Name: Quantitative PCR en temps réel utilisant le Thermo Scientific Solaris qPCR Assay (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-17T17:04:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Découvrez la PCR quantitative en temps réel avec les kits Solaris pour l'analyse d'expression génique. Cette méthode détecte toutes les variantes d'épissage connues avec une grande spécificité et reproductibilité.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Le Thermo Scientific Solaris qPCR algorithme de conception de dosage <ol><li> L'algorithme utilisé dans la conception de Solaris qPCR sonde / amorce paires ajuste la Tm de chaque composant ainsi des conditions favorables à vélo universels. Incorporation de la MGB, ou la reliure petit sillon, fraction de la sonde augmente la Tm et permet de sondes plus courtes pour être conçus pour une plus grande souplesse d'analyse et de performance. Comme leur nom l'indique, BTP sont une classe d'antibiotiques qui peuvent s'insérer dans le petit sillon de la double hélice d'ADN. BTP sont fixés à l'extrémité 3 ou 5 d'une sonde d'ADN. En solution, la fluorescence du reporter FAM de la sonde est trempée par Eclipse Quencher foncé. Lorsque la sonde se lie à une séquence cible, le changement résultant dans 3-D de la sonde s conformation permet à un signal fluorescent intense. La liaison de la sonde d'ADN à séquence cible est stabilisée par le MGB, qui permet l'utilisation de sondes très spécifiques, plus courts, tout en maintenant la température de fusion appropriéepour la PCR. Ainsi, la détection du signal se produit pendant la phase de recuit de l'amplification de cible. Au cours de l'étape d'extension, la sonde MGB dissocie et la fluorescence est de nouveau arrêtée. Parce que la sonde se dissocie, elle n'affecte pas l'efficacité de PCR. </li><li> Une autre caractéristique de l'algorithme de Solaris est l'utilisation de superbases. Superbases sont des bases modifiées qui ont amélioré les capacités de liaison pour améliorer la stabilité des liaisons AT et éliminer GG auto-association de séquences riches en guanine. En outre, ils n'ont pas étancher fluorophores adjacents attachés à l'extrémité 5. Ces bases sont placés de manière sélective, en fonction de l'algorithme, pour accroître la disponibilité de séquences cibles. Il est ainsi possible d'utiliser des séquences, telles que les régions riches en GC, qui autrement seraient évités dans la conception des amorces et des sondes. </li><li> Chaque fois que possible, l'algorithme de Solaris intègre jonction exon couvrant les régions dans le site cible. Cette spécificité augmente en évitant l'amplification of ADN génomique contaminant. </li><li> Surtout, l'algorithme identifie également une séquence consensus pour tous les variants d'épissage connus, tels que tous sont couverts par une seule sonde / amorce ensemble. Donc, un seul test est nécessaire pour un gène d'intérêt particulier. </li><li> Enfin, l'algorithme Solaris qPCR conception test utilise des paramètres très stricts pour des considérations de conception critiques, y compris la teneur en GC, longueur, Tm, et s'étend de nucléotides homogènes. Les séquences obtenues sont analysées pour BLAST spécificité en utilisant 3 bases de données différentes: génomique, la transcription, et pseudogène. </li></ol> 2. L'obtention de réactifs Solaris <ol><li> Pour obtenir les réactifs Solaris appropriée, visitez <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / solaris</a> </li><li> Une fois sur le site cliquez sur "Recherche produit GENEius". Pour aller directement à la recherche de produits GENEius, allez à <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">l'adresse www.thermo.com / Solaris</a>Rechercher </li><li> Cliquez