Name: Visualisation de localisation de lARN Xenopus Les ovocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Apprenez la visualisation du transport de l'ARN dans les ovocytes de Xenopus par microinjection et microscopie confocale. Cette méthode permet d'étudier la localisation subcellulaire de l'ARN en temps réel.

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Notre travail sur la localisation d&#39;ARN est soutenu par une subvention du NIH (R01GM071049) à KLM.

Partie 1: La transcription de l'ARNm marqué par fluorescence. <ol><li> Linéariser l'ADN plasmidique contenant l'élément de localisation ou d'autres séquences d'ARN pertinentes et remettre à 1 ug / ul avec DEPC traitées H 2 O. La matrice d'ADN doit avoir des sites promoteur en amont de la transcription par T7, SP6 ou T3 ARN polymérase. </li><li> Ajouter les réactifs suivants dans un tube stérile de 1,5 ml: <table><tbody><tr><td> a. Tx 10X tampon (voir M &amp; M) </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> b. 20X CAP / NTP mélanger (voir M &amp; M) </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> C. 1 mM Alexa Fluor 546 au 14-UTP (Invitrogen) </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> d. UTP, [α-32 P] (1 pCi / pl) (Perkin Elmer) </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> e. DEPC-H 2 O </td><td> 11 ul </td></tr><tr><td> f. 0,2 M de DTT </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> g. RNasine (Promega) </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> h. ADN matrice linéaire </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> i. ARN polymérase (Promega) </td><td> 1 pl </td></tr></tbody></table></li><li> Mélanger délicatement les réactifs et centrifuger brièvement (10 sec. Dans une microcentrifugeuse). </li><li> Incuber pendant 2-4 heures à 37 ° C, couvrant le tube avec du papier aluminium pour éviter photoblanchiment des fluorophores. </li><li> Ajouter 1 pl 1 mg / ml sans RNase DNase (Promega) pour dégrader l'ADN matrice. </li><li> Incuber 15 minutes à 37 ° C. </li><li> Ajouter 79 ul EDTA 20 mM (pH 8,0) pour arrêter la réaction. </li><li> Retirer 1 ul d'un tube séparé, étiqueté comme "entrée" et sauvegarder. </li><li> De réaction à travers un Spin 1 ml G50 colonne (voir Matériaux &amp; Procédés), qui comprendra les nucléotides non constituée en société, tout en excluant l'ARNm de pleine longueur. </li><li> Concentrer l'ARN par précipitation à l'éthanol: <ol class="lalpha"><li> Ajouter 250 ul d'éthanol à 100%, 10 pl 7M CH 3 COONH 4, 1 porte-ul d'ARN (ARNt de levure, 10 pg / pl) ou 1 ul glycogène (20 mg / ml). </li><li> Mélangez bien et congeler jusqu'à solide à -80 ° C pour&gt; 30 minutes ou sur la glace sèche pendant 15 minutes. </li><li> Centrifuger à vitesse maximale dans microcentrifugeuse pendant 15 minutes, le surnageant décanter. </li><li> Laver avec 150 ul d'éthanol à 75%. </li><li> Spin 3 minutes à vitesse maximale dans microcentrifugeuse, surnageant décanter. </li><li> Sécher les granulés à 37 ° C pendant 3 minutes, en s'assurant que tout l'éthanol s'est évaporée. </li></ol></li><li> Remettre en suspension dans 11 ul DEPC-H 2 O et de supprimer 1 pl d'un tube séparé, étiqueté comme «constituée». </li><li> Déterminer l'incorporation pour cent et de diluer l'ARN à 50 nm (voir Matériaux &amp; Méthodes de calcul). </li><li> Les ARN doivent être congelés en 5 aliquotes, à usage unique pour éviter les cycles gel / dégel et peuvent être stockées pendant plusieurs semaines à -80 ° C. </li></ol> Partie 2: Préparation à la microinjection. <ol><li> Préparation d'ARN: Dégeler une aliquote de l'ARN (50 nM), et de dénaturer l'ARN à 70 ° C pendant 3-5 minutes. Spin pendant 10 minutes dans microcentrifugeuse température ambiante à la vitesse maximale pour enlever toutes les particules, et de garder sur la glace. </li><li> Préparation des ovocytes: <ol class="lalpha"><li> Enlever chirurgicalement des ovaires de Xenopus laevis femelles (NASCO). </li><li> Pièces de garniture de Xenopus laevis ovaire dans un tube conique de 50 ml contenant 25 ml de solution de collagénase (voir Matériaux &amp; Procédés). </li><li> Agiter doucement à 18 ° C pendant 15 minutes, ou jusqu'à ce que les ovocytes sont visiblement séparées de l'ovaire. En raison de la variation lot à lot, temps de traitement de la collagénase peut varier et doit être surveillée attentivement par l'inspection visuelle pour s'assurer defoliculation. </li><li> Autoriser ovocytes à s'installer