Name: Fabrication et fonctionnement dun insert doxygène pour les adhérents des cultures cellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-06T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Découvrez la fabrication d'un insert hypoxique en PDMS pour contrôler l'oxygénation spatiale et temporelle des cultures cellulaires adhérentes. Cette méthode permet d'étudier les effets de l'oxygène sur la cicatrisation des plaies in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce projet a été financé par le ministère de l&#39;Illinois de la santé publique et de la National Science Foundation (DBI-0852416).

1. Fonctionnement de l'appareil <ol><li> Le dispositif d'insertion hypoxiques contient 6 piliers qui nichent dans une norme de 6 puits assiette. Flux de gaz dans le pilier, à travers un réseau microfluidique à la base du pilier, et reflue hors de l'appareil. A la base du pilier formant la paroi du fond du microcanal est un 100 um d'épaisseur perméable aux gaz membrane de PDMS qui permet la diffusion d'oxygène entre le gaz microcanaux et des médias de la culture. Ainsi, le dispositif fonctionne en créant un gradient de concentration qui anime la concentration en oxygène des médias vers une valeur souhaitée. </li><li> L'appareil offre un certain nombre d'avantages sur la chambre hypoxique et d'autres systèmes d'oxygénation cellulaire: 1) minimise le chemin diffusion de l'oxygène permettant un contrôle plus rapide temporelle, 2) améliore le contrôle spatial de plus d'oxygénation, comme dépendant de la conception des piliers de microcanaux, 3) possède une plus petite empreinte de laboratoire et un débit plus élevé pour augmenter l'efficacité expérimentale, et 4) s'adapte à des outils communs de culture cellulaire (par exemple la plaque multipuits) sans l'exigence de connaissances et d'équipements spécialisés. </li></ol> 2. Fabrication de dispositifs <ol><li> D'abord le tableau pilier est moulé avec PDMS réplique dans un moule préalablement usinées Delran. </li><li> Suivant le gaz microcanaux au bas de chaque pilier est fabriqué en utilisant la norme SU-8 photolithographie et de moulage de PDMS réplique. </li><li> Le gaz membrane perméable est fabriqué en faisant tourner défini de PDMS sur un wafer de silicium pour obtenir l'épaisseur désirée. Dans cet exemple nous utilisons une membrane 100 um d'épaisseur qui a été fabriquée en faisant tourner 500 rpm pendant 10 secondes, puis 900 rpm pendant 30 secondes. </li><li> Tous les composants sont collés ensemble après le traitement par plasma d'oxygène avec un appareil de poche de plasma (modèle BD-20, Produits Electro-Technic). </li></ol> 3. Configuration des périphériques <ol><li> Insérez doucement appareil dans la plaque, en veillant à éviter les bulles. Pêche du périphérique lors de l'insertion aide à expulser les bulles d'un côté. Pour réelles basées sur les cellules expériences, cette étape doit être fait à l'intérieur d'une hotte à flux laminaire stérile. Les chances de contamination sont considérablement réduits une fois que le dispositif est inséré, de sorte que le montage peut être reporté sur l'incubateur dans un environnement non stérile. </li><li> Relier les tubes du réservoir de gaz source pour les ports d'entrée et de sortie du dispositif. À base de cellules expériences, l'incubateur de culture doit avoir un trou pour permettre l'entrée des tubes et les tuyaux doivent être connectés après la réalisation de l'appareil et de le placer dans l'incubateur. Soyez prudent pour éviter de mettre une pression excessive sur l'appareil, ce qui pourrait déformer le PDMS suffisante pour écraser les cellules sous-jacentes. </li><li> Assurez-vous que le régulateur de débit de précision est fermé avant d'ouvrir le régulateur débardeur pour éviter tout débordement de l'appareil. Démarrer le flux de gaz. Régulateur de débit doucement ouverte de précision pour le débit souhaité (50-100 mL / min). Regardez la valeur de près au cours de la prochaine heure et faire les ajustements nécessaires, depuis la chute de pression va changer tout le système s'équilibre, en modifiant le débit. Pour éviter la formation de bulles dans les médias, de réduire le débit d'entre 10-20 ml / min après une durée d'équilibration initiale de 15 minutes avec le débit plus élevé. </li><li> Après une durée expérimentale voulue, arrêter le débit de gaz, enlever la plaque, et les cellules traiter en conséquence (par exemple, Lyse, teinture, compter, etc.) </li></ol> 4. Validation de périphérique <ol><li> Calibration <ol><li> Sélectionnez le nombre et l'emplacement des postes de l'oxygène fluorescentes Faire glisser le capteur (Foxy) (selon les exigences de validation) qui sera utilisé pour la mesure de l'oxygène. La diapositive contient un revêtement ruthénium colorant fluorescent qui est trempé par l'oxygène. </li><li> Exposer glisser directement à 0, 10 et 21% d'oxygène du réservoir de gaz et de capturer des images après 5 minutes pour atteindre l'équilibre approprié. </li><li> Exporter l'intensité de l'image moyenne pour chaque position et la concentration d'oxygénation parcelle dépend de l'intensité fluorescente. </li><li> Générer courbe d'étalonnage en ajustant les courbes linéaires à la ligne de 0-10% et 10-21% en ligne. </li></ol></li><li> Hétérogénéité <ol><li> Établir des points multiples couvrant la largeur de la voie à un intervalle défini (par exemple tous les 1 mm). Notez qu'il peut y avoir un chevauchement d'images en fonction de l'espacement. </li><li> Mesurer la concentration d'oxygène à la surface du puits à travers le dispositif </li></ol></li><li> Equilibration <ol><li> Choisir trois points sur la diapositive dans laquelle FOXY pour mesurer la concentration d'oxygène. </li><li> Immédiatement après la capture d'une première image à des niveaux d'oxygène ambiant, ouvrez le régulateur de débit de précision pour commencer écoulement du gaz dans le dispositif. Capture d'images à un intervalle approprié pour évaluer la durée et l'étendue de l'oxygène