Obtention hémocytes de l'Hawaiian Bobtail Squid Scolopes Euprymna Et en observant leur adhésion aux bactéries symbiotiques et non symbiotiques

Après avoir retiré les seiches naines adultes de leurs aquariums et les avoir anesthésiées avec une solution d'eau de mer filtrée contenant 2 % d'éthanol, on les saigne par le vaisseau sanguin céphalique. À l'aide d'une seringue de calibre 26 et demi, l'hémolymphe extraite apparaît bleue.

En raison de la présence d'hémocyanine, les hématies sont diluées à une concentration souhaitée et aliquotées dans une lamelle à huit chambres. Une fois que les hématies se sont fixées sur la lamelle, elles sont marquées avec un traceur cellulaire orange, un colorant fluorescent, puis mises en présence de bactéries marquées avec la GFP, qui peuvent être visualisées au microscope à fluorescence. Bonjour, je suis Spencer Olm du Département de biologie moléculaire et cellulaire de l'Université du Connecticut.

Et je suis Andrew Collins du laboratoire domiciliaire de New York. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d'extraire l'hémolymphe, ou sang, du calmar hawaïen à tête ronde. Vous amorcer cet opis.

Les seiches naines sont des animaux nocturnes que l'on trouve au large des côtes d'Hawaï près des récifs coralliens, et elles utilisent la lumière produite par leur symbiose pour se camoufler la nuit, lorsqu'elles sortent chasser leur nourriture préférée, à savoir les crevettes. Nous utilisons cette association en laboratoire pour étudier la manière dont les bactéries bénéfiques colonisent les tissus animaux. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les interactions entre les composants du système immunitaire inné de l'hôte et son partenaire bactérien bioluminescent VIO ide.

Commençons. Avant d'extraire l'hémolymphe, anesthésiez un calamar adulte dans un bécher d'un litre contenant une solution fraîchement préparée de 2 % d'éthanol dans 500 millilitres d'eau de mer artificielle filtrée et stérilisée. Après 10 minutes, le calamar cessera de nager et ne répondra plus activement au toucher.

Cependant, une respiration persistante, indiquée par des mouvements du manteau, ainsi qu'une activité des chromatophores reflétant une activité des cellules pigmentaires, devraient toujours être observées. Versez une partie de la solution stérile d'eau de mer et d'éthanol contenue dans le bécher dans un plat de dissection standard en cire, puis immergez le calamar dans le plat, face ventrale vers le haut. À l’aide d’une micropipette standard d’un volume de 200 microlitres, écartez le siphon et le manteau afin d’exposer le principal vaisseau sanguin céphalique situé entre les deux yeux.

Utilisez une seringue stérile équipée d'une aiguille de calibre 26 et demi pour percer le vaisseau sanguin céphalique et prélever entre 50 et 100 microlitres d'hémolymphe ou entre 10 et 20 microlitres. Si l'animal doit servir de donneur à plusieurs reprises, placez l'hémolymphe dans un tube stérile de 1,5 millilitre sur de la glace. Notez que si cette étape est effectuée correctement, le sang de calmar doit apparaître bleu foncé.

Remettre l'animal dans un aquarium d'eau de mer normale pour le ranimer. Faire centrifuger l'hémolymphe dans une microcentrifugeuse à température ambiante afin de former un culot d'hémocytes, puis prélever le surnageant. Résuspender les hémocytes dans 500 microlitres de solution de Ringer pour seiche afin de les laver. Puis centrifuger à nouveau pour former un culot cellulaire et éliminer le surnageant.

Enfin, resuspendre les hémos dans la solution de Ringer pour calmar. Déterminer la concentration cellulaire à l’aide d’un cytomètre à hémos. Puis ajouter environ 2000 cellules à chaque chambre d’un couvre-objet en verre.

Laisser les cellules adhérer au verre pendant environ 10 minutes. À cette densité, les hemos doivent former une monocouche uniforme sur la surface du verre. Garder les hemos sur de la glace pendant la préparation des bactéries dans un agitateur orbital à 28 degrés Celsius.

Faire croître une ou plusieurs souches de bactéries Vireo contenant un gène rapporteur fluorescent vert jusqu'à la phase exponentielle moyenne dans un milieu marin contenant du Triton. À l'aide d'un spectrophotomètre, mesurer la densité optique de la culture à 600 nm pour déterminer la densité cellulaire, puis centrifuger les bactéries, éliminer le surnageant et resuspendre le culot. Ajouter les bactéries aux hémoctyes dans un millilitre de solution de Ringer pour seiche.

Dans les lames en verre compartimentées, déposer 100 000 bactéries par compartiment. Incuber les lames à température ambiante pendant une heure. Pour obtenir une liaison maximale, ajouter le traceur cellulaire orange à une concentration finale de 0,005 % afin de colorer le cytoplasme hémocytaire.

Incuber pendant 30 minutes, puis laver avec 150 microlitres de solution fraîche de Ringer de calmar. Ajouter un microscope confocal, observer les hérocytes marquées et les bactéries associées, puis dénombrer les bactéries sur toute la surface de l'hérocyte. Nous allons maintenant vous montrer quelques images représentatives d'hérocytes confrontés à la bactérie non symbiotique marquée avec la GFP, *Filo harveyi*, et au *Vibrio fischeri* symbiotique naturel du calmar.

Voici une image d'un site hémocytaire qui n'a pas été mis en présence de bactéries. La cellule apparaît rouge et s'est activée. On peut ainsi observer ses prolongements en forme de pseudopodes.

Lorsque la cellule est mise en présence de la bactérie symbiotique *Vibrio fischeri*, quelques bactéries sont observées liées à la surface de la cellule. En revanche, lorsque la bactérie non symbiotique *Vibrio harveyi* est exposée aux hémocytes, un nombre significativement plus élevé de bactéries s'associe à ces cellules. Nous venons de vous montrer comment extraire l'hémolymphe d'un calmar bobtail, isoler les hémocytes et les utiliser dans des expériences afin de caractériser l'adhésion bactérienne à ces cellules de calmar.

Ce protocole pourrait être modifié pour l'immunochimie en fixant les hémocytes après qu'ils adhèrent à la surface du lamelle. L'ARN, l'ADN et les protéines peuvent également être extraits une fois les hémocytes obtenus à partir de l'animal. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.