dans le tube, enlever la solution et laver les ovocytes avec le tampon MBSH (voir Matériaux &amp; Procédés). </li><li> Répétez laver deux fois plus pour un total de trois lavages. Ce protocole d'isolement d'ovocytes est similaire à celui détaillé dans Cohen et al., 2009. </li><li> Trier manuellement stade III / IV ovocytes (Dumont, 1972) dans un tampon de MBSH sous un microscope standard à dissection. Etape III ovocytes sont complètement opaques, mais blanc, alors que le stade IV ovocytes sont légèrement plus grandes et tacheté avec des pigments. Ovocytes qui sont légèrement transparents sont trop jeunes et que les ovocytes totalement pigmentées ou la distribution de pigments présentent polarisés sont trop vieux. </li></ol></li><li> Préparation d'aiguille: Tirez et biseau des aiguilles d'un diamètre extérieur de ~ 0,05 mm. (Nous utilisons Drummond Scientific 3,5 pouces capillaires (ordre n ° 3-000-203-G / X), une Sutter Instrument Co. micropipette extracteur et un WPI Inc angleur.) </li></ol> Partie 3: microinjection <ol><li> Calibrer aiguille avec DEPC-H 2 O 2 pour livrer nl par injection. Nous en charge avant notre aiguille en utilisant un gaz microinjecteur moteur (voir Matériels &amp; Méthodes), et de calibrer la taille de goutte à l'aide d'un micromètre. </li><li> Charge d'ARN dans l'aiguille. </li><li> Placez triés ovocytes dans un plat contenant un tampon d'injection MBSH. Nous microinject sur un plat avec une couche de mousse de caoutchouc noir. Les ovocytes pâles ressortent bien sur un backgrou blanchend. </li><li> Soigneusement injecter chaque ovocyte avec 2 nl d'ARN à 50 nM. </li><li> Expulsez l'ARN, rincer l'aiguille avec DEPC-H 2 O, et de la charge d'ARN suivante pour l'injection. </li></ol> Partie 4: Culture ovocytes <ol><li> Ovocytes Placer dans un puits d'une plaque de stériles 24 puits (Sigma Aldrich). Nous culture jusqu'à un millier d'ovocytes par puits. </li><li> Retirer tampon et le remplacer par 400 pl O C ulture ocyte M oyen (OCM, voir Matériaux &amp; Procédés) par puits. Plaque de culture Placer dans un récipient hermétique en plastique avec une serviette en papier humide pour maintenir l'environnement humide pendant la culture. </li><li> Incuber ovocytes à 18 ° C pour les points de temps compris entre 8 et 48 heures. </li></ol> Partie 5: fixation, déshydratation et stockage des ovocytes <ol><li> Trier les ovocytes morts et le lieu ovocytes survivre dans des flacons en verre. Nous observons régulièrement de survie&gt; 90%. </li><li> Placer dans des ovocytes MEMFA de fixation (voir Matériaux &amp; Procédés) et du rock pendant 20 minutes. Protéger les ovocytes de la lumière en couvrant avec du papier aluminium. </li><li> Lavez ovocytes en supprimant fixateur et le remplacer par un volume égal de tampon MBSH. Répéter ce lavage une fois de plus pour un total de deux lavages. </li><li> Lavez ovocytes en méthanol anhydre: <ol class="lalpha"><li> Retirer la moitié du volume, le remplacer par du méthanol. </li><li> Répétez l'étape "a" deux fois. </li><li> Enlevez toute la solution, le remplacer par du méthanol. </li><li> Répétez lavage au methanol. </li></ol></li><li> Les ovocytes peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'au moment de l'image. </li></ol> Partie 6: Imagerie ARN localisation par microscopie confocale <ol><li> Avant d'imagerie, ajoutez moyen Murray s Clearing (02h01-benzoate de benzyle alcool benzylique) à un fond de verre FluoroDish (WPI Inc) pour couvrir la surface d'imagerie. </li><li> Soigneusement transférer les ovocytes à partir de méthanol à FluoroDish, en minimisant le volume de méthanol transférés. </li><li> Image sur un microscope inversé confocal (Nous avons utilisé avec succès un LSM510 Zeiss et Leica TCS SP2). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1704/1704fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1:.. Visualisation de l'ARN localisation subcellulaire par microinjection d'Transcriptions par fluorescence Labelled A. Après microinjection, ARN marqués avec Alexa Fluor 546 est initialement limité au noyau B. Après huit heures de culture, un ARN marqué par fluorescence de contrôle peut être vu de manière uniforme distribués dans le cytoplasme de l'ovocyte. C. Cependant, l'ARN marqué par fluorescence contenant des séquences qui recrutent des engins de transport peut être vu dans le processus de localisation subcellulaire du pôle végétal de l'ovocyte (vers le bas). Barre d'échelle = 50 microns.

