Fenêtre sur un micromonde: Simple systèmes microfluidiques pour l'étude de Transports microbienne dans les milieux poreux

Nous démontrons qu'à l'aide de dispositifs à puce écologique, les structures physiques et les charges de pression peuvent être maintenues constantes ou être modulées. Alors que l'influence de la chimie de surface, des propriétés des fluides ou des caractéristiques des particules ou des micro-organismes est étudiée de manière systématique par des expériences de transport utilisant une souche bactérienne non pathogène VIO exprimant une protéine fluorescente verte, nous illustrons l'importance de la structure de l'habitat, des conditions d'écoulement et de la taille de l'inoculum sur les phénomènes fondamentaux de transport. Un logiciel microfluidique offrant une vision saisissante d'un monde caché.

Bonjour, je suis Dimitri Marker de l'Institut Vanderbilt pour l'enseignement de la restauration des biosystèmes intégratifs à l'Université Vanderbilt. Et moi, je suis David Schafer, ingénieur en recherche et développement au sein des laboratoires Viro. Bonjour, je suis Leslie Sho du Département de génie chimique, des matériaux et de génie biomoléculaire au Centre des sciences et de l'ingénierie environnementales de l'Université du Connecticut, et je suis également Dicot, également de Zebra.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant de créer des réseaux modulaires de microenvironnements microfluidiques pour des recherches fondamentales en sciences environnementales et en ingénierie. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire afin d'étudier les effets des structures à l'échelle micrométrique sur les interactions microbiennes impliquant le transport dans des milieux forestiers. Commençons donc.

La première étape dans la création d'un dispositif microfluidique consiste à dessiner une disposition en deux dimensions du dispositif à l'aide d'un logiciel de dessin assisté par ordinateur ou CAO. Nous avons utilisé AutoCAD, mais d'autres logiciels de dessin sont également disponibles, tels que ClueIn ou CorelDRAW. Ce logiciel permet au concepteur de reproduire fidèlement des structures physiques sur toute la surface macroscopique, tandis que les caractéristiques individuelles sont définies avec une résolution inférieure à cinq micromètres.

À partir du dessin CAO, un masque photographique est créé. Nous utilisons un masque au chrome fabriqué par Advanced Reproductions Corporation, dans le nord du Massachusetts. Les étapes suivantes de la fabrication du dispositif microfluidique ont lieu en salle blanche afin de créer un modèle maître.

Une plaquette de silicium propre est recouverte de résine photosensible à l'aide d'un appareil de dépôt par rotation. Tout d'abord, la plaquette est fixée sur la plateforme de l'appareil et quelques grammes de résine photosensible SU 8 20 25 sont versés au centre de la plaquette. Ensuite, la plaquette est tournée pendant un cycle initial d'extension de 15 secondes à 500 tr/min, suivi d'un cycle de dépôt mince à 4 000 tr/min pendant 35 secondes.

Après la rotation, la plaquette est placée sur une plaque chauffante pendant 10 minutes à 95 degrés Celsius afin de faire s'évaporer le solvant en excès. La dernière étape de la préparation de la plaquette consiste à éliminer le bourrelet de bord. Cette opération s'effectue en replaçant la plaquette dans le spin coater et en appliquant un flux continu de réactif de retrait du bord SUA sur le bord extérieur de la plaquette enduite.

L'étape suivante consiste à dessiner le motif sur la résine photosensible par une exposition sélective à la lumière UV. Tout d'abord, la plaquette recouverte est placée sur une surface plane et le masque au chrome est posé directement dessus. Le film masquant rouge Rubylith empêche le transfert des motifs en dehors de la zone souhaitée.

Ensuite, une dose de lumière UV de 300 milli JUUL par centimètre carré est appliquée sur la plaquette enduite à travers le masque à l'aide d'un système de projection ponctuelle. Enfin, la plaquette est chauffée pendant 15 minutes à 95 degrés Celsius afin de réticuler les régions du photo-résist exposées à la lumière, les rendant ainsi insolubles. La dernière étape dans la fabrication du master consiste à éliminer les régions non réticulées du photo-résist, laissant apparaître des structures en relief saillantes.

Tout d'abord, la plaquette est de nouveau replacée dans le spin coater et recouverte de la solution de révélateur. Le révélateur reste sur la plaquette recouverte environ cinq minutes, puis est éliminé par centrifugation, ce qui donne un motif clairement visible sur la plaquette. Tout résidu restant est éliminé en pulvérisant de l'alcool isopropylique sur la plaquette en rotation.

Nous utilisons une vitesse de rotation de 2200 tr/min pour cette étape pendant environ cinq à dix secondes. Enfin, le moule fini est séché à l’aide d’un courant de gaz azote et conservé dans une boîte jusqu’à son utilisation pour la fabrication d’un dispositif. Nous fabriquons des dispositifs microfluidiques à l’aide de l’élastomère de silicone polyméthyl alane.

