Fabrication et fonctionnement d'un insert d'oxygène pour les adhérents des cultures cellulaires

Le dispositif d'insertion hypoxique comporte six piliers qui s'emboîtent dans les puits d'une plaque à six puits. Le gaz circule à travers le réseau microfluidique situé à la base du pilier et peut diffuser à travers la membrane de PDMS perméable aux gaz, qui sépare le réseau gazeux et le milieu de culture. Ce dispositif minimise la longueur du trajet de diffusion entre la source d'oxygène, le réseau microfluidique à la base du pilier et les cellules, permettant ainsi un équilibrage plus rapide de la concentration en oxygène.

L'appareil permet également un contrôle beaucoup plus précis du motif spatial de l'oxygène auquel les cellules sont exposées, ce qui est déterminé par la conception du réseau gazeux microfluidique, réalisée par photolithographie standard à l'aide de masques photographiques. Salut, je suis Sean Ard du laboratoire du Dr David Edington, du département de bioingénierie de l'Université de l'Illinois à Chicago. Salut, je suis Ellie, également du laboratoire Edington.

Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment fabriquer, valider et utiliser un dispositif personnalisé permettant d'exposer des cultures cellulaires in vitro, dans une plaque à six puits, à différentes concentrations d'oxygène. Nous avons utilisé cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'effet de l'oxygène sur la cicatrisation, la production d'espèces réactives de l'oxygène et la migration cellulaire. Commençons donc.

Pour commencer la fabrication de l'insert oxygénant, préparez du Polyméthyl Siloxane ou du PDMS selon un rapport de 10 à 1 entre le prépolymère et l'agent de réticulation. Conformément aux instructions du fabricant, le mélange de PDMS est ajouté à un moule en Dallran usiné au préalable et structuré pour imiter la forme d'une plaque de culture standard à six puits. Une fois durci à 75 degrés Celsius pendant toute une nuit, le réseau de piliers moulé obtenu formera le premier des trois composants constituant l'insert oxygénant, dans le but de fabriquer le deuxième composant essentiel de l'insert oxygénant.

Un maître en SU-8 est préparé en centrifugant d'abord le SU-8 2150. Sur une tranche de silicium, un masque photolithographique est appliqué sur la tranche et le SU-8 est exposé aux UV à travers le masque photolithographique afin de créer un moule maître avec une épaisseur de microcanaux de 300 micromètres. Verser du PDMS sur le maître en SU-8 et polymériser pendant deux heures à 75 degrés Celsius pour obtenir un moule positif qui formera finalement les microcanaux au bas de chaque pilier.

Le troisième composant du dispositif est fabriqué en déposant du PDMS sur une tranche de silicium par centrifugation à 500 tr/min pendant 10 secondes, suivie de 900 tr/min pendant 30 secondes, afin d'obtenir une membrane cérébrale d'une épaisseur de 100 micromètres. Étant donné que le PDMS est perméable aux gaz, l'oxygène peut être acheminé directement dans les microcanaux à travers cette membrane. Une fois tous les composants préparés, chaque surface de collage est soumise à un traitement au plasma d'oxygène pendant une minute.

À l’aide d’un dispositif à plasma portatif, fixez d’abord les six composants des microcanaux sur le réseau de piliers, puis percez deux trous dans chaque pilier afin de les utiliser comme entrées et sorties de gaz. Enfin, fixez la membrane sur la face inférieure du microcanal afin de faciliter l’assemblage et évacuer toute bulle d’air. Les surfaces traitées au plasma sont appuyées l’une contre l’autre pendant environ une minute à l’aide de l’extrémité plate d’une pince à épiler ; attendez une heure entre chaque étape d’assemblage afin de garantir que le dispositif soit complètement assemblé et puisse être étalonné.

Une fois qu'un dispositif complet a été fabriqué, il est nécessaire d'étalonner le niveau d'oxygène reçu par les cellules lors de l'utilisation de l'insert oxygénant dans des expériences réelles. Pour l'étalonnage, utilisez un capteur d'oxygène fluorescent ou une lame Foxy, qui contient un revêtement de colorant ruthénium fluorescent atténué par l'oxygène. Les lames Foxy sont pré-découpées pour s'insérer au fond d'une plaque de six puits.

