Fenêtre sur un micromonde: Simple systèmes microfluidiques pour l'étude de Transports microbienne dans les milieux poreux

Nous démontrons que grâce à l’utilisation de dispositifs à puce écologique, les structures physiques et les charges de pression peuvent être maintenues constantes ou modifiées. Alors que l’influence de la chimie de surface, des propriétés fluides ou des caractéristiques des particules ou des microbes est étudiée systématiquement par des expériences de transport utilisant une protéine fluorescente verte non pathogène exprimant une souche bactérienne VIO, nous illustrons l’importance de la structure de l’habitat, des conditions d’écoulement et de la taille de l’inoculum sur les phénomènes de transport fondamentaux. Logiciel microfluidique : une vision convaincante d’un monde caché.

Bonjour, notre marqueur Dimitri de l’Institut Vanderbilt pour l’éducation à la restauration intégrative des biosystèmes de l’Université Vanderbilt. Et je suis David Schafer, ingénieur en recherche et développement ici aux Laboratoires Viro. Bonjour, je suis Leslie Sho du Département des matériaux chimiques et de l’ingénierie biomoléculaire du Centre des sciences et de l’ingénierie de l’environnement de l’Université du Connecticut, et j’ai ajouté Dicot également de Zebra.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de création de réseaux d’habitats microfluidiques modulaires pour la recherche fondamentale en sciences de l’environnement et en ingénierie. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les effets des structures à l’échelle micrométrique sur les interactions de transport microbien dans les milieux forestiers. Alors commençons.

La première étape de la création d’un dispositif microfluidique consiste à dessiner une disposition bidimensionnelle de l’appareil dans un dessin assisté par ordinateur ou un programme de CAO. Nous avons utilisé AutoCAD, mais d’autres programmes de dessin sont également disponibles, tels que clue in ou coral draw. Le logiciel permet au concepteur de reproduire fidèlement des structures physiques dans un champ macroscopique, tandis que les caractéristiques individuelles sont définies à une résolution inférieure à cinq microns.

À partir du dessin CAO, un masque photographique est créé. Nous utilisons un masque au chrome fabriqué par Advanced Reproductions Corporation, à l’extrémité nord du Massachusetts. Les prochaines étapes de la production d’un dispositif microfluidique se déroulent dans une salle blanche pour créer un master.

Une plaquette de silicium propre est recouverte d’une résine photosensible dans un codeur de spin. Tout d’abord, la plaquette est fixée à la plate-forme du codeur de spin et quelques grammes de résine photosensible SU 8 20 25 sont versés au centre de la plaquette. Ensuite, la plaquette est filée pour un premier cycle d’étalement de 15 secondes à 500 tr/min, suivi d’un cycle de revêtement mince de 4 000 tr/min pendant 35 secondes.

Après l’essorage, la plaquette est placée sur une plaque chauffante pendant 10 minutes à 95 degrés Celsius pour volatiliser l’excès de solvant. La dernière étape de la préparation de la plaquette consiste à retirer la perle de bord. Pour ce faire, la plaquette est renvoyée dans le codeur de spin et applique un flux constant de dissolvant de vitesse de bord SUA sur le bord extérieur de la plaquette enrobée.

L’étape suivante consiste à modéliser la résine photosensible par une exposition sélective à la lumière UV. Tout d’abord, la plaquette revêtue est placée sur une surface plane et le masque chromé est placé directement sur le dessus. Le film de masquage rouge rubylithe bloque le transfert des motifs en dehors de la zone souhaitée.

Ensuite, une dose de 300 milli JUUL par centimètre carré de lumière UV est délivrée à la plaquette enrobée à travers le masque à l’aide d’un système de transport par tache. Enfin, la plaquette est cuite pendant 15 minutes à 95 degrés Celsius pour réticuler les régions exposées à la lumière de la résine photosensible, les rendant insolubles. La dernière étape de la création du master consiste à supprimer les régions non réticulées de la résine photosensible, laissant derrière elles des structures en relief surélevées.

Tout d’abord, la plaquette est renvoyée une fois de plus dans le codeur de spin et est recouverte par la solution de développement. Le révélateur est laissé sur la plaquette enrobée pendant environ cinq minutes, puis est essoré, ce qui donne un motif clairement évident sur la plaquette. Tout résidu restant est lavé en faisant gicler de l’alcool isopropylique sur la plaquette en rotation.

Nous utilisons une vitesse d’essorage de 2200 tr/min pour cette étape pendant environ cinq à 10 secondes. Enfin, le master fini est séché à l’aide d’un flux d’azote gazeux et stocké dans un plat jusqu’à ce qu’il soit nécessaire pour couler un appareil. Nous fabriquons des dispositifs microfluidiques en utilisant l’élastomère de silicone polyméthyl alane.

Tout d’abord, le matériau de base et l’agent de durcissement sont livrés dans un rapport de poids de 10 pour un dans un gobelet en plastique. Ensuite, le mélange est mélangé. Andy a fait des bulles à l’aide d’un mélangeur de conditionnement AR 100.

