Name: Dissection dorganes sur le poisson zèbre pour adultes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-04T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Découvrez la dissection d'organes chez le poisson zèbre adulte pour la biologie du développement et les neurosciences. Cette méthode permet d'identifier et d'extraire les gonades, le cœur, le foie et le cerveau avec précision.

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Ce travail a été soutenu par NIH R01 HD050901 à MCM et la bourse de recherche postdoctorale American Cancer Society # PF-05-041-01-DDC à TG.

<ol><li> Un poisson zèbre mâle sera disséqué en premier, suivi par un poisson femelle. Avant de commencer la dissection, anesthésier un poisson dans 0,2% tricaïne puis l'euthanasier par incubation dans l'eau glacée pendant 15 minutes. </li><li> Commencez par une légère tapotant le poisson sec sur une serviette en papier et en le plaçant sur un tapis de dissection. Extérieurement, le poisson zèbre ont dorsale, caudale et anale et jumelé nageoires pectorales et pelviennes (figure 1). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Poissons mâles adultes avec des ailettes étiquetés. </li><li> Pin le poisson à travers le tapis disséquer la partie charnue de la queue et la partie ventrale de la cavité de l'œil. </li><li> Snip la peau sur le ventre du poisson juste en avant de la nageoire anale. Coupez la peau et les muscles sous-jacents le long du ventre de la nageoire anale à l'opercule (la couverture fort au cours des branchies) (figure 2, étape 1). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Étapes de retirer la peau et les muscles de la paroi du corps pour exposer les organes internes. </li><li> Ensuite, retirez l'opercule et la nageoire pectorale, y compris la ceinture scapulaire (l'épaisseur, de la région osseuse à la base de la nageoire) (figure 2, étape 2). Coupez la peau et les muscles sous-jacents commencent au-dessus du présent exposé arrière des branchies le long du côté du poisson et ensuite jusqu'à la nageoire anale (figure 2, étape 3). </li><li> Retirez soigneusement la peau et les muscles sous-jacents du côté du poisson. Beaucoup des organes internes sont maintenant visibles (figure 3). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Adulte poissons mâles avec paroi musculaire du corps et enlevé permettant la visualisation des organes internes. </li><li> Les testicules sont longues, blanc, organes pairs qui sont attachés à la paroi dorsale du corps. Supprimer un testicule et le placer dans un plat de PBS. Examiner les testicules avec la lumière réfléchie de visualiser les tubules séminifères (Figure 4), qui contiennent des kystes aux divers stades de développement des cellules germinales à partir de spermatides spermatagonia (Leal et al., 2009). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Dissection d'un testicule. Les structures blanches arrondie sont les tubules séminifères. </li><li> Ensuite, retirez le système gastro-intestinal de la cavité abdominale du poisson. Le foie peut être identifié par sa grande taille, la morphologie lobé, de couleur tannish, et la vascularisation importante. La vésicule biliaire, d'un vert translucide, sac rempli de liquide, et la rate, qui apparaît en rouge vif, se trouvent dans les viscères. </li><li> Séparée de l'intestin du reste des organes et l'étirer. L'antérieure, les régions moyenne et postérieure de l'intestin sont définis par la hauteur des plis épithéliaux (Wallace et al., 2005). </li><li> Placer un morceau de l'intestin dans le PBS et d'observer les replis épithéliaux en utilisant la lumière transmise. </li><li> Ensuite, examinez la vessie natatoire. La vessie natatoire se compose d'une chambre postérieure, qui est relié à l'œsophage par le conduit pneumatique, et une chambre antérieure, qui est relié à l'oreille interne par l'appareil de Weber (Finney et al., 2006). </li><li> Retirez et jetez la vessie natatoire. Détacher le poisson et re-broches c'est la face ventrale à disséquer les reins, qui est située le long de la paroi dorsale du corps. Le rein est une structure associée rose translucide avec l'aorte dorsale et les cellules pigmentées. Le rein est divisé en régions tête, le corps et la queue (figure 5). Disséquer un morceau du rein et de la placer dans du PBS. Démêler le tissu rénal de révéler les tubules rénaux. <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Localisation de la tête, le corps et la queue du rein le long de la paroi dorsale du corps. </li><li> Disséquer un poisson femelle. Comme décrit précédemment, euthanasier les poissons dans l'eau glacée et sécher avant l'épinglant sur le tapis de dissection. Enlevez la peau du côté des poissons comme précédemment démontré. L'ovaire est une structure bilobée qui est suspendu dans la cavité du corps par un mésovarium vascularisé. </li><li> Retirer un lobe de l'ovaire, le placer dans le PBS, et l'examiner à la lumière transmise. Les ovocytes peuvent être taquiné dehors à l'aide de fines aiguilles et ensuite mis en scène (figure 6, Selman et al., 1993). Phase I ovocytes sont environ 10 - 150 microns dans la taille et translucides. Etape II ovocytes sont environ 150 - 350 microns dans la taille et définie par l'apparition de granules corticaux. Etape III ovocytes sont de 350 à 750 microns et sont opaques à cause de l'accumulation de jaune d'oeuf. Mature étape ovocytes IV et V sont translucides et généralement ne se trouve pas dans les ovaires des femelles qui ont récemment estimé. <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig6.jpg" alt="Figure 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 6"> Figure 6. Étape en direct I, II, III et des ovocytes observé sous undisséquant microscope à lumière transmise. </li><li> Ensuite, disséquer le cœur du poisson. Le cœur est situé postérieure et ventrale de la branchie. Commencez par découper le cœur et l'ensemble des tissus environnants et de la placer dans du PBS. Soigneusement disséquer loin le tissu entourant le coeur, en faisant attention à ne pas endommager l'atrium délicate. </li><li> Placez le coeur disséqué dans la solution de Ringer à observer les battements du cœur. Identifier l'atrium, ventricule et bulbe artériel (figure 7, Hu et al., 2001). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig7.jpg" alt="Figure 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 7"> Figure 7. Disséqué coeur adulte. </li><li> Remplissez la dissection en enlevant le cerveau des poissons. Commencez par désépinglage le poisson et enlever la tête avec une lame de rasoir. Retirez le tissu mou autant que possible de la face ventrale du crâne avec une pince. Retirez les yeux à l'aide des ciseaux petit ressort. Pause ouvrir le crâne et enlever l'os de la face ventrale du cerveau. Maintenant, placez la tête dans un plat de PBS et enlever les os du crâne à partir de la peau et la face dorsale du cerveau. </li><li> Identifier les bulbes olfactifs, télencéphale, habénula, tectum optique, le cervelet et le bulbe (figure 8, Wullimann et al, 1996;. Schilling, 2002). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig8.jpg" alt="Figure 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 8"> Figure 8. Disséqué le cerveau de poisson zèbre adulte. Vue dorsale, antérieure vers le haut. </li></ol>