Tout d'abord, le matériau de base et l'agent de durcissement sont introduits dans un gobelet en plastique selon un rapport pondéral de 10 pour 1. Ensuite, le mélange est homogénéisé à l'aide d'un mélangeur de conditionnement Thinky AR 100, en veillant à éviter les bulles.

Une fois le cycle terminé, du PDMS liquide est versé uniformément sur le moule maître. La boîte contenant le moule maître et le PDMS non polymérisé est ensuite placée dans une chambre à vide pour dégazer. Les bulles de polymère apparaissent presque immédiatement.

La dégazéification se poursuit jusqu'à la disparition complète des bulles. Le plat est placé dans un four de niveau à 65 degrés Celsius pendant au moins quatre heures afin de permettre complètement la réticulation du polymère. Ensuite, le PDMS durci est soigneusement retiré du moule maître réutilisable.

Les quatre premiers bords sont découpés bien en dehors de la zone structurée à l'aide d'un scalpel, puis le dispositif est décollé de la tranche structurée à l'aide de pinces. Les bords du dispositif peuvent être taillés à l'aide de ciseaux si désiré. Une sous-section du dispositif peut être séparée du reste du dispositif en PDMS moulé.

Ensuite, des trous d'accès sont percés dans le PDMS. Nous utilisons des poinçons de biopsie disponibles commercialement en plusieurs tailles, montés sur un petit arbre. Les cylindres de PDMS sont retirés à l’aide de pinces.

Enfin, le dispositif découpé et perforé est nettoyé à l’aide d’alcool isopropylique et d’un coton-tige en polypropylène à embout en mousse. Le dispositif est séché à l’aide d’azote, puis placé au four pour éliminer toute trace de solvant. La dernière étape dans la fabrication d’un dispositif microfluidique consiste à lier le PDMS à un substrat en lame de verre, puis à le remplir de fluide en premier.

Le dispositif en PDMS et une lame de verre sont placés avec la surface de collage orientée vers le haut dans un nettoyeur à plasma. Dans cette expérience, nous utilisons un nettoyeur à plasma Herrick PDC 32 G. Une fois le vide établi et le plasma bleu-violet visible, un minuteur est réglé sur 30 secondes.

Le générateur de plasma est éteint. La chambre est repressurisée, puis le dispositif et le curseur sont retirés de la chambre et les surfaces de collage sont mises en contact. Lors du retrait des composants activés de la chambre, il est important d'agir rapidement afin que les surfaces restent activées.

Une pression douce permet de garantir une bonne adhérence. La qualité de l'adhérence est vérifiée en tirant sur un coin avec une pince. L'intérieur hydrophile peut alors être facilement rempli avec une solution aqueuse telle qu'un tampon ou de l'eau déionisée.

Un liquide aqueux est administré dans chaque puits source et à travers la cellule d'écoulement microporeuse correspondante. Une fois toutes les chambres remplies, une fine couche de PDMS durci est placée sur l'ensemble du dispositif afin de ralentir l'évaporation et de maintenir l'asepsie. Pour étalonner l'écoulement induit par pression dans le dispositif, pré-remplissez les cellules d'écoulement microstructurées avec de l'eau déionisée, puis placez un module d'écoulement, qui sert d'interface de distribution de fluide et de scellement stérile, au-dessus du dispositif.

Ce module d'écoulement peut être utilisé seul ou raccordé à un réservoir externe contenant un fluide, tel qu'une seringue en plastique. Connectez un réservoir contenant un liquide, comme une seringue en plastique ou le module d'écoulement, à l'entrée amont. Veillez à maintenir le niveau de fluide dans le réservoir au-dessus de la hauteur de la sortie aval.

Eh bien, la différence de hauteur entre le réservoir amont et chaque puits de sortie aval définit la force motrice pour l'écoulement sous pression, permettant de quantifier les débits à travers les dispositifs. Une aiguille de calibre 25 à extrémité émoussée est utilisée pour prélever des échantillons dans les puits aval à intervalles réguliers. Par exemple, nous prélevons des échantillons toutes les 15 à 20 minutes en notant soigneusement le temps écoulé réel entre chaque prélèvement.

Le poids de la seringue est enregistré avant et après l'échantillonnage sur une balance analytique. Le volume cumulé est représenté en fonction du temps cumulé, la pente correspondant au débit massique moyen. La grande section transversale du réservoir d'entrée par rapport aux puits de sortie contribue à empêcher que les débits changent de manière significative pendant que le fluide circule à travers les dispositifs ; représenter graphiquement le volume échantillonné sur l'axe des Y en fonction du temps d'échantillonnage sur l'axe des X.

Dans un programme de tracé graphique simple tel qu'Excel, afin d'obtenir la pente de la droite, celle-ci est utilisée pour déterminer le débit volumétrique moyen. Une solution diluée de billes de latex fluorescentes à trois micromoles, présentant des surfaces carboxy, YG et YG simple, est utilisée pour visualiser l'écoulement et étudier les interactions de surface. Premièrement, une solution de billes est préparée dans de l'eau déionisée à une concentration de 0,01 % de matières solides.