La lame en plastique souple doit être découpée de manière à couvrir la plus grande partie possible de la surface du puits. Étant donné que la lame en plastique souple a une épaisseur d'environ un millimètre, modifiez le dispositif afin de maintenir la distance souhaitée pour une diffusion adéquate à travers la membrane.

Cette distance dépend de l'expérience, mais dans la plupart des cas, elle doit être inférieure à un millimètre en utilisant le dispositif à plasma portable bond four pour couper une lame de microscope en verre d'un millimètre d'épaisseur. Fixez des supports d'environ six millimètres de longueur et de quatre millimètres de largeur sur le fond du dispositif. Le dispositif reposera sur les supports situés au-dessus de la lame découpée.

Des lamelles en verre peuvent également être utilisées pour un intervalle de diffusion de 0,17 millimètre afin de valider la consommation d'oxygène. Ajouter trois millilitres d'eau déionisée à température ambiante dans les puits de la plaque à six puits où l'oxygène sera mesuré. Placer l'appareil dans la plaque et, à l'aide du logiciel Metamorph, sélectionner le nombre et l'emplacement des positions souhaitées sur le capteur Foxy.

Faites glisser pour mesurer les concentrations d'oxygène. Connectez un tube de pistolet tai entre le réservoir de gaz d'oxygène et le dispositif d'insertion hypoxique. Un régulateur de débit de précision réglé sur un débit de 50 à 100 millilitres par minute est utilisé pour un contrôle fin du gaz délivré.

S'assurer que le régulateur de débit de précision est fermé. Ouvrir d'abord le régulateur du haut du réservoir, puis le régulateur de précision. Réduire le débit entre 10 et 20 par minute après 15 minutes.

Pour éviter la formation de bulles dans l'eau, surveillez attentivement la valeur du débit au cours de l'heure suivante et effectuez des ajustements si nécessaire, car la chute de pression évoluera pendant l'équilibrage du système, modifiant ainsi le débit afin de capturer des images de la plaque et des capteurs Foxy. Un microscope Olympus IX 71 équipé de fluorescence, une caméra à couplage de charge de Q Imaging Tiga, SRV et un logiciel d'acquisition d'images Metamorpho sont utilisés. Le microscope est équipé d'un filtre fluorescent Olympus 3 1 0 2 0, compatible Foxy, avec une longueur d'onde d'excitation de 475 nanomètres et une longueur d'onde d'émission de 600 nanomètres.

Pour tester le temps d'équilibration et le degré d'oxygénation du dispositif, choisissez trois points sur la lame foxy où mesurer la concentration en oxygène. Prenez une image de la lame immédiatement avant de commencer l'écoulement du gaz. Prenez des images à des intervalles de 10 secondes pendant 30 minutes, pendant que le gaz circule dans le dispositif, afin d'évaluer l'hétérogénéité et l'apport en oxygène.

Établir plusieurs points à des intervalles d'un millimètre couvrant la largeur du canal et mesurer la concentration en oxygène à la surface du puits à l'aide de Metamorph. Exporter l'intensité moyenne de l'image pour chaque position et tracer la concentration d'oxygénation en fonction de l'intensité de fluorescence. Générer une courbe d'étalonnage en ajustant des courbes linéaires aux segments de 0 à 10 % et de 10 à 21 %, reliant l'intensité de fluorescence à la concentration en oxygène. Pour chaque position mesurée, les données brutes d'intensité peuvent être exportées depuis Metamorph et analysées ultérieurement à l'aide de Microsoft Excel ou d'un autre logiciel statistique.