dans la zone de recherche, et choisissez l'organisme cible appropriée. </li><li> La recherche de produits GENEius peut traiter de nombreux identificateurs de gènes différents. Ici, entrez l'un des termes de recherche suggérés pour trouver le gène d'intérêt, y compris Ref Seq adhésion, l'ID de Gene, le symbole Gene, une description de Gene, l'ID de Sanger ou le numéro d'accession, ou un numéro de catalogue. Puis, cliquez sur "Recherche". </li><li> Identifier le gène d'intérêt et cliquez sur "Select" sur le côté gauche. Cela va ouvrir une fenêtre qui affiche les différents produits Thermo Scientific disponibles pour le gène d'intérêt. Sous la rubrique «Produits» sélectionnez l'option "Détection qPCR" Tab. </li><li> Dans le cadre du "test Solaris Gene Expression» en-tête, vous verrez une conception optimale Solaris sonde / test primaire. Ce test on va couvrir tous les variants d'épissage connus de votre gène cible. Choisissez la quantité désirée. Ils sont disponibles en 100, 200, 400 et 1000 X 25 pi de réactions (comme si ledire est identifié comme étant faite sur commande, la taille paquet de 100 ne seront pas disponibles). Cliquez sur "Ajouter au panier". </li><li> Ensuite, sélectionnez le master mix approprié pour le thermocycleur qui sera utilisé. Pour déterminer quel master mix qui fonctionnera le mieux avec la machine disponible, cliquez sur «En savoir Mix Master qui fonctionne le mieux avec votre Cycler PCR!" </li><li> Trouvez le cycleur qPCR qui sera utilisé dans le menu afin de déterminer qui se mélangent à utiliser. </li><li> Revenez à la fenêtre de recherche de produits GENEius, et sélectionnez le master mix approprié. Le master mix est disponible en 100, 200, 400, et 1000 tailles réaction. Cliquez sur "Ajouter au panier". </li><li> Gènes de référence proposées et des kits verso de synthèse d'ADNc peut également être ordonnée pour une complète qRT-PCR. </li><li> Lorsque les réactifs Solaris qPCR arrivent, les stocker à -20 ° C jusqu'à utilisation. Les réactifs suivants doivent être reçues: Une solution 20X contenant deux amorces fournies à 800 nm chacune et une sonde d'un gène spécifique prévu à 200 nm, SequInformations référence pour la sonde et les amorces, et Solaris Gene Expression qPCR Master Mix 2X à une concentration. Solaris analyses qPCR l'expression des gènes sont stables pendant une durée minimale de 12 mois. Eviter les congélations répétées décongélation. </li></ol> 3. configuration qPCR <ol><li> Commencer le protocole qPCR avec l'ADNc. L'ARN total doit être extrait à l'aide d'une méthode de la colonne. Le Thermo Scientific kit de synthèse d'ADNc Verso est recommandé pour la transcription inverse pour produire l'ADNc. </li><li> Préparez-vous pour qPCR par la fonte des amorces, des sondes, et le mélange maître sur la glace. Également avoir sous la main l'eau de qualité PCR et qPCR blanches opaques plaques, ce qui peut améliorer la sensibilité de la PCR en temps réel. </li><li> Le mélange maître contient tous les composants pour PCR en temps réel, notamment: 1) l'ADN polymérase Thermo-Start, une version de démarrage à chaud de l'ADN polymérase Thermoprime. Ce type de polymérase est utilisé pour prévenir une amplification non spécifique au cours de la réaction permet de configurer et nécessite étape d'activation à 95 ° C15 min. 2) dans le mélange dNTP Solaris Maître, dTTP remplace dUTP pour maximiser l'efficacité d'amplification 3) tampon de réaction exclusif, optimisé pour fonctionner avec Solaris amorce / sonde essais. Ce tampon de réaction contient un colorant bleu pour augmenter le contraste entre le réactif et le plastique. 