concentréquilibration tion (par exemple toutes les 10 secondes pendant 30 min.) </li></ol></li></ol> 5. Applications <ol><li> Cicatrisation <ol><li> Un jour avant l'expérience, faire tremper l'insert stérilisés PDMS dans un milieu sans sérum pour réduire les inhiber la formation de bulles de gaz dans le puits. </li><li> Cellules en culture à 100% de confluence dans une plaque à 6 puits. </li><li> Créer rayures droites dans les monocouches avec une pointe de pipette P200 pour simuler des blessures. </li><li> Aspirer le milieu cellulaire, rincez avec les médias de 5 ml, et aspirer à nouveau. Il est important de ne pas perturber la monocouche de cellules. </li><li> Remplir le puits avec 4 ml milieu sans sérum pour réduire la prolifération cellulaire. </li><li> Placez l'insérer dans le puits et relier chaque puits à une concentration d'oxygène correspondant. </li><li> Placer la plaque de 6 puits avec insert sur scène chauffée à 37 ° C. </li><li> Capture d'images laps de temps des cellules à l'intervalle désiré et la durée totale. T_Scratch MATLAB, un algorithme de mesure des plaies, peut être utilisé pour analyser la surface cicatrisée. </li></ol></li></ol> 6. Les résultats représentatifs <ol><li> Dispositif de validation Le dispositif d'insertion hypoxiques expositions de grandes améliorations sur la chambre hypoxique en termes de temps d'équilibrage de l'oxygène et l'étendue, nécessitant moins de 2 minutes pour se stabiliser à l'oxygène de 0,5%. La membrane ainsi dispositif de taille de l'espace en bas a été le facteur déterminant de l'efficacité d'équilibration, avec des tailles plus grandes lacunes nécessitant plus de temps pour atteindre l'état stationnaire des valeurs de concentration en oxygène. Le dispositif permet également beaucoup de contrôle sur l'oxygénation spatiale dans un seul puits, permettant la formation de plusieurs conditions, et même générer un profil d'oxygène cycliques à travers la surface du puits. </li><li> Cicatrisation des plaies Monocouches de cellules ont été exposées à 10% ou 21% d'oxygène et la surface de la plaie a été analysé au cours du temps. Scratches exposés à l'oxygène 21% fermés le plus lent et 10% plus rapide. La figure 1 montre des images d'une égratignure au cours des 17 heures. Les graphiques de la figure 5 montrent le pour cent de surface de la plaie ouverte pour les deux concentrations d'oxygène pour la durée de l'expérience. </li></ol> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig1tmb.jpg" alt="Figure 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"></a> Figure 1. Schéma et diagrammes illustrant les fonctions du périphérique. Le dispositif d'insertion d'oxygène est fabriqué par photolithographie classique (réseau microfluidique), le moulage réplique (microfluidique réseau et insérez échafaudage), et défini filature de PDMS (perméables aux gaz par membrane). A) Le dispositif de l'oxygène imbriquées dans une plaque à 6 puits. B) Exemples de 24 et de 96 puits tableaux pilier. C) Une coupe transversale schématique d'un pilier. L'oxygène se jette dans l'appareil grâce à l'entrée et se déplace à travers un réseau microfluidique au bas de la colonne. L'oxygène peut diffuser librement à travers la membrane perméable aux gaz PDMS au bas de la colonne et se dissolvent dans les milieux de culture. D) Une image au microscope montrant les différentes fonctionnalités d'un pilier à canal unique d'en haut, avec des messages de verre collé pour les études d'équilibration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig2tmb.jpg" alt="Figure 2" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"></a> Figure 2. Validation de l'appareil avec des capteurs d'oxygène. Tension d'oxygène au sein de chaque puits a été caractérisée en utilisant un capteur d'oxygène planaires ruthénium. Tous les mélanges d'azote oxygène contenu équilibré et 5% de CO 2 pour mise en mémoire tampon des médias. A) Terrain illustrant l'effet de la hauteur de la poste, et la distance de diffusion ainsi l'oxygène entre la membrane et des cellules, sur le temps d'équilibrage et d'efficacité. Heights ont été établis par verre taillé messages liés au fond de l'appareil. Tous les trois tailles après des temps d'équilibrage rendement beaucoup améliorée au cours de la chambre hypoxique. Notez que le temps est sur une échelle logarithmique. B) Terrain dépeignant le temps d'équilibration rapide de l'oxygène de réponse du dispositif de 0,2 mm écart. C) multi-positions linescans ont également été prises à travers le bien sous le microcanal pour assurer l'homogénéité de la concentration d'oxygène introduite par le dispositif. Graphique représente la concentration d'oxygène mesurée après infusion de 0%, 10% et 21% d'oxygène pendant 10 min. D) Dispositif maintient efficacement l'oxygène de 10% sur 5 jours. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig3tmb.jpg" alt="Figure 3" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"></a> Figure 3. Expérimentation avec des dessins plus complexes d'oxygène microcanal. A) configuration double-condition à microcanaux rendements stables 0% et le profil de 21% d'oxygène de plus de 14 jours. B) Un motif interdigitées et sinueuses de 500 um de largeur microcanaux s'étendant à travers erésultats du pilier e dans un profil d'oxygène cycliques. Notez que les données représente un seul essai représentatif que l'alignement a été difficile à microcanaux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig5tmb.jpg" alt="Figure 4" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"></a> Figure 4. Timelapse images de 0 fermeture de la plaie, 7 et 17 heures après zéro initial. Les cellules ont été livrées en oxygène de 21% pendant toute la durée de l'expérience. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig6.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig6tmb.jpg" alt="Figure 5" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"></a> Figure 5. Effet de la concentration en oxygène sur le taux de cicatrisation dans un essai de zéro.

