Visualisation de localisation de l'ARN Xenopus Les ovocytes

Dans cette procédure, l’ARN marqué par fluorescence. Les transcrits sont injectés dans XUS Cytes et leur localisation est surveillée. Tout d’abord, l’ARN est marqué avec des nucléotides fluorescents.

Dans une réaction de transcription in vitro, l’ARN est ensuite chargé dans un appareil de micro-injection. Les ovocytes sont placés sur une boîte d’injection et soigneusement micro-injectés. Enfin, les ovocytes sont cultivés pour permettre la localisation de l’ARN avant l’imagerie au microscope confocal.

Bonjour, je m’appelle James Gagnan et je travaille dans le laboratoire de Kimberly Mallory au Département de biologie moléculaire, de biologie cellulaire et de biochimie de l’Université Brown. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour visualiser la localisation de l’ARN subcellulaire dans les ovocytes Xap. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l’architecture de l’ARN et les facteurs protéiques nécessaires à la localisation de l’ARN au cours du développement précoce des vertébrés.

Alors commençons. Pour commencer cette procédure, transcrivez l’ARNm, qui est marqué à la fois radioactivement et par fluorescence comme décrit dans le protocole écrit ci-joint. Ajoutez DS pour dégrader l’ADN matrice, puis arrêtez la réaction en ajoutant de l’EDTA.

Éliminez les nucléotides non incorporés et autres petites molécules en tournant à travers une colonne G 50. L’ARN est ensuite concentré par précipitation d’éthanol, lavé et remis en suspension. Après avoir déterminé la concentration par comptage par scintillation, diluez l’ARN à 50 nanomolaires et stockez-le dans des aliquotes de cinq microlitres à moins 80 degrés Celsius.

Lorsque vous êtes prêt à effectuer la micro-injection, décongelez un Eloqua de l’ARN marqué dénaturé à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, essorez pendant 10 minutes à vitesse maximale dans une micro-centrifugeuse à température ambiante pour éliminer les particules et garder sur la glace. Ensuite, isolez les morceaux de coupe cytes de l’ovaire xap post lavu en un deux conique de 50 millilitres contenant 25 millilitres de trois milligrammes par millilitre.

Collagénase dans un tampon de phosphate de potassium de 0,1 molaire à pH 7,4. Agiter doucement à 18 degrés Celsius en raison de la variation d’un lot à l’autre. La durée du traitement à la collagénase peut varier et doit être surveillée attentivement par une inspection visuelle.

Pour s’assurer que la défoliation continue à agiter pendant 15 minutes ou jusqu’à ce que les ovocytes soient visiblement séparés de l’ovaire, laissez les ovocytes se déposer au fond du tube conique. Supprimez la solution et remplacez-la par une mémoire tampon MBSH. Répétez cette opération, lavez deux fois de plus pour un total de trois lavages.

Ensuite, triez manuellement les CYTES et les tampons MBSH des étages trois à quatre à l’aide d’un microscope optique standard. Les cytes du troisième stade sont complètement opaques, mais blancs. Alors que les cytes du stade quatre sont légèrement plus grands et tachetés de pigments.

Les cytes légèrement transparents sont trop jeunes et les cytes entièrement pigmentés ou présentant une distribution pigmentaire polarisée sont trop vieux. Enfin, préparez les aiguilles pour la micro-injection à l’aide de capillaires de trois pouces et demi en tirant et en biseautant pour obtenir des aiguilles d’un diamètre extérieur d’environ 0,05 millimètre. Maintenant que les ovocytes et les aiguilles de l’ARNm sont prêts, procédez à la micro-injection.

Commencez par calibrer l’aiguille avec de l’eau nécessaire pour délivrer deux nanomètres par injection injectable. Devant. Chargez l’aiguille à l’aide d’un micro-injecteur contrôlé par gaz et calibrez la taille de la goutte à l’aide d’un micromètre après l’étalonnage, chargez avant l’ARN à injecter dans l’aiguille. Ensuite, placez les ovocytes triés sur une boîte d’injection Dans le tampon MBSH, la boîte contient une couche de caoutchouc mousse noir.

Le cyte blanc se détache bien sur un fond noir. Ensuite, injectez soigneusement chaque ovocyte avec deux litres d’ARN à 50 nanomolaires. Assurez-vous d’injecter chaque ovocyte une seule fois et vérifiez régulièrement que l’aiguille n’est pas obstruée lorsque l’injection est terminée.

Expulsez l’ARN restant, rincez l’aiguille à l’eau et chargez l’ARN suivant pour l’injection. Après l’injection, transférez les cytes injectés dans un puits d’une plaque stérile de 24 puits jusqu’à un millier. Les CYTES peuvent être cultivés par puits.

Retirez le tampon et remplacez-le par 400 microlitres de milieu de culture de cyte par puits. Ensuite, placez la plaque de culture dans un récipient en plastique avec une serviette en papier humide pour maintenir un environnement humide pendant la culture, incubez les ovocytes à 18 degrés Celsius pendant des périodes allant de huit à 48 heures après la période d’incubation souhaitée. Les ovocytes peuvent être préparés pour la microscopie après l’incubation des ovocytes injectés.

Triez les ovocytes morts et placez les ovocytes survivants dans des flacons en verre. La survie de plus de 90 % des ovocytes est régulièrement observée. Remplacez le tampon par un fixateur M-E-M-F-A et secouez les cytes pendant 20 minutes.

Protégez les ovocytes de la lumière du soleil pendant la fixation après la fin de la période de fixation. Lavez les ovocytes en retirant le fixateur et en le remplaçant par un volume égal de tampon MBSH. Répétez ce lavage une fois de plus pour un total de deux lavages.

Ensuite, lavez les ovocytes dans du méthanol anhydre. Tout d’abord, retirez la moitié du volume et remplacez-le par du méthanol. Répétez cette opération deux fois de plus.

Après ces lavages, retirez toute la solution et remplacez-la par du méthanol. Répétez ce lavage au méthanol une fois de plus. Les ovocytes fixes et déshydratés peuvent être conservés à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être imagés.

Avant l’imagerie, ajoutez le produit de clarification de Marie dans une parabole fluorescente WPI à fond de verre pour couvrir la surface d’imagerie. Transférez soigneusement les ovocytes du méthanol dans la boîte fluorescente, en minimisant le volume de méthanol transféré dans les ovocytes sur un microscope confocal inversé, un Zeiss LSM five 10 et un aica TCSs P donnent de bons résultats. Nous allons maintenant montrer quelques images représentatives de la localisation de l’ARN subcellulaire immédiatement après la micro-injection : l’ARN fluorescent peut être observé dans le noyau après huit heures de culture de contrôle marqué par fluorescence.

L’ARN peut être observé uniformément distribué dans le cytoplasme de l’ovocyte. Cependant, un ARN marqué par fluorescence contenant des séquences qui recrutent la machinerie de transport peut être observé dans le processus de localisation subcellulaire au pôle végétal de l’ovocyte. Nous venons de vous montrer comment micro-injecter des ARN marqués par fluorescence dans les cytes de zap et observer la localisation de l’ARN par microscopie confocale.

Lors de cette procédure, il est important d’utiliser des solutions traitées au déci pour éviter la contamination par les ARN de la culture, vos cytes dans l’OCM contenant des antibiotiques, et pour protéger vos cytes de la lumière du soleil dans la mesure du possible pour éviter le photoblanchiment. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.