4) ROX, si votre instrument qPCR nécessite ROX. </li><li> Une fois que les solutions sont décongelés, mélanger en tapotant le tube (ne pas vortexer). Isoler les pour éviter la perte de réactif. </li><li> Ensuite, préparez un tube de 15 ml Falcon stérile pour mettre en place le mélange réactionnel pour le gène d'intérêt, plus un pour le gène de référence, l'intensification en fonction du nombre d'échantillons. Préparez suffisamment de telle sorte que trois répétitions peuvent être préparés pour chaque échantillon, y compris un contrôle de modèle non (NTC) et échantillons de courbe standard, si la méthode de la courbe standard sera utilisé pour l'analyse. </li><li> Pour chaque échantillon de fonctionner sur une plaque de 96 puits, mélanger le suivant: 5 pi de la 2X Solaris qPCR Master Mix, .5 pi de la version Solaris amorce / sonde set (20X), Et l'eau de qualité PCR de telle sorte que le volume final de réaction, une fois l'ADNc est ajoutée sera de 25 ul. Pour chaque échantillon de fonctionner sur une plaque de 384 puits mélanger la suivante: 12,5 ul de la 2X Solaris qPCR Master Mix, 1,25 pl de la version Solaris amorce / sonde set (20X) et la PCR eau de qualité telle que le volume de réaction final, une fois l'ADNc est ajoutée sera de 10 ul. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, transférer le mélange-maître dans les puits appropriés de la plaque. Le colorant bleu inclus dans le mélange maître faciliter le suivi des progrès de pipetage sur les plaques blanches. Ensuite, ajoutez le modèle de 1-5 ul d'ADNc (pour une plaque de 96 puits) ou 1-2 pi de matrice d'ADNc (pour une plaque 384 puits). Introduire à la pipette de haut en bas pour mélanger. Placer la plaque dans une centrifugeuse et centrifuger pour éliminer les bulles, car elles vont interférer avec les lectures de fluorescence. </li><li> Programmer le thermocycleur: L'enzyme doit être activé avec un 95 ° C 15 min (1 cycle). Puis 40 cycles de 95 ° C, la dénaturation pendant 15 secondes, et unenealing et extension à 60 ° C pendant 60 secondes. </li><li> Placer la plaque dans l'instrument qPCR. Démarrez le programme. </li></ol> Représentatifs des résultats de qPCR utilisant Solaris <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Dosages Solaris donner une détection fiable même à des concentrations très faibles d'entrée, à en juger par l'efficacité de la PCR et les valeurs de r2. Dix à 10 dilutions d'ADNc synthétisés à partir de la séquence amplicon d'ARN synthétique ou une séquence amplicon d'ADN a été amplifié sur un instrument ABI 7900HT l'utilisation de Solaris qPCR Gene Expression Assay pour F2RL1 ou Cdc20, respectivement. Les courbes d'amplification log-échelle et des courbes standard sont représentées avec la performance de chaque test, y compris l'efficacité, la valeur r2, la plage dynamique sur 10 log10 dilutions, et la limite inférieure de détection. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure2. Essais Solaris donner des résultats cohérents, même entre les différents chercheurs et des laboratoires. siRNA ciblant ALDOA et PPIB, ainsi que d'un contrôle de non-ciblage (NTC), ont été transfectés dans des cellules HeLa à nM 100, 10, 1 et 0,1 concentrations finales. Les cellules ont été récoltées et l'ARN total isolé 48 heures après le traitement. L'ADNc a été synthétisé en utilisant Thermo Scientific Kit de synthèse d'ADNc Verso. Une aliquote de l'ADNc a été amplifié dans deux laboratoires géographiquement séparés à l'aide de Solaris analyses qPCR l'expression des gènes pour la détection de ALDOA, PPIB, et GAPDH sur LightCycler Roche 480 (384 puits) plate-forme. Knockdown a été calculé selon la méthode ΔΔCq (normalisée par rapport à la GAPDH gène de référence et NTC cellules traitées). Les mêmes niveaux de knockdown ont été démontrées pour les deux cibles génétiques entre les chercheurs des deux sites.

