures cellulaires

Le dispositif d’insertion hypoxique a six piliers qui s’emboîtent dans les puits d’un six. Le gaz de la plaque de puits s’écoule à travers le réseau microfluidique à la base du pilier et peut diffuser à travers la membrane PDMS perméable aux gaz, séparant le réseau de gaz et les milieux de culture. Ce dispositif minimise la longueur du chemin de diffusion entre la source d’oxygène, le réseau microfluidique à la base du pilier et les cellules, ce qui permet une concentration plus rapide de l’oxygène. Équilibration.

Le dispositif permet également un contrôle beaucoup plus grand du modèle spatial de l’oxygène exposé aux cellules, qui est déterminé par la conception du réseau de gaz microfluidique réalisée par photolithographie standard à l’aide de masques photo. Bonjour, je suis Sean Ard du laboratoire du Dr David Edington du département de bio-ingénierie de l’Université de l’Illinois à Chicago. Bonjour, je m’appelle Ellie et je travaille également au laboratoire Edington.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer comment fabriquer, valider et utiliser un dispositif personnalisé pour exposer des cultures cellulaires in vitro dans une plaque sextuple à différentes concentrations d’oxygène. Nous avons utilisé cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l’effet de l’oxygène sur la cicatrisation des plaies, la génération et la migration des espèces réactives de l’oxygène. Alors commençons.

Pour commencer la fabrication de l’insert oxygénénisant, préparez du Polymethyl Sloane ou du PDMS dans un rapport de 10 pour un entre le prépolymère et l’agent de durcissement. Selon les instructions du fabricant, le mélange PDMS est ajouté à un moule Dell préalablement usiné, conçu pour imiter la forme d’une plaque de culture standard à six puits. Une fois durci à 75 degrés Celsius pendant la nuit, le réseau de piliers moulés résultant formera le premier des trois composants qui composent l’insert oxygénant afin de fabriquer le deuxième composant clé de l’insert oxygénant.

Un master SU eight est préparé en filant d’abord le SU 8 21 50. Sur une plaquette de silicium, un masque photo est appliqué sur la plaquette et le SU huit est exposé aux UV à travers le masque photo pour créer un moule maître d’une épaisseur de microcanal de 300 micromètres. Versez le PDMS sur le SU eight Master et durcissez pendant deux heures à 75 degrés Celsius pour obtenir un moule positif qui finira par former les microcanaux au bas de chaque pilier.

Le troisième composant du dispositif est fabriqué en faisant tourner PDMS sur une plaquette de silicium à 500 tr/min pendant 10 secondes, suivi de 900 tr/min pendant 30 secondes pour obtenir un cerveau à membrane de 100 micromètres d’épaisseur. Comme les PDM sont perméables aux gaz, l’oxygène peut être délivré dans les microcanaux directement à travers cette membrane. Une fois que tous les composants sont préparés, chaque surface de liaison est soumise à un traitement au plasma d’oxygène pendant une minute.

À l’aide d’un appareil plasma portable, collez d’abord les six composants à microcanaux au réseau de piliers, puis percez deux trous dans chaque pilier pour servir d’entrées et de sorties de gaz. Enfin, collez la membrane au fond du microcanal pour faciliter la liaison et expulser les bulles. Les surfaces traitées au plasma sont pressées ensemble pendant environ une minute à l’aide du mélange, à l’extrémité d’une pince à épiler, attendez une heure entre chaque collage pour vous assurer que l’appareil est complètement collé et peut être calibré.

Une fois qu’un dispositif complet a été fabriqué, le niveau d’oxygène reçu par les cellules lors de l’utilisation de l’insert oxygénant dans des expériences réelles doit être calibré. Pour l’étalonnage, utilisez un capteur d’oxygène fluorescent ou une lame de renfort, qui contient un revêtement de colorant fluorescent au ruthénium trempé par l’oxygène. Les lames Foxy sont prédécoupées pour s’insérer dans le fond d’une plaque à six puits.