<ol><li>Finney, J. L., Robertson, G. N., McGee, C. A., Smith, F. M., Croll, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Autonomic+Innervation+of+the+Swim+Bladder+in+the+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio).</a> J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).</li>
<li>Hu, N., Yost, H. J., Clark, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+morphology+and+blood+pressure+in+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cardiac morphology and blood pressure in the adult zebrafish.</a> Anat Rec. 264, 1-12 (2001).</li>
<li>Leal, M. C., Cardoso, E. R., Nóbrega, R. H., Batlouni, S. R., Bogerd, J., França, L. R., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+and+stereological+evaluation+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+spermatogenesis+with+an+emphasis+on+spermatogonial+generations%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations.</a> Biol Reprod. 81, 177-187 (2009).</li>
<li>Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology+of+larval+and+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach+%28The+Practical+Approach+Series%29%22%5BJournal%5D)">The morphology of larval and adult zebrafish.</a> Zebrafish: A Practical Approach (The Practical Approach Series). Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Selman, K., Wallace, R., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+oocyte+development+in+the+Zebrafish%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Stages of oocyte development in the Zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J. Morphol. 218, 203-224 (1993).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mech Dev. 122, 157-173 (2005).</li>
<li>Wullimann, M. F., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain : a topological atlas. , Birkhäuser Verlag. (1996).</li>
</ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l&#39;Université de Pennsylvanie des soins des animaux et du Comité institutionnel d&#39;utilisation.

Réactifs: 0,2% (éthyl 3-aminobenzoate) tricaïne 200 mg de poudre tricaïne 97,9 ml d&#39;eau JJ ~ 1 ml 1 M Tris (pH 9) Ajuster le pH à 7,0 Tampon phosphate salin (PBS) 4,0 g de NaCl 0,1 g de KCl 100 ml à 0,1 M de tampon PO 4, pH 7,3 150 ml dH 2 O Solution de Ringer 6.7g de NaCl 0.2g KCl 0.2g CaCl 2 Hepes 1,2 g 1 LH 2 O Ajuster le pH à 7,2 Equipement: Dissection plat avec tapis Sciences Electron Microscopy Le catalogue # 70540 Vannas des ciseaux à ressort Outils Fine Science Le catalogue # 91500-09