Les auteurs de cet article sont des employés de Thermo Scientific.

Thermo Scientific Solaris analyses qPCR fournir une méthode simple et amélioré pour la réalisation d&#39;analyses qPCR. L&#39;utilisation d&#39;un algorithme de haute stringence, incorporant la technologie et MGB superbases, ces amorces et sonde fixe maximiser la fidélité et la robustesse des expériences de qPCR. Une amorce et un ensemble de sonde reconnaît tous les variants d&#39;épissage connus d&#39;un gène donné. Le site cible, chaque fois que possible, comprend les régions d&#39;exons couvrant, pour veiller à ce que l&#39;ADN génomique n&#39;est pas amplifié. Ces caractéristiques permettent d&#39;exécuter simultanément de nombreux échantillons, ce qui réduit considérablement la quantité de temps nécessaire pour effectuer des expériences complexes. Depuis le master mix est bleu, il est possible d&#39;utiliser des plaques opaques blanches, qui améliorent la sensibilité de la PCR quantitative, sans perdre de pipetage. Pris dans leur ensemble, les caractéristiques de conception de l&#39;essai qPCR Solaris faire de ce roman qPCR un test simple, mais de haute performance qui est à la fois spécifique et robuste.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif / matériau </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Solaris APCR Gene Expression ROX Master Mix (Intro Pack Size) </td><td> Thermo </td><td> <a href="http://www.dharmacon.com/catalog/catalogitemtemplate.aspx?id=4064&amp;imageid=4062" target="_blank">AB-4351/INT</a> </td><td> 100 x 25 uL rxns </td></tr><tr><td> Solaris qPCR Gene Expression ROX Mix Master </td><td> Thermo </td><td> <a href="http://www.dharmacon.com/catalog/catalogitemtemplate.aspx?id=4064&amp;imageid=4062" target="_blank">AB-4351 / A</a> </td><td> 200 x 25 uL rxns </td></tr><tr><td> Solaris qPCR Gene Expression ROX Mix Master </td><td> Thermo </td><td> <a href="http://www.dharmacon.com/catalog/catalogitemtemplate.aspx?id=4064&amp;imageid=4062" target="_blank">AB-4351 / B</a> </td><td> 400x 25 uL rxns </td></tr><tr><td> Solaris qPCR Gene Expression ROX Mix Master </td><td> Thermo </td><td> <a href="http://www.dharmacon.com/catalog/catalogitemtemplate.aspx?id=4064&amp;imageid=4062" target="_blank">AB-4351 / C</a> </td><td> 1000 x 25 uL rxns </td></tr><tr><td> Solaris analyses qPCR l&#39;expression des gènes </td><td> Thermo </td><td> AX-XXXXXX-XX-XXXX * </td><td> 100 rxns (1 x 125 pi) 200 rxns (2 x 125 pi) 400 rxns (4 x 125 pi) ou 1000 rxns (10 x 125 pi) </td></tr><tr><td> Kit de synthèse d&#39;ADNc Verso </td><td> Thermo </td><td> <a href="http://www.dharmacon.com/product/productlandingtemplate.aspx?id=1177" target="_blank">AB-1453 / A</a> <a href="http://www.dharmacon.com/product/productlandingtemplate.aspx?id=1177" target="_blank">AB-1453 / B</a> </td><td> 40 x 20 uL rxns 100 x 20 uL rxns </td></tr><tr><td> ABgene plaque de 96 puits (jupe, P Bas<html> rofil, Blanc) ** </td><td> Thermo </td><td> <a href="http://www.dharmacon.com/Product/ProductLandingTemplate.aspx?id=2084" target="_blank">AB-0800 / W</a> </td><td> 25 plaques </td></tr><tr><td> ABgene Diamond Ultra 384-Eh bien PCR Plate, blanc ** </td><td> Thermo </td><td> <a href="http://www.dharmacon.com/Product/ProductLandingTemplate.aspx?id=2166" target="_blank">AB-2150 / W</a> </td><td> 25 plaques </td></tr><tr><td> Absolute qPCR adhésif Seal </td><td> Thermo </td><td> <a href="http://www.dharmacon.com/Product/ProductLandingTemplate.aspx?id=2008" target="_blank">AB-1170</a> </td><td> 50 feuilles </td></tr></tbody></table> * Numéro de catalogue spécifique du produit. S&#39;il vous plaît se référer à <a href="http://www.thermo.com/solaris" target="_blank">www.thermo.com / solaris</a> pour sélectionner le dosage approprié ** Pour les choix de compatibilité et de la couleur cycleur, consultez notre catalogue lates ou visitezmo.com / pcrplastics &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.thermo.com / pcrplastics