L&#39;appareil est fabriqué par la norme SU-8 photolithographie, moulage par réplique, et a défini la filature et fait entièrement de polydiméthylsiloxane. Le gaz est introduit dans le dispositif pour établir un gradient de concentration entre le pilier microcanaux et les milieux de culture, la conduite du système vers un équilibre de la concentration d&#39;oxygène désirée. Le dispositif a montré sa capacité à moduler l&#39;oxygénation temporelles et spatiales à l&#39;intérieur d&#39;un puits, ainsi que de moduler le comportement cellulaire appropriée. La structuration spatiale de l&#39;oxygénation est défini par le microcanal à la base du pilier, donc une variété de modèles pourraient être mis en œuvre dans l&#39;élaboration du photomasque. De plus, la perfusion du gaz désiré dans la phase gazeuse du puits est prévu pour améliorer le temps d&#39;équilibration et l&#39;étendue de l&#39;hypoxie. Un réseau microfluidique mélange pourrait être adapté à l&#39;appareil pour fournir un moyen de produire des mélanges de gaz roman de seulement quelques réservoirs de gaz de stock. Enfin, un mécanisme d&#39;échange de médias qui éliminerait la nécessité pour l&#39;enlèvement de l&#39;appareil de la plaque multipuits, dont les cellules peuvent réagir. L&#39;appareil a des applications dans toute expérimentation in vitro ou ex vivo nécessitant un contrôle plus la concentration en oxygène. Comme l&#39;oxygène est une variable importante physiologiques affectant une grande majorité des voies de signalisation, les domaines de recherche qui pourraient profiter est limitée par la créativité du chercheur. Certains champs qui pourraient bénéficier d&#39;un meilleur contrôle de la concentration en oxygène temporelle de comprendre les métastases du cancer, l&#39;apnée du sommeil, et les lésions de reperfusion cardiaques ischémie, parmi beaucoup d&#39;autres. Par exemple, l&#39;hypoxie intermittente a été corrélée avec des cancers plus envahissantes, upregulating un certain nombre de gènes associés à metastastis par rapport à l&#39;hypoxie continue et normoxie. Contrôle spatial est également important, comme les gradients d&#39;oxygène sont essentielles dans le développement, la zonation du foie, la toxicité des médicaments, et la niche de cellules souches. Le dispositif présenté dans cet article va bénéficier d&#39;un certain nombre de domaines de recherche en fournissant un système avec une plus petite empreinte de laboratoire, relativement simples exigences opérationnelles et de contrôle beaucoup plus grand sur l&#39;exposition d&#39;oxygène aux cellules.