<ol><li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li>
<li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li>
<li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+transport+in+ovo%3A+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li>
<li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li>
<li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTB%2FhnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li>
<li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li>
<li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li>
<li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li>
</ol>

Des expériences utilisant des animaux de laboratoire ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l&#39;Université Brown.

Ici, nous avons présenté un protocole pour la visualisation de la localisation d&#39;ARNm dans les ovocytes de Xénope. Cette méthode, en utilisant des ARN transcrits marqués par fluorescence a plus de signal sur bruit que précédemment obtenus avec marquées à la digoxigénine transcriptions et est plus simple et plus rapide que in situ des approches fondées (Mowry et Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). En utilisant cette méthode, nous pouvons concevoir l&#39;ARN mutations séquence et tester rapidement des f...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

10X tampon Tx <ul><li class="none"> 60 mM MgCl 2 </li><li class="none"> 400 mM Tris-HCl (pH 7,5) </li><li class="none"> 20 mM spermidine-HCl </li></ul> 20x CAP / NTP mélangez <ul><li class="none"> 10 mM CTP </li><li class="none"> 10 mM d&#39;ATP </li><li class="none"> 9 mM UTP </li><li class="none"> 2 mM GTP </li><li class="none"> 20 mM G (PPP) G Cap analogique (New England Biolabs) </li></ul> Colonne G-50 <ul><li class="none"> Hydratez 5 g de Sephadex G-50 perles (Sigma Aldrich) dans 100 ml d&#39;eau désionisée H 2 O. DEPC traiter pendant 30 min. et autoclave. Magasin de stock incomplète à la température ambiante. Avant utilisation, ajoutez la ligne suivante sans RNase solutions: </li><li class="none"> 0,5 ml d&#39;EDTA 0,2 M </li><li class="none"> 1 ml Tris 1 M pH 8,0 </li><li class="none"> 0,5 ml SDS à 20% </li><li class="none"> Boutique complète G-50 une solution à 4 ° C. </li><li class="none"> Retirez et jetez le piston d&#39;une seringue de 3 ml (BD Biosciences) et placer le canon de la seringue dans un tube de 15 ml conique (Corning). Branchez la seringue avec une petite quantité de laine de verre (une prise près de la moitié de la taille d&#39;un penny). </li><li class="none"> Swirl complète G-50 une solution pour remettre perles. </li><li class="none"> Ajouter 2 ml solution G-50 à la colonne vide. </li><li class="none"> Spin pendant 1 minute à 1000 x g dans la centrifugeuse de paillasse. </li><li class="none"> Ajouter 200 ul traitée par DEPC désionisée H 2 O pour chaque colonne. Spin. </li><li class="none"> Répétez laver deux fois plus pour un total de trois lavages. </li><li class="none"> Enlevez seringue à un frais 15 ml tube conique. </li></ul> Solution de collagénase <ul><li class="none"> 75 mg de la collagénase de Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) </li><li class="none"> 25 ml 0,1 M KPO 3 + (pH 7,4) </li></ul> MBSH tampon <ul><li class="none"> 88 mM de NaCl </li><li class="none"> 1 mM de KCl </li><li class="none"> 2,4 mM NaHCO 3 </li><li class="none"> 0,82 mM MgSO 4 7H 2 O X </li><li class="none"> 0,33 mM Ca (NO 3) 2 X 4H 2 O </li><li class="none"> 0,41 mM de CaCl 2 X 6 H 2 O </li><li class="none"> 10 mM HEPES (pH 7,6) </li></ul> Milieu de culture des ovocytes <ul><li class="none"> 50% du milieu L15 </li><li class="none"> 15 mM HEPES (pH 7,6) </li><li class="none"> 1 mg / ml d&#39;insuline </li><li class="none"> 100 mg / ml de gentamicine </li><li class="none"> 50 U / ml de nystatine </li><li class="none"> 50 U / ml de pénicilline </li><li class="none"> 50 mg / ml de streptomycine </li></ul> MEMFA solution <ul><li class="none"> 0,1 M MOPS (pH 7,4) </li><li class="none"> EGTA 2 mM </li><li class="none"> 1 mM MgSO 4 </li><li class="none"> Formaldéhyde 3,7% </li></ul> Informatique ARN rendement <ul><li class="none"> Déterminer CPM dans &quot;entrée&quot; et &quot;incorporé&quot; des échantillons en utilisant un compteur à scintillation standard. </li><li class="none"> l&#39;incorporation = («incorporée») / (10 x &#39;&quot;entrée&quot;) </li><li class="none"> Les valeurs habituelles se situent entre l&#39;incorporation ~ 0,03 et 0,10. </li><li class="none"> Rendements maximums théoriques pour polymérases différentes: T7, T3, SP6 - 2,64 g </li><li class="none"> Rendement de la réaction en pg = (rendement maximal de la polymérase utilisée) X (constitution) </li><li class="none"> Diluer l&#39;ARN à 50 nM = (g ARN) / 320 / (longueur de l&#39;ARN dans des bases) / (5X10 -8) </li><li class="none"> La réaction généralement des rendements de 50 à 100 ~ ul d&#39;ARN à 50 nM. </li></ul>