dissection d&#39;organes sur le poisson zèbre pour adultes

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Au cours des 20 dernières années, le poisson-zèbre est devenu un organisme modèle puissant pour comprendre le développement des vertébrés et de la maladie. Bien que l&#39;analyse expérimentale de l&#39;embryon et la larve est vaste et la morphologie a été bien documenté, les descriptions de l&#39;anatomie de poisson zèbre pour adultes et des études sur le développement des structures pour adultes et les organes, ainsi que des techniques pour travailler avec les adultes sont absents. Les organes de la larve subissent d&#39;importants changements dans leur structure générale, la morphologie et la localisation anatomique lors de la larve de la transition pour adultes. Extérieurement, la larve transparente développe son modèle caractéristique de pigments pour adultes rayé et jumelé nageoires pelviennes, tandis qu&#39;à l&#39;intérieur, les organes subissent une croissance massive et le remodelage. En outre, le primordium bipotentielles gonades se développe en testicule ou l&#39;ovaire soit. Ce protocole identifie la plupart des organes de l&#39;adulte et démontre des méthodes pour la dissection du cerveau, les gonades, le système gastro-intestinal, le cœur et les reins du poisson-zèbre adulte. Les organes disséqués peut être utilisé pour l&#39;hybridation in situ, immunohistochimie, l&#39;histologie, l&#39;extraction d&#39;ARN, l&#39;analyse des protéines, et d&#39;autres techniques moléculaires. Ce protocole aidera à l&#39;élargissement des études dans le poisson zèbre pour inclure le remodelage des organes larvaires, la morphogenèse des organes spécifiques aux adultes et d&#39;autres enquêtes sur les systèmes d&#39;organes adultes.

Ce protocole décrit une procédure pour identifier et disséquer les organes de l&#39;zèbre adulte.

Dissection d&#39;organes sur le poisson zèbre pour adultes

Au cours des 20 dernières années, le poisson-zèbre est devenu un organisme modèle puissant pour comprendre le développement et les pathologies des vertébrés. Bien que les expériences...

