Quantitative PCR en temps réel utilisant le Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Dans cet article vidéo, la PCR en temps réel est démontrée à l'aide des tests Solaris QPCR. Les tests Solaris QPCR sont des réparations spécifiques aux gènes composées d'oligonucléotides sondes et amorces, conçues pour détecter toutes les variantes d'épissage connues d'un gène donné. Dans des conditions universelles de thermocyclage, la sonde Solaris possède un fixateur du sillon mineur, un groupement et un marqueur FA à l'extrémité cinq prime, ainsi qu'un inhibiteur sombre éclipsé à l'extrémité trois prime.

Pendant l'étape de dénaturation de la PCR en temps réel, la sonde reste en solution et la fluorescence du marqueur FAM est inhibée. Pendant les phases d'hybridation et d'extension, les amorces de la sonde se lient à la séquence cible et l'inhibiteur est séparé du FAM. Le FAM émet alors un signal fluorescent intense ; lorsque la sonde se dissocie, la fluorescence est de nouveau inhibée.

Des résultats de PCR en temps réel sont obtenus, démontrant la sensibilité, la spécificité et la reproductibilité de cet essai efficace. Bonjour, je suis James Covino, membre de l'équipe de recherche et développement de Thermo Fisher Scientific à Lafayette, dans le Colorado. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de préparer une réaction QPCR standard à l'aide des réactifs d'expression génique Lars QPCR.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l’extinction de gènes ciblés à l’aide de technologies d’interférence par ARN. Commençons donc. Le test Solaris QPCR assay STEM se distingue par un algorithme unique qui exploite les technologies MGB et super base, offrant un test unique et pratique pour 98 % des gènes annotés chez l’homme et la souris.

En général, la conception des sondes et des amorces d'ADN est limitée par la température de fusion de la sonde, qui dépend du nombre et du type de bases. Les séquences plus longues et les séquences riches en GC présentent des températures de fusion plus élevées. La partie liante du sillon mineur utilisée dans les sondes Solaris s'insère dans le sillon mineur de l'hélice d'ADN et stabilise l'interaction entre la sonde et la séquence cible.

Cela augmente la température de fusion, permettant l'utilisation de sondes plus courtes. L'algorithme Solaris incorpore également de manière sélective des nucléotides modifiés appelés super bases afin d'améliorer la stabilité des liaisons AT et d'éliminer l'association autonome GG dans les séquences riches en guanines. Cela permet d'utiliser des séquences cibles qui seraient autrement évitées.

La flexibilité accrue des séquences offerte par l'utilisation de ces technologies permet la conception de jeux d'amorces et de sondes reconnaissant toutes les variantes d'épissage connues d'un seul gène. Notez que, chaque fois que possible, des régions chevauchant les jonctions d'exons ont été intégrées dans le site cible afin d'augmenter la spécificité en évitant l'amplification de l'ADN génomique contaminant. Les jeux d'amorces et de sondes obtenus sont analysés par BLAST à l'aide de trois bases de données différentes — génomique, transcript et pseudogène — afin de garantir leur spécificité. En outre, les jeux d'amorces et de sondes Solaris ont été entièrement optimisés de sorte que les conditions de cyclage soient identiques pour tous les tests de PCR quantitative, ce qui permet d'évaluer l'expression de divers transcrits lors d'un même cycle de PCR.

Pour commencer à planifier l'expérience de R-PCR quantitative, identifiez les réactifs nécessaires pour réaliser la PCR quantitative du gène d'intérêt à l’aide de la recherche de produits Genius, accessible à l’adresse thermo.com/solaris. Cliquez dans la zone de recherche et sélectionnez l’organisme cible approprié. La recherche de produits Genius peut traiter de nombreux types d’identifiants génétiques. Ici.

Saisissez l'un des termes de recherche suggérés pour le gène d'intérêt, puis cliquez sur « Rechercher », identifiez le gène d'intérêt et cliquez sur « Sélectionner » sur le côté gauche. Une fenêtre s'ouvrira, affichant les différents réactifs disponibles pour le gène d'intérêt. Cliquez sur l'onglet détection QPCR sous le test d'expression génique Solaris.

Un dosage optimal de sondes et d'amorces Solaris est affiché. Ce dosage unique permettra de détecter toutes les variantes d'épissage connues du gène d'intérêt. Une fois l'amorce appropriée identifiée, recherchez le cyclateur QPCR qui sera utilisé dans le menu et identifiez le mélange maître compatible, soit le mélange maître avec un flacon séparé de colorant passif de référence rocks, le mélange rocks, ou le mélange à faible teneur en rocks.

Ici, nous utiliserons le Light Cycler 480 de Roche, donc le mélange maître plus le flacon de rock sera utilisé. Il est également important de s'assurer qu'un gène de référence approprié est inclus dans l'étude. La B2M sera utilisée une fois que tous les réactifs Solaris QP CR auront été reçus.