<table><tbody><tr><td>PDMS-Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonde planaire FOXY</td><td>Ocean Optics</td><td>FOXY-SGS-M</td><td>Lame de microscope revêtue</td></tr><tr><td>Régulateur de gaz</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>FL-1472-G</td><td></td></tr><tr><td>Gaz</td><td>Airgas</td><td>Mélanges personnalisés</td><td>Tous contiennent 5 % CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>SU-8 2150</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance MDCK avec L-glutamine</td><td>SAFC Global</td><td>M3803</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Solution de L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication et fonctionnement d&#39;un insert d&#39;oxygène pour les adhérents des cultures cellulaires

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

L&#39;oxygène est un modulateur clé de nombreuses voies de signalisation cellulaire, mais les dispositifs actuels permettant<em&gt; In vitro</emModulation de l&#39;oxygène&gt; ne répondent pas aux besoins de la recherche biomédicale. La chambre hypoxique propose un système simple de contrôler l&#39;oxygénation dans des récipients de culture standard, mais manque de précision de contrôle temporel et spatial au cours de la concentration d&#39;oxygène à la surface des cellules, empêchant son application dans l&#39;étude d&#39;une variété de phénomènes physiologiques. D&#39;autres systèmes ont amélioré la chambre hypoxique, mais exigent des connaissances spécialisées et d&#39;équipements pour leur fonctionnement, ce qui les rend intimidant pour le chercheur en moyenne. Un insert microfabriqué des plaques multipuits a été développé pour contrôler plus efficacement la concentration en oxygène temporelle et spatiale des phénomènes physiologiques meilleur modèle trouvé<em&gt; In vivo</em&gt;. La plateforme se compose d&#39;un insert de polydiméthylsiloxane qui niche dans une plaque multipuits standards et sert de réseau de gaz microfluidique passive avec une membrane perméable au gaz visant à moduler l&#39;apport d&#39;oxygène aux cellules adhérentes. L&#39;appareil est simple à utiliser et est relié aux bouteilles de gaz qui fournissent la pression pour introduire la concentration d&#39;oxygène désirée dans la plate-forme. Fabrication implique une combinaison de standards SU-8 photolithographie, moulage par réplique, et défini PDMS filer sur une plaquette de silicium. Les composants de l&#39;appareil sont collés après un traitement de surface en utilisant un système de plasma à main. La validation est réalisée avec un capteur d&#39;oxygène fluorescentes planes. Temps d&#39;équilibrage est de l&#39;ordre de quelques minutes et une grande variété de profils d&#39;oxygène peuvent être atteints sur la base la conception de dispositifs, tels que le profil cyclique atteint dans cette étude, et même des gradients d&#39;oxygène pour imiter ceux trouvés<em&gt; In vivo</em&gt;. L&#39;appareil peut être stérilisés pour la culture cellulaire en utilisant des méthodes communes, sans perte de fonction. Le dispositif d&#39;application à l&#39;étude des<em&gt; In vitro</em&gt; Réponse de cicatrisation sera démontrée.

Fabrication et validation d&#39;une plate-forme de add-on qui offre un meilleur contrôle sur l&#39;oxygénation spatiale et temporelle dans une plaque à 6 puits. Le dispositif est adaptable à un certain nombre de systèmes de culture et peut être utilisé pour étudier les effets de l&#39;oxygène sur la cicatrisation des plaies.