Au cours des 20 dernières années, le poisson zèbre s'est imposé comme un organisme modèle puissant pour comprendre le développement et les maladies des vertébrés. Bien que la morphologie de l'embryon et de la larve ait été bien documentée, les descriptions de l'anatomie du poisson zèbre adulte ainsi que des techniques permettant de travailler avec des adultes font défaut. Le laboratoire de Mary Mullin à l'Université de Pennsylvanie étudie le développement des gonades et pratique régulièrement la dissection d'ovaires et de testicules provenant de poissons adultes.Ce protocole illustre la dissection des gonades, ainsi que l'identification et la dissection des autres systèmes organiques majeurs. Pour commencer, un poisson est anesthésié puis euthanasié, puis fixé sur un tapis de dissection. La peau et les muscles sous-jacents sont retirés du poisson afin d'exposer le cœur, le foie, l'intestin, la gonade et la vessie natatoire.Les organes internes sont retirés de la cavité corporelle. Pour un examen ou une expérimentation ultérieure, Tripti Gupta, du laboratoire de Mary Mullins du département de biologie cellulaire et du développement à l'Université de Pennsylvanie, identifiera de nombreux organes de l'adulte et démontrera comment les disséquer à partir d'un poisson-zèbre adulte. Pour plus de clarté et une dissection facilitée, le système gastro-intestinal, les testicules et le rein seront disséqués à partir d'un poisson-zèbre mâle, puis les ovaires, le cœur et le cerveau seront disséqués à partir d'un individu femelle.Pour réduire la quantité de nourriture dans l'intestin. Ne pas nourrir les poissons le jour précédant la dissection. Un poisson zèbre mâle sera disséqué.Tout d'abord, vous aurez besoin d'un tapis de dissection, de ciseaux de type Venice Spring, de pinces, d'épingles de dissection, d'une coupelle contenant du PBS et d'un poisson qui a été anesthésié et euthanasié. Séchez légèrement le poisson avec une serviette en papier et placez-le sur le côté. Sur un tapis de dissection, les poissons zèbres possèdent une nageoire dorsale unique et une nageoire anale, ainsi que des nageoires pelviennes et pectorales appariées.Utilisez des épingles de dissection pour fixer le poisson sur le tapis de dissection en piquant la partie charnue de la queue et la partie ventrale de l'orbite oculaire. À l’aide des ciseaux à ressort, faites une petite incision dans la peau du ventre du poisson juste en avant de la nageoire anale. Incisez la peau et le muscle sous-jacent le long du ventre, depuis la nageoire anale jusqu’à la couverture rigide des branchies appelée opercule.Utilisez les ciseaux et la pince pour prélever l'opercule et la nageoire pectorale, y compris la région osseuse épaisse située à la base de la nageoire, appelée ceinture pectorale. Retirez-les afin d'exposer les branchies. Incisez la peau et le muscle sous-jacent en partant de la région située au-dessus des branchies exposées, en longeant postérieurement le côté du poisson, puis descendez jusqu'à la nageoire anale.Retirer soigneusement la peau et le muscle sous-jacent sur le côté du poisson afin d'exposer les organes internes. Les testicules sont des organes longs, blancs et appariés qui sont attachés à la paroi corporelle dorsale. Prélever un testicule et le placer dans une boîte contenant du PBS à température ambiante. Retirer la graisse associée au testicule.Examinez le testicule avec une lumière réfléchie au microscope stéréoscopique afin de visualiser les tubules séminifères, qui contiennent des kystes présentant divers stades de cellules germinales en développement, allant des spermatogonies aux spermatozoïdes. Ensuite, retirez du cavité corporelle du poisson le système gastro-intestinal, la vésicule biliaire, une poche verte translucide remplie de liquide, ainsi que la rate, qui apparaît rouge vif et se trouve parmi les viscères. Le foie peut être identifié par sa morphologie lobée de grande taille, sa couleur brunâtre et sa vascularisation étendue.Séparez l'intestin du reste des organes et étirez-le. Les régions antérieure, moyenne et postérieure de l'intestin sont définies par la hauteur des plis épithéliaux, la région antérieure présentant les plis les plus élevés. Placez un fragment d'intestin dans du PBS et observez les plis épithéliaux au microscope en utilisant la lumière transmise.Examinez maintenant la vessie natatoire. La vessie natatoire est composée d'une chambre postérieure, reliée à l'œsophage par le conduit pneumatique, et d'une chambre antérieure, reliée à l'oreille interne par l'appareil de Weber. Retirez et jetez la vessie natatoire, retirez les épingles du poisson et remettez-le avec la face ventrale vers le haut afin de disséquer le rein.Le rein est une structure rose translucide située le long de la paroi corporelle dorsale et associée à l'aorte dorsale et aux cellules pigmentées. Le rein est divisé en régions céphalique, médiane et caudale. Bon, voici la partie céphalique, le corps du rein et la partie caudale.Voici l'aorte et ce sont les cellules pigmentées. Disséquez un morceau de rein et placez-le dans du PBS sous le microscope. Séparez délicatement le tissu rénal à l'aide des aiguilles afin de mettre au jour les tubules rénaux.Pour la dissection d'un poisson femelle, vous aurez besoin des mêmes outils qu'auparavant, ainsi que de quelques aiguilles fines, d'une lame de rasoir et d'une coupelle de solution de Ringer. Pour la dissection du cœur, séchez délicatement le poisson euthanasié et fixez-le sur le tapis de dissection. Comme précédemment, utilisez les mêmes techniques que précédemment pour retirer la peau du côté du poisson femelle.L'ovaire est une structure bilobée suspendue dans la cavité corporelle par un mésocarde vascularisé. Retirez un lobe de l'ovaire et placez-le dans du PBS. Examinez l'ovaire avec une lumière incidente au microscope.Les cytes peuvent être dissociées à l’aide d’aiguilles fines, puis classées selon leur stade en fonction de leur taille et de leur apparence. Ensuite, disséquez le cœur du poisson. Le cœur est situé en position postérieure et ventrale par rapport à la branchie.Commencez par découper le cœur ainsi que tous les tissus environnants et placez-le dans du PBS sous le microscope. Disséquez délicatement les tissus entourant le cœur, en prenant soin de ne pas endommager l'oreillette fragile. Placez le cœur disséqué dans une solution de Ringer et mettez-le sous le microscope.Pour observer les battements cardiaques, identifiez l'oreillette, le ventricule et le bulbe artériel. Pour accéder au cerveau, retirez les épingles du poisson et enlevez la tête à l'aide de la lame de rasoir. Retirez autant que possible les tissus mous du côté ventral du crâne à l'aide de pinces.Identifier le chiasma optique, puis retirer les yeux à l’aide de petites ciseaux à ressort. À l’aide de la pince, fracturer et ouvrir le crâne, puis retirer l’os situé du côté ventral du cerveau. Sectionner les nerfs crâniens avec les ciseaux à ressort.Si nécessaire, déplacez la tête dans une boîte de PBS. Retournez la tête et retirez la peau et les os du crâne du côté dorsal du cerveau au microscope, puis identifiez les bulbes olfactifs. Indiquez le céphalon, le tumeur optique ULA, le cervelet et la magula.Voici donc les bulbes olfactifs, le c&eacute;phalon turquoise, l'ula, le tubercule optique, le cervelet et la moelle, le cœur, le système gastro-intestinal, les gonades, la vessie natatoire, le rein et le cerveau. Ces organes ont été disséqués à partir de poissons-zèbres adultes. Ces organes peuvent désormais être utilisés pour l'hybridation in situ, l'immunohistochimie, l'histologie, l'extraction d'ARN ou d'autres techniques moléculaires.

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