visualisation de localisation de l&#39;arn xenopus les ovocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

La localisation d&#39;ARN est un mécanisme conservé d&#39;établir la polarité cellulaire. Vg1 ARNm se localise dans le pôle végétal des ovocytes de Xenopus laevis et agit pour restreindre l&#39;espace d&#39;expression génique des protéines Vg1. Un contrôle strict de la distribution Vg1 de cette manière est requise pour la spécification de la couche germe de bon dans l&#39;embryon en développement. Des éléments de séquence d&#39;ARN en 3 &#39;UTR de l&#39;ARNm, l&#39;élément Vg1 localisation (VLE) sont nécessaires et suffisantes pour le transport direct. Pour étudier la reconnaissance et de transport de Vg1 ARNm in vivo, nous avons développé une technique d&#39;imagerie qui permet une analyse approfondie des facteurs de trans-mécanismes de transport dirigé via une lecture visuelle simple. Pour visualiser la localisation d&#39;ARN, nous synthétisons marqué par fluorescence ARN VLE et microinject cette transcription dans des ovocytes individuels. Après la culture des ovocytes pour permettre le transport de l&#39;ARN injecté, les ovocytes sont fixes et déshydratés avant d&#39;imagerie par microscopie confocale. Visualisation des schémas de localisation d&#39;ARNm fournit une lecture de surveillance de la voie complète de l&#39;ARN de transport et d&#39;identification des rôles dans la direction de l&#39;ARN de transport pour les éléments agissant en cis au sein de la transcription et facteurs agissant en trans qui se lient à l&#39;VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Nous avons étendu cette technique à travers la co-localisation avec des ARN et des protéines supplémentaires (Gagnon et Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), et en combinaison avec perturbation des protéines motrices et le cytosquelette (Messitt et al., 2008) à la sonde mécanismes sous-jacents de localisation d&#39;ARNm.

Visualisation des<em&gt; In vivo</em&gt; ARN de transport se fait par micro-injection d&#39;ARN transcrits marqués par fluorescence dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovocytes, suivi par microscopie confocale.