Fabrication et fonctionnement d&#39;un insert d&#39;oxygène pour les adhérents des cultures cellulaires

L'oxygène est un modulateur clé de nombreuses voies cellulaires, mais les dispositifs actuels permettant la modulation de l'oxygène in vitro ne répondent pas aux besoins de la recherche biomédicale...

Le dispositif d'insertion hypoxique comporte six piliers qui s'emboîtent dans les puits d'une plaque à six puits. Le gaz circule à travers le réseau microfluidique situé à la base du pilier et peut diffuser à travers la membrane PDMS perméable aux gaz, qui sépare le réseau gazeux et le milieu de culture. Ce dispositif minimise la longueur du trajet de diffusion entre la source d'oxygène, le réseau microfluidique à la base du pilier et les cellules, permettant ainsi un équilibrage plus rapide de la concentration en oxygène.L'appareil permet également un contrôle beaucoup plus précis du motif spatial de l'oxygène auquel les cellules sont exposées, ce qui est déterminé par la conception du réseau gazeux microfluidique réalisée par photolithographie standard à l'aide de masques photographiques. Bonjour, je suis Sean Ard du laboratoire du Dr David Edington, du département de bioingénierie de l'Université de l'Illinois à Chicago. Bonjour, je suis Ellie, également du laboratoire Edington.Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment fabriquer, valider et utiliser un dispositif personnalisé permettant d'exposer des cultures cellulaires in vitro, dans une plaque à six puits, à différentes concentrations d'oxygène. Nous avons utilisé cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'effet de l'oxygène sur la cicatrisation, la production d'espèces réactives de l'oxygène et la migration cellulaire. Commençons donc.Pour commencer la fabrication de l'insert oxygénant, préparez du Polyméthyl Siloxane ou du PDMS selon un rapport de 10 à 1 entre le prépolymère et l'agent de réticulation. Conformément aux instructions du fabricant, le mélange de PDMS est ajouté à un moule en DELL usiné au préalable et gravé selon la forme d'une plaque de culture standard à six puits. Une fois polymérisé à 75 degrés Celsius pendant toute une nuit, le réseau de piliers moulé obtenu formera le premier des trois composants constituant l'insert oxygénant afin de fabriquer le deuxième composant essentiel de l'insert oxygénant.Un maître en SU-8 est préparé en centrifugant d'abord le SU-8 2150. Sur une tranche de silicium, un masque photolithographique est appliqué sur la tranche et le SU-8 est exposé aux UV à travers le masque photolithographique afin de créer un moule maître avec une épaisseur de microcanaux de 300 micromètres. Verser du PDMS sur le maître en SU-8 et polymériser pendant deux heures à 75 degrés Celsius pour obtenir un moule positif qui formera finalement les microcanaux à la base de chaque pilier.Le troisième composant du dispositif est fabriqué en déposant du PDMS sur une tranche de silicium par centrifugation à 500 tr/min pendant 10 secondes, suivie de 900 tr/min pendant 30 secondes, afin d'obtenir une membrane cérébrale d'une épaisseur de 100 micromètres. Étant donné que le PDMS est perméable aux gaz, l'oxygène peut être acheminé directement dans les microcanaux à travers cette membrane. Une fois tous les composants préparés, chaque surface de collage est soumise à un traitement au plasma d'oxygène pendant une minute.À l’aide d’un dispositif à plasma portatif, fixez d’abord les six composants des microcanaux sur le réseau de piliers, puis percez deux trous dans chaque pilier afin de les utiliser comme entrées et sorties de gaz. Enfin, fixez la membrane sur la partie inférieure du microcanal afin de faciliter l’assemblage et évacuer toute bulle d’air. Les surfaces traitées au plasma sont appuyées l’une contre l’autre pendant environ une minute à l’aide de l’extrémité plate d’une pince à épiler. Attendez une heure entre chaque étape d’assemblage afin de garantir que le dispositif soit complètement assemblé et puisse être étalonné.Une fois qu'un dispositif complet a été fabriqué, il est nécessaire d'étalonner le niveau