quantitative pcr en temps réel utilisant le thermo scientific solaris qpcr assay

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Le test Solaris qPCR l&#39;expression des gènes est un nouveau type d&#39;amorce / sonde, conçue pour simplifier le processus de qPCR tout en conservant la sensibilité et la précision du dosage. Ces ensembles d&#39;amorces / sonde sont pré-conçue pour&gt; 98% des génomes de l&#39;homme et de la souris et améliorations de fonctionnalités importantes de technologies déjà disponibles. Ces améliorations ont été rendues possibles grâce à un algorithme de conception nouvelle, développée par des experts en bioinformatique Thermo Scientific. Plusieurs fonctionnalités pratiques ont été intégrées dans le test Solaris qPCR pour rationaliser le processus d&#39;exécution quantitative PCR en temps réel. Tout d&#39;abord, le protocole est similaire aux alternatives couramment employées, de sorte que les méthodes utilisées lors de qPCR sont susceptibles d&#39;être familiers. Deuxièmement, le mélange maître est bleu, ce qui rend l&#39;établissement des réactions qPCR plus facile à suivre. Troisièmement, les conditions de cyclage thermique sont les mêmes pour tous les tests (gènes), ce qui permet d&#39;exécuter de nombreux échantillons à moinsemps et en réduisant le risque d&#39;erreur. Enfin, la sonde et les informations séquence de l&#39;amorce sont prévus, ce qui simplifie le processus de publication. Ici, nous montrons comment obtenir des réactifs appropriés Solaris utilisant la fonctionnalité du produit GENEius recherche sur le site Web de commande (www.thermo.com / solaris) et comment utiliser les réactifs Solaris pour effectuer qPCR utilisant la méthode de la courbe standard.

Les analyses qPCR Solaris expression des gènes sont de nouveaux pré-conçus qPCR amorce / sonde combinaisons conçues pour simplifier le processus de qPCR sans pour autant sacrifier la spécificité et la robustesse de l&#39;analyse.

Quantitative PCR en temps réel utilisant le Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Le dosage de l'expression génique Solaris qPCR est un nouveau type d'ensemble amorce/sonde, conçu pour simplifier le processus de qPCR tout en maintenant la sensibilité et...