Une fois le cycle terminé, le PDMS liquide est versé uniformément sur le maître. La boîte contenant le PDMS maître et non durci est ensuite placée dans une chambre à vide pour dégazer. Les bulles de polymère apparaissent presque immédiatement.

Le dégazage se poursuit jusqu’à ce que toutes les bulles disparaissent. Le plat est placé dans un four plat à 65 degrés Celsius pendant au moins quatre heures pour permettre pleinement la réticulation des polymères. Ensuite, le PDMS durci est soigneusement retiré du maître réutilisable.

Les quatre premiers bords sont coupés bien en dehors de la région à motifs à l’aide d’un scalpel, l’appareil est décollé de la plaquette à motifs à l’aide d’une pince à épiler. Les bords de l’appareil peuvent être coupés à l’aide de cisailles si vous le souhaitez. Une sous-section de l’appareil peut être séparée du reste de l’appareil PDMS moulé.

Ensuite, des trous d’accès sont percés à travers le PDMS. Nous utilisons des poinçons de biopsie qui sont disponibles dans le commerce en plusieurs tailles différentes montés sur un petit arbre. Les noyaux PDMS de presse sont retirés à l’aide de pinces.

Enfin, l’appareil découpé et perforé est nettoyé à l’aide d’alcool isopropylique et d’un tampon en polypropylène à embout en mousse. L’appareil est séché à l’azote puis placé dans le four pour éliminer toute trace de solvant. La dernière étape de la fabrication d’un dispositif microfluidique consiste à coller le PDMS sur un substrat de lame de verre, puis à le remplir d’abord de liquide.

Le dispositif PDMS et une lame de verre sont placés avec l’espacement de la surface de liaison dans un nettoyeur plasma. Dans cette expérience, nous utilisons un nettoyeur plasma Herrick PDC 32 G. Une fois que le vide est établi et que le plasma bleu-violet est visible, une minuterie est réglée sur 30 secondes.

Le générateur de plasma est éteint. La chambre est repressurisée, et l’appareil et le curseur retirés de la chambre et les surfaces de liaison sont mis en contact. Lors du retrait des composants activés de la chambre, il est important de se déplacer rapidement afin que les surfaces restent activées.

Une légère pression permet d’assurer une bonne liaison. La qualité de la liaison est vérifiée en tirant sur un coin avec une pince. L’intérieur hydrophile peut ensuite être facilement rempli d’une solution aqueuse telle qu’un média tampon ou désionisée.

Le fluide d’eau est administré dans chaque puits de source et à travers la cellule d’écoulement microporeuse correspondante. Une fois que toutes les chambres sont pleines, une fine couche de PDMS durci est placée sur l’ensemble de l’appareil pour aider à retarder l’évaporation et maintenir la stérilité. Pour calibrer le débit entraîné par la pression dans l’appareil, préchargez les cellules d’écoulement microstructurées avec de l’eau désionisée, placez un module de débit, qui agit comme une interface de distribution de fluide et un joint stérile sur le dessus de l’appareil.

Ce module de débit peut être utilisé seul ou connecté à un réservoir externe contenant un fluide, tel qu’une seringue en plastique. Connectez un réservoir contenant un liquide tel qu’une seringue en plastique ou le module de débit à l’entrée amont. Bien maintenir la hauteur du fluide dans le réservoir au-dessus de la hauteur de l’aval.

Eh bien, la différence de hauteur entre le réservoir en amont et chaque puits de sortie en aval définit la force motrice de l’écoulement sous pression pour quantifier les débits à travers les appareils. Une aiguille à extrémité émoussée de calibre 25 est utilisée pour prélever des échantillons des puits en aval à intervalles réguliers. Par exemple, nous prélevons des échantillons toutes les 15 à 20 minutes en notant soigneusement le temps réel écoulé entre les échantillons.

Le poids de la seringue est enregistré avant et après l’échantillonnage sur une balance analytique. Le volume global en fonction du temps agrégé est représenté avec une pente égale au débit massique moyen. La grande section transversale du réservoir d’entrée par rapport aux puits de sortie permet d’éviter que les débits ne changent de manière significative à mesure que le fluide se déplace à travers les appareils, tracent le volume échantillonné sur l’axe Y en fonction du temps d’échantillonnage sur l’axe X.

Dans un programme graphique simple tel qu’Excel, pour obtenir la pente de la ligne, la pente est utilisée pour le débit volumétrique moyen. Une solution diluée de trois billes de latex fluorescentes micromolaires avec des surfaces carboxy, YG et YG unies est utilisée pour visualiser l’écoulement et étudier les interactions de surface. Tout d’abord, une solution de billes est préparée dans de l’eau désionisée à une concentration de 0,01 % de solides.