La lame de renard doit être coupée pour couvrir autant que possible la surface du puits. Étant donné que la lame foxy a une épaisseur d’environ un millimètre, modifiez l’appareil pour maintenir la distance souhaitée pour une membrane adéquate. Diffusion de diapositives.

Cette distance dépend de l’expérience, mais dans la plupart des cas, elle doit être inférieure à un millimètre à l’aide du microscope à verre à plasma portatif à quatre coupes d’un millimètre d’épaisseur. Faites glisser des poteaux d’environ six millimètres de longueur et quatre millimètres de largeur vers le bas de l’appareil. L’appareil reposera sur des poteaux au sommet de la coupe de glissière.

Des lamelles de recouvrement en verre peuvent également être utilisées pour un écart de diffusion de 0,17 millimètre afin de valider l’utilisation de l’oxygène. À trois millilitres d’eau déminéralisée à température ambiante dans les puits de la plaque à six puits où l’oxygène sera mesuré. Placez l’appareil dans la plaque et à l’aide du logiciel metamorph, sélectionnez le nombre et l’emplacement des positions souhaitées sur le capteur foxy.

Glisser pour mesurer les concentrations d’oxygène. Connectez le tube du pistolet tai entre le réservoir d’oxygène et le dispositif d’insertion hypoxique. Un régulateur de débit de précision réglé sur un débit de 50 à 100 millilitres par minute est utilisé pour un contrôle précis du gaz délivré.

Assurez-vous que le régulateur de débit de précision est fermé. Ouvrez d’abord le régulateur de réservoir, puis le régulateur de précision. Réduire le débit entre 10 et 20 par minute après 15 minutes.

Pour éviter de créer des bulles dans l’eau, surveillez de près la valeur du débit au cours de la prochaine heure et faites des ajustements si nécessaire car la chute de pression changera pendant que le système s’équilibre, modifiant le débit pour capturer des images de la plaque et des capteurs foxy. Un microscope Olympus IX 71 équipé d’une fluorescence, une caméra à couple de charge de Q Imaging, Tiga, SRV et les logiciels d’acquisition d’images Metamorpho sont utilisés. Le microscope est équipé d’un Olympus 3 1 0 2 0, un filtre fluorescent compatible foxy avec une longueur d’onde d’excitation de 475 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 600 nanomètres.

Pour tester le temps d’équilibre et l’étendue de l’oxygénation de l’appareil, choisissez trois points sur la lame de renard dans lesquels mesurer la concentration d’oxygène. Capturez une image de la diapositive immédiatement avant de commencer le flux de gaz. Capturez des images et des intervalles de 10 secondes sur 30 minutes pendant que le gaz circule dans l’appareil pour tester l’hétérogénéité et l’administration d’oxygène.

Établissez plusieurs points à des intervalles d’un millimètre sur toute la largeur du canal et mesurez la concentration d’oxygène à la surface du puits à l’aide de Metamorph. Exportez l’intensité moyenne de l’image pour chaque position et tracez la concentration d’oxygénation en fonction de l’intensité de fluorescence. Générez une courbe d’étalonnage en ajustant des courbes linéaires à la ligne de zéro à 10 % et à la ligne de 10 à 21 % reliant l’intensité de fluorescence à la concentration d’oxygène Pour chaque position mesurée, les données d’intensité brutes peuvent être exportées de metamorph et analysées plus en détail avec Microsoft Excel ou d’autres logiciels statistiques.

Une fois que l’appareil a été calibré, les expériences telles que les tests de cicatrisation des plaies peuvent commencer à autoclaver l’insert calibré à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes dans les 24 heures précédant l’expérience et le travailler dans une hotte de culture à flux laminaire pour éviter toute contamination ultérieure. Faites tremper l’insert PDMS stérilisé dans un milieu sans sérum pendant 24 heures pour inhiber les bulles de gaz lors de l’insertion dans les puits de la plaque de culture, des cellules MDCK ou d’autres cellules adhérentes à une fluidité de 100 % de co dans une plaque à six puits pour créer des rayures droites dans les couches mono avec une pointe de pipette P 200. Les égratignures simulent des plaies dans la monocouche adhérente.