Dans cet article vidéo, la PCR en temps réel est démontrée à l'aide des tests Solaris QPCR. Les tests Solaris QPCR sont des réparations spécifiques aux gènes composées d'oligonucléotides sondes et amorces, conçues pour détecter toutes les variantes d'épissage connues d'un gène donné. Dans des conditions universelles de thermocyclage, la sonde Solaris possède un fixateur du sillon mineur, un groupement et un marqueur FA à l'extrémité cinq prime, ainsi qu'un inhibiteur sombre éclipsé à l'extrémité trois prime.Pendant l'étape de dénaturation de la PCR en temps réel, la sonde reste en solution et la fluorescence du marqueur FAM est inhibée. Pendant les phases d'hybridation et d'extension, les amorces de la sonde se lient à la séquence cible et l'inhibiteur est séparé du FAM. Le FAM émet alors un signal fluorescent intense ; lorsque la sonde se dissocie, la fluorescence est de nouveau inhibée.Des résultats de PCR en temps réel sont obtenus, démontrant la sensibilité, la spécificité et la reproductibilité de cet essai efficace. Bonjour, je suis James Covino, membre de l'équipe de recherche et développement de Thermo Fisher Scientific à Lafayette, dans le Colorado. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de préparer une réaction QPCR standard à l'aide des réactifs d'expression génique Lars QPCR.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l’extinction de gènes ciblés à l’aide de technologies d’interférence par ARN. Commençons donc. Le test Solaris QPCR assay STEM se distingue par un algorithme unique qui exploite les technologies MGB et super base, offrant un test unique et pratique pour 98 % des gènes annotés chez l’homme et la souris.En général, la conception des sondes et des amorces d'ADN est limitée par la température de fusion de la sonde, qui dépend du nombre et du type de bases. Les séquences plus longues et les séquences riches en GC présentent des températures de fusion plus élevées. La partie liante du sillon mineur utilisée dans les sondes Solaris s'insère dans le sillon mineur de l'hélice d'ADN et stabilise l'interaction entre la sonde et la séquence cible.Cela augmente la température de fusion, permettant l'utilisation de sondes plus courtes. L'algorithme Solaris incorpore également de manière sélective des nucléotides modifiés appelés super bases afin d'améliorer la stabilité des liaisons AT et d'éliminer l'association autonome GG dans les séquences riches en guanines. Cela permet d'utiliser des séquences cibles qui seraient autrement évitées.La flexibilité accrue des séquences offerte par l'utilisation de ces technologies permet la conception de jeux d'amorces et de sondes reconnaissant toutes les variantes d'épissage connues d'un seul gène. Notez que, chaque fois que possible, des régions chevauchant les jonctions d'exons ont été intégrées dans le site cible afin d'augmenter la spécificité en évitant l'amplification de l'ADN génomique contaminant. Les jeux d'amorces et de sondes obtenus sont analysés par BLAST à l'aide de trois bases de données différentes — génomique, transcript et pseudogène — afin de garantir leur spécificité. En outre, les jeux d'amorces et de sondes Solaris ont été entièrement optimisés de sorte que les conditions de cyclage soient identiques pour tous les tests de PCR quantitative, ce qui permet d'évaluer l'expression de divers transcrits lors d'un même cycle de PCR.Pour commencer à planifier l'expérience de R-PCR quantitative, identifiez les réactifs nécessaires pour réaliser la PCR quantitative du gène d'intérêt à l’aide de la recherche de produits Genius, accessible à l’adresse thermo.com/solaris. Cliquez dans la zone de recherche et sélectionnez l’organisme cible approprié. La recherche de produits Genius peut traiter de nombreux types d’identifiants génétiques. Ici.Saisissez l'un des termes de recherche suggérés pour le gène d'intérêt, puis cliquez sur « Rechercher », identifiez le gène d'intérêt et cliquez sur « Sélectionner » sur le côté gauche. Une fenêtre s'ouvrira, affichant les différents réactifs disponibles pour le gène d'intérêt. Cliquez sur l'onglet détection QPCR sous le test d'expression génique Solaris.Un dosage optimal de sondes et d'amorces Solaris est affiché. Ce dosage unique permettra de détecter toutes les variantes d'épissage connues du gène d'intérêt. Une fois l'amorce appropriée identifiée, recherchez le cyclateur QPCR qui sera utilisé dans le menu et identifiez le mélange maître compatible, soit le mélange maître avec un flacon séparé de colorant passif de référence rocks, le mélange rocks, ou le mélange à faible teneur en rocks.Ici, nous utiliserons le Light Cycler 480 de Roche, donc le mélange maître plus le flacon de rock sera utilisé. Il est également important de s'assurer qu'un gène de référence approprié est inclus dans l'étude. La B2M sera utilisée une fois que tous les réactifs Solaris QP