Visualisation de localisation de l&#39;ARN Xenopus Les ovocytes

La localisation de l'ARN est un mécanisme conservé d'établissement de la polarité cellulaire. L'ARNm de Vg1 se localise au pôle végétatif des ovocytes de Xenopus laevis et agit pour restreindre spatialement l'expression génique de la protéine Vg1. Un contrôle strict de la distribution de Vg1 de cette manière est nécessaire pour une spécification correcte des feuillets embryonnaires dans l'embryon en développement. Des éléments de séquence d'ARN situés dans la région 3' UTR de l'ARNm, l'élément de localisation de Vg1 (VLE), sont requis et suffisants pour diriger le transport. Pour étudier la reconnaissance et le transport de l'ARNm de Vg1 in vivo, nous avons développé une technique d'imagerie qui permet une analyse approfondie des mécanismes de transport dirigés par des facteurs trans via une lecture visuelle simple. Pour visualiser la localisation de l'ARN, nous synthétisons de l'ARN VLE marqué par fluorescence et micro-injectons ce transcrit dans des ovocytes individuels. Après culture des ovocytes pour permettre le transport de l'ARN injecté, les ovocytes sont fixés et déshydratés avant l'imagerie par microscopie confocale. La visualisation des modes de localisation de l'ARNm permet de suivre l'intégralité de la voie de transport de l'ARN et d'identifier les rôles dans l'orientation du transport de l'ARN des éléments cis-régulateurs au sein du transcrit et des facteurs trans-régulateurs qui se lient au VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Nous avons étendu cette technique par co-localisation avec d'autres ARN et protéines (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), et en combinaison avec la perturbation des protéines motrices et du cytosquelette (Messitt et al., 2008) pour sonder les mécanismes sous-jacents à la localisation de l'ARNm.