d'oxygène reçu par les cellules lors de l'utilisation de l'insert oxygénant dans des expériences réelles. Pour l'étalonnage, utilisez un capteur fluorescent d'oxygène ou une lame Foxy, qui contient un revêtement de colorant ruthénium fluorescent atténué par l'oxygène. Les lames Foxy sont pré-découpées pour s'insérer au fond d'une plaque de six puits.La lame en « foxy » doit être découpée de manière à couvrir la plus grande partie possible de la surface du puits. Étant donné que la lame en « foxy » a une épaisseur d'environ un millimètre, modifiez le dispositif afin de maintenir la distance souhaitée pour une diffusion adéquate à travers la membrane.Cette distance dépend de l'expérience, mais dans la plupart des cas, elle doit être inférieure à un millimètre en utilisant le dispositif à plasma portatif pour découper une lame de microscope en verre d'un millimètre d'épaisseur. Fixez des supports d'environ six millimètres de longueur et de quatre millimètres de largeur sur le fond du dispositif. Le dispositif reposera sur les supports situés au-dessus de la lame découpée.Des lamelles en verre peuvent également être utilisées pour un intervalle de diffusion de 0,17 millimètre afin de valider la consommation d'oxygène. Ajouter trois millilitres d'eau déionisée à température ambiante dans les puits de la plaque à six puits où l'oxygène sera mesuré. Placer l'appareil dans la plaque et, à l'aide du logiciel Metamorph, sélectionner le nombre et l'emplacement des positions souhaitées sur le capteur Foxy.Faites glisser pour mesurer les concentrations d'oxygène. Connectez un tube de pistolet à gaz entre la bouteille de gaz d'oxygène et le dispositif d'insert hypoxique. Un régulateur de débit de précision réglé sur un débit de 50 à 100 millilitres par minute est utilisé pour un contrôle fin du gaz délivré.S'assurer que le régulateur de débit de précision est fermé. Ouvrir d'abord le régulateur supérieur du réservoir, puis le régulateur de précision. Réduire le débit à entre 10 et 20 par minute après 15 minutes.Pour éviter la formation de bulles dans l'eau, surveillez attentivement la valeur du débit au cours de l'heure suivante et effectuez des ajustements si nécessaire, car la chute de pression évoluera pendant l'équilibrage du système, modifiant ainsi le débit afin de capturer des images de la plaque et des capteurs Foxy. Un microscope Olympus IX 71 équipé de fluorescence, une caméra à couplage de charge de Q Imaging Tiga, SRV et un logiciel d'acquisition d'images Metamorpho sont utilisés. Le microscope est équipé d'un filtre fluorescent Olympus 3 1 0 2 0, compatible Foxy, avec une longueur d'onde d'excitation de 475 nanomètres et une longueur d'onde d'émission de 600 nanomètres.Pour tester le temps d'équilibration et le degré d'oxygénation du dispositif, choisissez trois points sur la lame foxy où mesurer la concentration en oxygène. Prenez une image de la lame immédiatement avant de commencer l'écoulement du gaz. Prenez des images à des intervalles de 10 secondes pendant 30 minutes, pendant que le gaz circule dans le dispositif, afin d'évaluer l'hétérogénéité et l'apport en oxygène.Établir plusieurs points à des intervalles d'un millimètre couvrant la largeur du canal et mesurer la concentration en oxygène à la surface du puits à l'aide de Metamorph. Exporter l'intensité moyenne de l'image pour chaque position et tracer la concentration d'oxygénation en fonction de l'intensité de fluorescence. Générer une courbe d'étalonnage en ajustant des courbes linéaires aux segments de 0 à 10 % et de 10 à 21 %, reliant l'intensité de fluorescence à la concentration en oxygène. Pour chaque position mesurée, les données brutes d'intensité peuvent être exportées depuis Metamorph et analysées ultérieurement à l'aide de Microsoft Excel ou d'un autre logiciel statistique.Une fois l'appareil calibré, des expériences telles que des tests de cicatrisation peuvent commencer : stériliser l'insert par autoclavage à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes, dans les 24 heures précédant l'expérience, et manipuler l'insert sous hotte