Aspirez le milieu cellulaire sans perturber la monocouche et rincez-le avec cinq millilitres de média. Aspirez à nouveau et remplissez les puits avec trois millilitres de sérum gratuit. Insérez doucement l’appareil dans la plaque, en veillant à éviter les bulles.

L’inclinaison de l’appareil lors de l’insertion permet d’expulser les bulles d’un côté. Veillez à ne pas exercer une pression excessive sur l’appareil, ce qui pourrait déformer le PDMS au point d’écraser les cellules sous-jacentes. Placez la plaque et l’appareil sur une platine de microscope chauffée à 37 degrés Celsius et connectez le tube du réservoir de gaz source aux orifices d’entrée et de sortie de l’appareil.

L’incubateur de culture doit avoir un trou pour permettre l’entrée de la tubulure et la tubulure doit être connectée Après avoir placé l’appareil dans l’incubateur, suivez la même procédure pour démarrer le flux de gaz que celle décrite précédemment pour évaluer la cicatrisation des plaies Capturez des images en accéléré des cellules toutes les 20 minutes pendant 15 à 18 heures à l’aide de l’équipement et du logiciel d’imagerie comme décrit précédemment. L’algorithme de mesure de la blessure peut être utilisé pour analyser la surface non cicatrisée après une durée expérimentale souhaitée. Arrêtez le flux de gaz, retirez la plaque et procédez au traitement ultérieur des cellules si vous le souhaitez. Le dispositif d’insertion hypoxique nécessite moins de deux minutes pour se stabiliser à 0,5 % d’oxygène, comme illustré ici.

La taille de l’espace au fond du puits de la membrane du dispositif était un facteur critique pour déterminer l’efficacité de l’équilibrage, les espaces plus grands nécessitant plus de temps pour atteindre les valeurs de concentration d’oxygène à l’état stable. Le dispositif permet également un grand contrôle de l’oxygénation spatiale dans un seul puits, ce qui permet la formation de plusieurs conditions et même la génération d’un profil d’oxygène cyclique à la surface du puits. Les monocouches de cellules MDCK ont été exposées à 10 % ou 21 % d’oxygène et la surface de la plaie a été analysée au fil du temps à l’aide de l’algorithme de traînée de grattage MATLAB TS.

Après 11 heures sur 17 heures au total, 6,87 % de la plaie d’origine est restée exposée à 10 % d’oxygène, tandis que 64,4 % de la plaie est restée sous 21 %. Comme le montre ici, les concentrations d’oxygène sont négativement corrélées à la surface ouverte de la plaie pour les deux concentrations d’oxygène. Pour la durée de l’expérience, nous venons de vous montrer comment fabriquer, valider et utiliser le dispositif d’insertion hypoxique pour un test de cicatrisation des plaies par égratignures. L’appareil offre un certain nombre d’avantages par rapport aux autres systèmes d’oxygénation, tels qu’un encombrement de laboratoire plus petit et un contrôle beaucoup plus grand de l’oxygénation spatiale et temporelle à la surface de la cellule.

L’appareil peut être utilisé par pratiquement n’importe quel laboratoire qui étudie l’effet de l’oxygène ou d’autres gaz comme le dioxyde de carbone sur les cultures cellulaires in vitro. Lors de cette procédure, il est important de faire tremper le dispositif stérilisé et les milieux de culture pendant la nuit, de minimiser la formation de bulles pendant l’expérience. De plus, laissez le système s’aligner avant de commencer l’expérience.

En effet, le débit change lorsque la pression dans le système est équivalente. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.