CR auront été reçus.Ils doivent être conservés à moins 20 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation. Les réactifs sont stables pendant au moins 12 mois. Il faut éviter les cycles répétés de congélation-décongélation.Préparez l'ADNc pour la qPCR en effectuant des réactions de transcription inverse sur l'ARN échantillon. Une fois l'ADNc préparé, décongelez l'analyse Solaris et le mélange maître sur de la glace. Le mélange maître contient tous les composants nécessaires à la PCR quantitative, à l'exception de l'analyse spécifique du gène et du composant matrice ; il comprend le thermostat, l'ADN polymérase dn, et les TPS rocks.Si l'appareil de QPCR nécessite des pierres et un tampon de réaction propriétaire contenant un colorant bleu interne, prévoyez également de l'eau de qualité PCR et des plaques de QPCR. Une fois les solutions décongelées, mélangez-les en les agitant légèrement, puis centrifugez-les brièvement pour éviter toute perte de réactif. Ensuite, dans un tube de 15 millilitres, préparez un mix maître de dosage Solaris QPCR à une concentration x.En combinant, pour le nombre souhaité d'échantillons à analyser dans une plaque de 384 puits, cinq microlitres de mix maître 2x, 0,5 microlitre de réactif Solaris 20x et de l'eau de qualité PCR afin que le volume final dans chaque puits soit de 10 microlitres. Une fois l'ADNc ajouté, veillez à préparer suffisamment de mix pour trois réplicats de chaque échantillon, y compris un témoin sans matrice (NTC) et un témoin sans transcriptase inverse (sans RT), afin de vérifier respectivement la contamination des réactifs ou la présence d'ADN génomique contaminant. Ensuite, transférez le mélange dans un réservoir stérile.Ensuite, à l’aide d’une pipette multipuits, transférez le volume approprié du mix maître 1x dans les puits correspondants de la plaque PCR. Si des plaques blanches sont utilisées, le colorant bleu inclus dans le mix maître facilitera le suivi de l’avancement de la pipette. Plusieurs bibliothèques d’ADNc et gènes de référence peuvent être analysées sur la même plaque, puisque toutes les conditions de cyclage sont identiques.Une fois le mélange maître 1 x ajouté aux puits appropriés, ajoutez le modèle d'ADN dilué dans chaque puits afin que le volume final soit de 10 microlitres ; pipetez plusieurs fois vers le haut et vers le bas pour homogénéiser. Scellez la plaque avec un film adhésif ou un scellage thermique, comme illustré ici.Placer la plaque dans une centrifugeuse et effectuer une courte centrifugation afin de faire descendre les réactifs au fond des puits et éliminer les bulles d'air qui pourraient interférer avec les mesures de fluorescence. Le thermocycleur doit activer la polymérase à démarrage chaud présente dans le mélange maître Solaris QPCR à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes, un cycle, puis réaliser 40 cycles de dénaturation à 95 degrés Celsius pendant 15 secondes, suivis d'une extension à 60 degrés Celsius pendant 60 secondes. Ce protocole est identique pour tous les tests Soliris QPCR, quelle que soit la séquence génique amplifiée.Enfin, placez la plaque dans l'appareil de PCRq et démarrez le programme. Cette figure illustre la haute performance des tests Solaris : 10 dilutions décimales d'ADN synthétique ou d'ADNc ont été amplifiées à l'aide des tests d'expression génique Solaris PCRq pour CDC 20 et F two RL one. Les courbes d'amplification et les courbes standards en échelle logarithmique pour des dilutions log₁₀ montrent la haute performance du test, même à de faibles concentrations d'entrée.Les performances de chaque test sont mesurées par l'efficacité, la valeur du carré du domaine dynamique sur 10, les dilutions logarithmiques en base 10 et la limite inférieure de détection. Les données présentées ici démontrent la reproductibilité des tests Solaris. Ici, des aliquotes d'ADNc ont été amplifiées dans deux laboratoires situés dans des régions géographiques distinctes à l'aide des tests d'expression génique Solaris QPCR et du mélange maître.Les mêmes niveaux d'expression ont été calculés pour deux gènes cibles dans les deux laboratoires. Nous venons de vous montrer comment préparer une réaction de QPCR standard à l'aide des réactifs Solaris pour l'expression génique. Lors de la réalisation de cette expérience, il est important de se rappeler de préparer des mélanges maîtres avec la concentration finale correcte des réactifs et d'inclure des réplicats biologiques et/ou techniques appropriés.En outre, il est impératif de configurer l'appareil de PCR quantitative avec les conditions de thermocyclage appropriées pour Solaris. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous allons démontrer la configuration et l'analyse des pré-microARN de 96 puits pour les tableaux QPCR aide d'un robot ainsi que par la main avec une pipette multicanaux Thermo Scientific Matrix.