de culture à flux laminaire afin d'éviter toute contamination ultérieure. Imbiber l'insert en PDMS stérilisé dans un milieu sans sérum pendant 24 heures afin d'éviter la formation de bulles de gaz lors de son insertion dans les puits de la plaque. Cultiver des cellules MDCK ou d'autres cellules adhérentes jusqu'à confluence complète dans une plaque de six puits, puis réaliser des rayures rectilignes dans les monocouches à l'aide d'une pipette P200. Ces rayures simulent des lésions dans la monocouche adhérente.Aspirez le milieu cellulaire sans perturber la monocouche et rincez avec cinq millilitres de milieu. Aspirez à nouveau et remplissez les puits avec trois millilitres de milieu sans sérum. Insérez délicatement l'appareil dans la plaque en veillant à éviter les bulles.Incliner l'appareil pendant l'insertion permet d'expulser les bulles par un côté. Veillez à ne pas exercer une pression excessive sur l'appareil, ce qui pourrait déformer suffisamment le PDMS pour écraser les cellules sous-jacentes. Placer la plaque et l'appareil sur une platine chauffée du microscope réglée à 37 degrés Celsius et raccorder les tubulures provenant du réservoir de gaz source aux orifices d'entrée et de sortie de l'appareil.L'incubateur de culture doit comporter un orifice permettant l'introduction d'un tube, et ce dernier doit être raccordé. Après avoir placé le dispositif dans l'incubateur, suivre la même procédure que précédemment décrite pour démarrer le flux de gaz, afin d'évaluer la cicatrisation. Capturer des images en prise de vue instantanée toutes les 20 minutes pendant 15 à 18 heures, à l'aide du matériel et du logiciel d'imagerie décrits précédemment. Un algorithme de mesure de la plaie peut être utilisé pour analyser la surface non cicatrisée après une durée expérimentale souhaitée. Arrêter le flux de gaz, retirer la plaque et poursuivre, si désiré, par un traitement supplémentaire des cellules. Le dispositif d'insertion hypoxique nécessite moins de deux minutes pour atteindre une stabilisation à 0,5 % d'oxygène, comme illustré ici.La taille de l'espace entre le fond du puits et la membrane du dispositif était un facteur déterminant pour l'efficacité d'équilibration, des espaces plus grands nécessitant davantage de temps pour atteindre des valeurs stables de concentration en oxygène. Le dispositif permet également un contrôle précis de l'oxygénation spatiale dans un puits unique, permettant la création de plusieurs conditions et même la génération d'un profil d'oxygène cyclique à la surface du puits. Des monocouches de cellules MDCK ont été exposées à 10 % ou 21 % d'oxygène et la surface de la blessure a été analysée au fil du temps à l'aide de l'algorithme MATLAB Ts d'analyse de migration cellulaire.Après 11 heures sur un total de 17 heures, 6,87 % de la plaie d'origine subsistait en présence de 10 % d'oxygène, contre 64,4 % de la plaie sous 21 %. Comme illustré ici, les concentrations en oxygène sont négativement corrélées à la surface ouverte de la plaie pour les deux concentrations d'oxygène. Pendant toute la durée de l'expérience, nous venons de vous montrer comment fabriquer, valider et utiliser le dispositif d'insertion hypoxique pour un test de cicatrisation de plaie par rayure. Ce dispositif présente plusieurs avantages par rapport à d'autres systèmes d'oxygénation, tels qu'une empreinte spatiale réduite en laboratoire et un contrôle bien plus précis de l'oxygénation spatiale et temporelle au niveau de la surface cellulaire.L'appareil peut être utilisé par pratiquement n'importe quel laboratoire étudiant l'effet de l'oxygène ou d'autres gaz comme le dioxyde de carbone sur des cultures cellulaires in vitro. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'imbiber l'appareil stérilisé et le milieu de culture toute la nuit, de minimiser la formation de bulles pendant l'expérience. En outre, il faut laisser le système s'équilibrer avant de commencer l'expérience.Cela s'explique par le fait que le débit varie lorsque la pression dans le système s'équilibre. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