Une fois que le dispositif a été étalonné, des expériences telles que des tests de cicatrisation peuvent commencer : stériliser l'insert étalonné à l'autoclave à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes, au plus tard 24 heures avant l'expérience, et manipuler l'insert sous hotte de culture à flux laminaire afin d'éviter toute contamination ultérieure. Imbiber l'insert en PDMS stérilisé dans un milieu sans sérum pendant 24 heures afin d'éviter la formation de bulles de gaz lors de son insertion dans les puits de la plaque. Cultiver des cellules MDCK ou d'autres cellules adhérentes jusqu'à confluence complète dans une plaque à six puits, puis réaliser des rayures rectilignes dans les monocouches à l'aide d'une pipette P200. Ces rayures simulent des lésions dans la monocouche adhérente.

Aspirez le milieu cellulaire sans perturber la monocouche et rincez avec cinq millilitres de milieu. Aspirez à nouveau et remplissez les puits avec trois millilitres de milieu sans sérum. Insérez délicatement l'appareil dans la plaque en veillant à éviter les bulles.

Incliner l'appareil pendant l'insertion permet d'expulser les bulles par un côté. Veillez à ne pas exercer une pression excessive sur l'appareil, ce qui pourrait déformer suffisamment le PDMS pour écraser les cellules sous-jacentes. Placer la plaque et l'appareil sur une platine chauffée du microscope réglée à 37 degrés Celsius et raccorder les tubulures provenant du réservoir de gaz source aux orifices d'entrée et de sortie de l'appareil.

L'incubateur de culture doit comporter un orifice permettant l'introduction du tube, et ce dernier doit être raccordé. Après avoir placé l'appareil dans l'incubateur, suivre la même procédure que précédemment décrite pour démarrer l'écoulement du gaz, afin d'évaluer la cicatrisation, capturer des images en prise de vue instantanée toutes les 20 minutes pendant 15 à 18 heures, à l'aide du matériel et des logiciels d'imagerie décrits précédemment. Un algorithme de mesure de la plaie peut être utilisé pour analyser la surface non cicatrisée après une durée expérimentale souhaitée. Arrêter l'écoulement du gaz, retirer la plaque et poursuivre le traitement supplémentaire des cellules si désiré. Le dispositif d'insertion hypoxique nécessite moins de deux minutes pour atteindre une stabilisation à 0,5 % d'oxygène, comme indiqué ici.

La taille de l'espace entre le fond du puits et la membrane du dispositif était un facteur déterminant pour l'efficacité d'équilibration, des espaces plus grands nécessitant davantage de temps pour atteindre des valeurs stables de concentration en oxygène. Le dispositif permet également un contrôle précis de l'oxygénation spatiale dans un même puits, permettant la création de plusieurs conditions et même la génération d'un profil d'oxygène cyclique à la surface du puits. Des monocouches de cellules MDCK ont été exposées à 10 % ou 21 % d'oxygène et la surface de la lésion a été analysée au fil du temps à l'aide de l'algorithme MATLAB Ts d'analyse de migration cellulaire après blessure.

Après 11 heures sur un total de 17 heures, 6,87 % de la plaie initiale subsistait en présence de 10 % d'oxygène, contre 64,4 % de la plaie sous 21 % d'oxygène. Comme illustré ici, les concentrations en oxygène sont négativement corrélées à la surface ouverte de la plaie pour les deux concentrations d'oxygène. Pendant toute la durée de l'expérience, nous venons de vous montrer comment fabriquer, valider et utiliser le dispositif à insert hypoxique pour un test de cicatrisation de plaie par rayure. Ce dispositif présente plusieurs avantages par rapport à d'autres systèmes d'oxygénation, tels qu'une empreinte spatiale réduite en laboratoire et un contrôle bien plus précis de l'oxygénation spatiale et temporelle au niveau de la surface cellulaire.

L'appareil peut être utilisé par pratiquement n'importe quel laboratoire étudiant l'effet de l'oxygène ou d'autres gaz comme le dioxyde de carbone sur des cultures cellulaires in vitro. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'imbiber l'appareil stérilisé et le milieu de culture toute la nuit, de minimiser la formation de bulles pendant l'expérience. En outre, il faut laisser le système s'équilibrer avant de commencer l'expérience.

Cela s'explique par le fait que le débit varie lorsque la pression dans le système s'équilibre. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.