La solution est ajoutée aux puits en amont et le module d’écoulement est rattaché à zu. L’écoulement des billes d’écoulement est visualisé sur une période d’une heure et enregistré environ toutes les 10 minutes sur un microscope fluorescent Zeiss AIOt 25, équipé d’une caméra monochrome MITx BCEB 0 1 3 U. Les images individuelles sont capturées en succession rapide et assemblées en films à l’aide d’un logiciel tel que Image J avec éclairage par fluorescence et éclairage par lumière transmise.

Les perles et les structures sont toutes deux visibles. Lorsque la lumière transmise est bloquée, seules les billes fluorescentes brillantes sont visibles. Des billes fixes déposées le long de la surface inférieure ou fixées aux collecteurs sont évidentes dans tout l’appareil.

Pour les expériences utilisant des bactéries vivantes, une culture telle que l’espèce Vibrio, une protéine fluorescente verte non pathogène exprimant une bactérie exprimant une bactérie est préparée. Tout d’abord, une culture mère est retirée du stockage libre et profond. Une fiole contenant un milieu de croissance stérile est inoculée avec la culture mère.

À l’aide d’une boucle d’inoculation jetable, le ballon est incubé pendant la nuit en agitant pour obtenir une culture en phase stationnaire avec une concentration d’environ 10 à neuf cellules par millilitre. En fonction de l’application, la concentration initiale de bactéries peut être quantifiée plus précisément. Un dispositif microfluidique rempli d’un tampon stérile est préparé.

Ensuite, le liquide stérile dans les puits en amont est vidé et remplacé par 20 microlitres de la culture bactérienne. À l’aide d’une pipette, les bactéries sont ensemencées dans le dispositif à l’aide d’une aspiration douce avec une seringue sur les puits de sortie. Après l’incubation, la quantité de bactéries dans les puits peut être déterminée en quantifiant l’intensité de fluorescence de chaque puits après la colonisation. Le puits d’entrée en amont est vidé comme auparavant et remplacé par un tampon rincé avec 25 parties pour mille sels.

Une légère pression d’eau de mer artificielle est appliquée aux puits en amont à l’aide d’une seringue qui rince les cellules d’écoulement individuelles avec 20 à 40 microlitres de solution tampon. C’est environ 100 à 200 fois le faible volume de la partie microfluidique du sol de la cellule d’écoulement après le rinçage initial. La perfusion à long terme des bactéries à travers le milieu poreux est obtenue en utilisant le module d’écoulement, exactement comme indiqué précédemment.

Des images fluorescentes et en lumière blanche de la croissance et du transport des bactéries peuvent être mesurées au fil du temps. Dans cette expérience, les images sont prises toutes les 15 à 20 heures pendant une période de sept jours avec une caméra CCD à cinq couleurs refroidie à partir de l’encre d’imagerie Q. Nos appareils peuvent également être utilisés pour étudier les effets de la structure physique de l’habitat sur la fourniture d’un refuge aux bactéries contre la prédation par les protozoaires. Vu.

Voici des bactéries dans une cellule d’écoulement microporeuse avec le protozoaire cilié beaucoup plus grand eulo visible dans l’appareil broutant des bactéries. Dans l’analyse de l’écoulement du fluide dans le dispositif microfluidique, nous trouvons que le débit moyen est de 0,71 microlitre par minute pour une charge de pression de 40 millimètres. En augmentant la pression de pression à 60 millimètres, le débit a augmenté proportionnellement à 1,04 microlitre par minute.

Lors de l’utilisation de billes avec différentes chimies de surface dans l’appareil, nous observons une plus grande accumulation de billes non carboxylées à la surface de l’appareil. Alors que les billes de six à 10 millimètres de diamètre étaient beaucoup plus susceptibles de s’entraîner dans les ouvertures de pores plus petites. Des débits plus rapides causés par une pression hydrostatique plus élevée ont entraîné une diminution de la rétention et de l’entraînement des billes, comme on pourrait s’y attendre pour analyser la croissance bactérienne dans le dispositif microfluidique eco chipp.

Nous notons les différences qualitatives d’intensité d’image dans différents secteurs de l’appareil. L’intensité de la fluorescence peut être quantifiée comme un indicateur de la biomasse microbienne dans le canal. Dans les expériences en cours, nous observons que les forces de cisaillement continues des conditions de faible débit semblent provoquer l’agrégation bactérienne et la formation de troupeaux, comme le montrent ces images, Nous venons de vous montrer comment créer et utiliser des dispositifs microfluidiques simples pour mesurer l’échelle des particules, le transport des collisions à travers des milieux poreux ou pour étudier les interactions microbiennes dans des habitats microstructurés.

Lors de la réalisation d’études à l’aide de cellules d’écoulement, il est important de tenir compte de la flottabilité des billes et de la chimie de surface des colloïdes et des collecteurs. Lors de l’adaptation au régime microfluidique, les effets de surface peuvent dominer les phénomènes observés. Pratiquement n’importe quelle structure physique peut être incorporée dans la conception de cellules à flux microfluidique.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.