fabrication-operation-an-oxygen-insert-for-adherent-cellular

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Une introduction à la technologie, le protocole et la manutention des navires HyperStack Corning et accessoires utilisés pour le rendement élevé de culture de cellules adhérentes. Le protocole va montrer comment utiliser le système fermé des navires pour la récolte de cellules augmente plus les produits actuels plaques empilées.

Fermé protocole Culture Cell System utilisant des navires HyperStack avec la technologie des matériaux perméables au gaz

Fermenteurs sont utilisés pour augmenter le rendement de la culture et la productivité des cellules transgéniques. Après le dépistage multiples microbiennes ou animales candidats de culture de cellules dans des flacons agités, la prochaine étape logique est d'augmenter la biomasse de la culture sélectionnée avec le fermenteur. Cette vidéo montre l'installation et le fonctionnement d'un système de bioréacteur de paillasse typique.

Fonctionnement d&#39;un bioréacteur de laboratoire

Le comportement fonctionnel des cellules en culture peut être améliorée par la mise en culture plus in vivo -comme des milieux de culture de 16-21 3 dimensions. Ce manuscrit décrit la mise en place et le fonctionnement d'un système de bioréacteur à fibres creuses pour vivo -comme mammifère culture de tissus dans.

Bioréacteurs à fibres creuses pour<em&gt; In Vivo</em&gt; -like Tissue Culture Mammifères

Dans les organismes multicellulaires, les facteurs solubles sécrétés provoquent des réponses de différents types de cellules à la suite de la signalisation paracrine. Les systèmes de co-culture d’inserts offrent un moyen simple d’évaluer les changements médiés par les facteurs solubles sécrétés en l’absence de contact cellule-cellule.

Développement d&#39;un système d&#39;insertion Co-culture de deux types cellulaires en l&#39;absence de Cell-Cell Contactez

Nous avons adapté un insert de membrane microporeuse perméable pour imiter le microenvironnement tumoral (TME). Le modèle consiste en une culture cellulaire mixte, permet la génération simplifiée de populations cellulaires individuelles hautement enrichies sans utiliser le marquage fluorescent ou le tri cellulaire, et permet d’étudier la communication intercellulaire au sein du TME dans des conditions normales ou de stress.

A Mimic du microenvironnement de la tumeur: Une méthode simple pour générer des populations de cellules enrichies et enquête intercellulaire Communication

Le contrôle des gradients chimiques et d’oxygène est essentiel pour les cultures cellulaires. Cet article fait état d’un dispositif microfluidique polydiméthylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) capable de générer de manière fiable des combinaisons de gradients chimiques et d’oxygène pour les études de migration cellulaire, qui peut être utilisé dans la pratique dans les laboratoires de biologie sans instrumentation sophistiquée.

Polydiméthylsiloxane-polycarbonate dispositifs microfluidiques pour cellulaire Migration Studies Sous Perpendiculaire chimique et Dégradés d&#39;oxygène

Nous présentons ici un protocole pour un ex vivo du poumon Cancer du modèle qui imite les étapes de la progression tumorale et contribue à isoler une tumeur primaire, diffuser les cellules tumorales et les lésions métastatiques.

Cellulaire et acellulaire poumon modèle pour étudier les métastases tumorales

Le protocole décrit la génération de sphéroïdes à haut débit pour la bio-impression à l’aide de l’analyse multiparamétrique de leur oxygénation et de leur mort cellulaire sur un microscope à fluorescence standard. Cette approche peut être appliquée pour contrôler la viabilité des sphéroïdes et effectuer une normalisation, ce qui est important dans la modélisation des tissus 3D, le microenvironnement tumoral et la biofabrication réussie des (micro)tissus.

Biofabrication assistée par microscopie à oxygène abordable de sphéroïdes multicellulaires

Dans cet article, un insert nouvellement conçu imprimé en 3D est présenté comme un modèle de co-culture et validé par l’étude de la communication intercellulaire paracrine entre les cellules endothéliales et les kératinocytes.

Un insert innovant imprimé en 3D conçu pour permettre des cultures cellulaires 2D et 3D simples

Nous présentons un nouvel appareil pour mesurer les taux de consommation d’oxygène (OCR) dans les cultures d’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). L’appareil peut mesurer l’OCR pendant des semaines sur des EPR cultivés sur des plaques de culture cellulaire standard avec des milieux standard pendant que les plaques sont dans un incubateur de culture cellulaire standard.

Suivi à long terme des taux de consommation d’oxygène dans des cultures épithéliales pigmentaires rétiniennes hautement différenciées et polarisées

Ce protocole présente une méthode de fabrication d’une puce microfluidique à double couche et d’analyse de la croissance microbienne sous des oscillations rapides de l’oxygène. Les performances de l’appareil ont été validées par la détection de l’oxygène dans les canaux fluides et la culture microbienne.

Création d’oscillations rapides de l’oxygène dans l’analyse de la croissance microbienne d’une cellule unique à l’aide d’un dispositif microfluidique à double couche

Découvrez la fabrication d'un insert hypoxique en PDMS pour contrôler l'oxygénation spatiale et temporelle des cultures cellulaires adhérentes. Cette méthode permet d'étudier les effets de l'oxygène sur la cicatrisation des plaies in vitro.

Fabrication et fonctionnement d'un insert d'oxygène pour les adhérents des cultures cellulaires

Explorer plus de vidéos