Profilage de la pré-micro ARNs et micro-ARN en utilisant quantitative PCR en temps réel (qPCR) Arrays

Nous décrivons un protocole de PCR en temps réel pour le profil de microARN dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). A l'exception des protocoles d'extraction d'ARN, la procédure peut être étendue à l'ARN extrait à partir d'autres fluides corporels, des cellules en culture, ou des échantillons de tissus.

Liquide céphalo-rachidien profilage de microARN Utilisation quantitative PCR en temps réel

MicroARN qui circulent ont récemment émergé comme biomarqueurs prometteurs et novateurs en vue de divers cancers et d'autres maladies. Le but de cet article est de discuter de trois plateformes de PCR différents basés sonde en temps réel et les méthodes qui sont disponibles pour quantifier et déterminer l'abondance des microARN circulation.

PCR en temps réel basée sur une sonde Approches de mesure quantitative des microARN

Fournit un protocole pour développer un test d’amplification de la polymérase recombinase en temps réel afin de quantifier la concentration initiale d’échantillons d’ADN à l’aide d’un thermocycleur ou d’un microscope et d’un réchauffeur de platine. Le développement d’un contrôle positif interne est également décrit. Des scripts sont fournis pour le traitement des données brutes de fluorescence en temps réel.

Développement d&#39;un Quantitative recombinase polymérase L&#39;amplification Assay avec un contrôle positif interne

Ce protocole décrit un test qRT-PCR à haut débit pour l’analyse des signatures d’expression d’IFN de type I et III. Le test discrimine les différences de paires de bases uniques entre les transcrits très similaires de ces gènes. Grâce à l’assemblage par lots et au pipetage robotisé, les tests sont cohérents et reproductibles.

Haut-débit quantitative en temps réel RT-PCR analyse pour déterminer les profils d&#39;expression de types I et III sous-types d&#39;interféron

Les chromosomes concepteurs du projet Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, peuvent être distingués de leurs homologues natifs à l’aide d’un test de génotypage basé sur la PCR appelé PCRTagging, qui a un critère de présence/absence. Nous décrivons ici une méthode de détection PCR en temps réel à haut débit pour le génotypage PCRTag.

Analyse qPCRTag - un débit élevé, PCR temps réel pour Sc2.0 Génotypage

Il s’agit d’un protocole de temps - et rapport coût - entrée en vitro étudie les mécanismes de résistance acquise aux agents thérapeutiques ciblées, qui est un très besoin médical dans le traitement du cancer.

À la recherche de pilote Pathways of acquis une résistance à la thérapie ciblée : génération sous-clone résistantes aux médicaments et sensibilité restauration par gène précipitation

Détection rapide et précise des agents pathogènes sur place, en particulier terricole phytopathogènes, est cruciale pour prévenir d’autres production d’inoculum et la prolifération des maladies des plantes sur le terrain. La méthode développée ici en utilisant un système de détection de PCR en temps réel portable permet un diagnostic sur place dans des conditions réelles.

Sur le site Molecular Detection of phytopathogènes transmises par le sol à l’aide d’un système PCR en temps réel Portable

Ici, un protocole quantitatif en temps réel basé sur la réaction en chaîne de la polymérase est présenté pour la détermination de la teneur en micro-ARN native (absolue/relative) des particules de lipoprotéines. En outre, une méthode pour augmenter le niveau de micro-ARN, ainsi qu’une méthode pour déterminer le taux d’absorption cellulaire des particules de lipoprotéines, est démontrée.

Enrichissement de particules de lipoprotéines indigènes avec microRNA et détermination subséquente de leur teneur absolue/relative de microRNA et de leur taux de transfert cellulaire

Échantillons microvolume sont quantifiés par un système qui utilise un spectrophotomètre tension de surface naturelle à conserver des échantillons sans l'utilisation des cuvettes ou des capillaires. La gamme dynamique des concentrations de protéines et de la vitesse à laquelle ils peuvent être mesurés sont fortement augmentées avec cette méthode.

Détermination microvolume concentration de protéines en utilisant le spectrophotomètre NanoDrop 2000c

Découvrez la PCR quantitative en temps réel avec les kits Solaris pour l'analyse d'expression génique. Cette méthode détecte toutes les variantes d'épissage connues avec une grande spécificité et reproductibilité.

Quantitative PCR en temps réel utilisant le Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Explorer plus de vidéos