Dans cette procédure, l'ARN marqué par fluorescence. Les transcrits sont injectés dans des cytes XUS et leur localisation est surveillée. Premièrement, l'ARN est marqué avec des nucléotides fluorescents.Dans une réaction de transcription in vitro, l'ARN est ensuite chargé dans un appareil de microinjection. Les ovocytes sont placés dans une boîte de microinjection et soigneusement microinjectés. Enfin, les ovocytes sont mis en culture pour permettre la localisation de l'ARN avant leur observation au microscope confocal.Bonjour, je suis James Gagnan du laboratoire de la Dre Kimberly Mallory au Département de biologie moléculaire, biologie cellulaire et biochimie de l'Université Brown. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de visualiser la localisation subcellulaire des ARN dans les ovocytes de Xap. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'architecture des ARN et les facteurs protéiques nécessaires à la localisation des ARN durant le développement précoce des vertébrés.Commençons donc. Pour commencer cette procédure, transcrivez l'ARNm, qui est marqué de manière radioactive et fluorescente comme décrit dans le protocole écrit associé. Ajoutez du DS pour dégrader l'ADN matrice, puis arrêtez la réaction en ajoutant de l'EDTA.Éliminer les nucléotides non incorporés et autres petites molécules en faisant passer l'échantillon à travers une colonne G 50 par centrifugation. L'ARN est ensuite concentré par précipitation à l'éthanol, lavé et resuspendu. Après avoir déterminé la concentration par comptage scintillométrique, diluer l'ARN à 50 nano molaire et le conserver en aliquots de cinq microlitres à moins 80 degrés Celsius.Lorsque vous êtes prêt à effectuer la microinjection, décongelez un éloqua d'ARN marqué et dénaturez-le à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, centrifugez pendant 10 minutes à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse à température ambiante afin d'éliminer les particules, puis maintenez sur glace. Par la suite, isolez les cytes en découpant des fragments de xap post lavu d'ovaire dans un tube conique de 50 millilitres contenant 25 millilitres d'une solution à 3 milligrammes par millilitre.Collagénase dans un tampon phosphate de potassium 0,1 molaire à pH 7,4. Agiter doucement à 18 degrés Celsius en raison de variations entre lots. La durée du traitement à la collagénase peut varier et doit être surveillée attentivement par inspection visuelle.Pour assurer la défollification, continuer d'agiter pendant 15 minutes ou jusqu'à ce que les ovocytes soient visiblement séparés de l'ovaire, puis laisser les ovocytes se déposer au fond du tube conique. Éliminer la solution et la remplacer par du tampon MBSH. Répéter cette opération, effectuer deux autres lavages pour un total de trois lavages.Ensuite, triez manuellement les cytes de stade trois à quatre dans du tampon MBSH sous un microscope optique standard. Les cytes de stade trois sont complètement opaques, mais blancs. Les cytes de stade quatre sont légèrement plus grands et parsemés de pigments.Les cellules légèrement transparentes sont trop jeunes, tandis que celles qui sont complètement pigmentées ou présentent une distribution polarisée du pigment sont trop âgées. Enfin, préparez les aiguilles pour la microinjection en utilisant des capillaires de trois pouces et demi, étirez-les et affûtez-les afin d'obtenir des aiguilles dont le diamètre extérieur est d'environ 0,05 millimètre. Maintenant que les ovocytes ARNm et les aiguilles sont prêts, passez à la microinjection.Commencez par étalonner l'aiguille avec de l'eau désionisée afin de délivrer deux nanomètres par injection. Chargez l'aiguille à l'aide d'un micro-injecteur contrôlé par gaz et étalonnez la taille des gouttes à l'aide d'un micromètre. Après l'étalonnage, chargez par l'avant l'ARN à injecter dans l'aiguille. Ensuite, placez les ovocytes triés dans une boîte de microinjection contenant du tampon MBSH, la boîte comportant une couche de mousse de caoutchouc noire.Les cytes blancs se distinguent bien sur un fond noir. Injectez ensuite soigneusement chaque ovocyte avec deux litres d'ARN à 50 nanomolaire. Veillez à n'injecter chaque ovocyte qu'une seule fois et vérifiez régulièrement l'aiguille pour détecter tout colmatage une fois l'injection terminée.Expulsez l'ARN restant, rincez l'aiguille avec de l'eau désionisée et chargez l'ARN suivant pour l'injection. Après l'injection, transférez les cytes injectés dans une cavité d'une plaque stérile de 24 puits, jusqu'à mille. Les CYTES peuvent être cultivés par cavité.Retirez le tampon et remplacez-le par 400 microlitres de milieu de culture cellulaire par puits. Ensuite, placez la plaque de culture dans un récipient en plastique contenant une serviette en papier humide afin de maintenir un environnement humide pendant la culture, et incubez les ovocytes à 18 degrés Celsius pendant des durées variant entre huit et 48 heures après la période d'incubation souhaitée. Les ovocytes peuvent être préparés pour la microscopie après incubation des ovocytes injectés.Éliminer les ovocytes morts et placer les ovocytes survivants dans des vials en verre. Un taux de survie supérieur à 90 % des ovocytes est habituellement observé. Remplacer le tampon par le fixateur M-E-M-F-A et agiter doucement les cytes pendant 20 minutes.Protéger les ovocytes de la lumière du soleil pendant la fixation une fois la période de fixation terminée. Laver les ovocytes en éliminant le fixateur et en le remplaçant par un volume équivalent de tampon MBSH. Répéter ce lavage une fois supplémentaire pour un total de deux lavages.Ensuite, lavez les ovocytes dans du méthanol anhydre. Commencez par retirer la moitié du volume et remplacez-le par du méthanol. Répétez cette opération deux fois supplémentaires.Après ces lavages, éliminer toute la solution et la remplacer par du méthanol. Répéter ce lavage au méthanol une fois supplémentaire. Les ovocytes fixés et déshydratés peuvent être conservés à moins 20 degrés Celsius jusqu'au moment de l'imagerie.Avant l'imagerie, ajoutez le milieu de clarification de Marie à une boîte fluoro WPI à fond en verre afin de recouvrir la surface d'imagerie. Transférez soigneusement les ovocytes du méthanol vers la boîte fluoro, en minimisant le volume de méthanol transféré. Imagez les ovocytes sur un microscope confocal inversé ; un Zeiss LSM five 10 et un aica TCSs P donnent de bons résultats. Nous allons maintenant montrer quelques images représentatives de la localisation sous-cellulaire des ARN juste après la microinjection : l'ARN marqué au fluorophore peut être observé dans le noyau après huit heures de culture d'un témoin marqué au fluorophore.On observe que l'ARN est uniformément distribué dans le cytoplasme de l'ovocyte. Toutefois, un ARN marqué par fluorescence et contenant des séquences capables de recruter le système de transport peut être vu en cours de localisation subcellulaire vers le pôle végétatif de l'ovocyte. Nous venons de vous montrer comment micro-injecter des ARN marqués par fluorescence dans des ovocytes et observer la localisation de l'ARN par microscopie confocale.Lors de cette procédure, il est important d'utiliser des solutions traitées au diéthylpyrocarbonate (DEPC) afin d'éviter toute contamination par les ARN en culture, de maintenir vos cellules dans un milieu OCM contenant des antibiotiques et de protéger vos cellules de la lumière du soleil autant que possible afin d'éviter le photoblanchiment. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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