Ils doivent être conservés à moins 20 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation. Les réactifs sont stables pendant au moins 12 mois. Il faut éviter les cycles répétés de congélation-décongélation.

Préparez l'ADNc pour la qPCR en effectuant des réactions de transcription inverse sur l'ARN échantillon. Une fois l'ADNc préparé, décongelez l'analyse Solaris et le mélange maître sur de la glace. Le mélange maître contient tous les composants nécessaires à la PCR quantitative, à l'exception de l'analyse spécifique du gène et du composant matrice ; il comprend le thermostat, l'ADN polymérase dn, et les TPS rocks.

Si l'appareil de QPCR nécessite des pierres et un tampon de réaction propriétaire contenant un colorant bleu interne, prévoyez également de l'eau de qualité PCR et des plaques de QPCR. Une fois les solutions décongelées, mélangez-les en les agitant légèrement, puis centrifugez-les brièvement pour éviter toute perte de réactif. Ensuite, dans un tube de 15 millilitres, préparez un mix maître de dosage Solaris QPCR à une concentration x.

En combinant, pour le nombre souhaité d'échantillons à analyser dans une plaque de 384 puits, cinq microlitres de mix maître 2x, 0,5 microlitre de réactif Solaris 20x et de l'eau de qualité PCR afin que le volume final dans chaque puits soit de 10 microlitres. Une fois l'ADNc ajouté, veillez à préparer suffisamment de mix pour trois réplicats de chaque échantillon, y compris un témoin sans matrice (NTC) et un témoin sans transcriptase inverse (sans RT), afin de vérifier respectivement la contamination des réactifs ou la présence d'ADN génomique contaminant. Ensuite, transférez le mélange dans un réservoir stérile.

Ensuite, à l’aide d’une pipette multipuits, transférez le volume approprié du mix maître 1x dans les puits correspondants de la plaque PCR. Si des plaques blanches sont utilisées, le colorant bleu inclus dans le mix maître facilitera le suivi de l’avancement de la pipette. Plusieurs bibliothèques d’ADNc et gènes de référence peuvent être analysées sur la même plaque, puisque toutes les conditions de cyclage sont identiques.

Une fois le mélange maître 1 x ajouté aux puits appropriés, ajoutez le modèle d'ADN dilué dans chaque puits afin que le volume final soit de 10 microlitres ; pipetez plusieurs fois vers le haut et vers le bas pour homogénéiser. Scellez la plaque avec un film adhésif ou un scellage thermique, comme illustré ici.

Placer la plaque dans une centrifugeuse et effectuer une courte centrifugation afin de faire descendre les réactifs au fond des puits et éliminer les bulles d'air qui pourraient interférer avec les mesures de fluorescence. Le thermocycleur doit activer la polymérase à démarrage chaud présente dans le mélange maître Solaris QPCR à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes, un cycle, puis réaliser 40 cycles de dénaturation à 95 degrés Celsius pendant 15 secondes, suivis d'une extension à 60 degrés Celsius pendant 60 secondes. Ce protocole est identique pour tous les tests Soliris QPCR, quelle que soit la séquence génique amplifiée.

Enfin, placez la plaque dans l'appareil de PCRq et démarrez le programme. Cette figure illustre la haute performance des tests Solaris : 10 dilutions décimales d'ADN synthétique ou d'ADNc ont été amplifiées à l'aide des tests d'expression génique Solaris PCRq pour CDC 20 et F two RL one. Les courbes d'amplification et les courbes standards en échelle logarithmique pour des dilutions log₁₀ montrent la haute performance du test, même à de faibles concentrations d'entrée.

Les performances de chaque test sont mesurées par l'efficacité, la valeur du carré du domaine dynamique sur 10, les dilutions logarithmiques en base 10 et la limite inférieure de détection. Les données présentées ici démontrent la reproductibilité des tests Solaris. Ici, des aliquotes d'ADNc ont été amplifiées dans deux laboratoires situés dans des régions géographiques distinctes à l'aide des tests d'expression génique Solaris QPCR et du mélange maître.

Les mêmes niveaux d'expression ont été calculés pour deux gènes cibles dans les deux laboratoires. Nous venons de vous montrer comment préparer une réaction de QPCR standard à l'aide des réactifs Solaris pour l'expression génique. Lors de la réalisation de cette expérience, il est important de se rappeler de préparer des mélanges maîtres avec la concentration finale correcte des réactifs et d'inclure des réplicats biologiques et/ou techniques appropriés.

En outre, il est impératif de configurer l'appareil de PCR quantitative avec les conditions de thermocyclage appropriées pour Solaris. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.