La solution est ajoutée aux puits en amont et le module d'écoulement est réattaché à zu. L'écoulement des billes est visualisé pendant une heure et enregistré environ toutes les 10 minutes sur un microscope fluorescent Zeiss AIOt 25, équipé d'une caméra monochrome MITx BCEB 0 1 3 U. Des images individuelles sont capturées en succession rapide et assemblées en vidéos à l'aide d'un logiciel tel qu'Image J, en utilisant une illumination par fluorescence et une illumination en lumière transmise.

Les billes et les structures sont toutes deux visibles. Lorsque la lumière transmise est bloquée, seules les billes fluorescentes brillantes sont visibles. Les billes immobiles déposées sur la surface inférieure ou attachées aux collecteurs sont visibles dans tout le dispositif.

Pour les expériences utilisant des bactéries vivantes, une culture telle qu'une espèce de Vibrio, une bactérie non pathogène exprimant une protéine fluorescente verte, est préparée. Tout d'abord, une culture stock est prélevée à partir d'un stockage en congélation profonde. Un flacon contenant un milieu de croissance LB stérile est ensemencé avec la culture stock.

À l’aide d’un anneau de prélèvement jetable, le flacon est incubé toute la nuit sous agitation afin d’obtenir une culture en phase stationnaire avec une concentration d’environ 10 puissance neuf cellules par millilitre. Selon l’application, la concentration initiale de bactéries peut être quantifiée plus précisément. Un dispositif microfluidique rempli de tampon stérile est préparé.

Ensuite, le liquide stérile des puits en amont est vidé et remplacé par 20 microlitres de la culture bactérienne. À l’aide d’une pipette, les bactéries sont ensemencées dans le dispositif en appliquant une aspiration douce à l’aide d’une seringue sur les puits de sortie. Après incubation, la quantité de bactéries dans les puits peut être déterminée en quantifiant l’intensité de fluorescence de chaque puit suite à la colonisation. Le puit d’entrée en amont est vidé comme précédemment et remplacé par un tampon lavé avec des sels à 25 parties par millier.

Une pression douce d'eau de mer artificielle est appliquée aux puits en amont à l'aide d'une seringue, rincant individuellement chaque cellule d'écoulement avec 20 à 40 microlitres de solution tampon. Cela représente environ 100 à 200 fois le volume réduit de la portion de sol microfluidique de la cellule d'écoulement après le rinçage initial. La perfusion prolongée de bactéries à travers le milieu poreux est réalisée à l'aide du module d'écoulement exactement comme indiqué précédemment.

Des images en lumière fluorescente et en lumière blanche de la croissance et du transport bactériens peuvent être mesurées au fil du temps. Dans cette expérience, des images sont prises toutes les 15 à 20 heures pendant une période de sept jours à l’aide d’une caméra CCD refroidie couleur cinq de Q imaging ink. Nos dispositifs peuvent également être utilisés pour étudier les effets de la structure physique de l’habitat sur la protection offerte aux bactéries contre la prédation par les protozoaires.Seen.

Voici des bactéries dans une cellule d'écoulement microporeuse, avec les protozoaires ciliés beaucoup plus grands, Eulo, visibles dans le dispositif en train de brouter les bactéries. Lors de l'analyse de l'écoulement du fluide dans le dispositif microfluidique, nous trouvons que le débit moyen est de 0,71 microlitre par minute pour une hauteur de pression de 40 millimètres. En augmentant la hauteur de pression à 60 millimètres, le débit augmente proportionnellement à 1,04 microlitre par minute.

Lorsqu'on utilise des billes présentant différentes chimies de surface dans le dispositif, on observe une accumulation plus importante de billes non carboxylées à la surface du dispositif. Les billes de six à 10 millimètres de diamètre avaient quant à elles beaucoup plus tendance à être piégées dans les ouvertures de pores plus petites. Des débits plus rapides, provoqués par une pression hydrostatique plus élevée, ont entraîné une réduction du piégeage et de la rétention des billes, comme on pouvait s'y attendre lors de l'analyse de la croissance bactérienne dans le dispositif microfluidique eco chipp.

Nous notons les différences qualitatives de l'intensité des images dans différents secteurs du dispositif. L'intensité de fluorescence peut être quantifiée comme un indicateur de la biomasse microbienne dans le canal. Dans des expériences en cours, nous observons que les forces de cisaillement continues des conditions d'écoulement faible semblent provoquer l'agrégation bactérienne et la formation de flocons, comme cela est visible sur ces images. Nous venons de vous montrer comment créer et utiliser des dispositifs microfluidiques simples afin de mesurer l'échelle des particules, le transport par collision à travers des milieux poreux, ou d'étudier les interactions microbiennes dans des habitats à structure microscopique.

Lors de la réalisation d'études utilisant des cellules d'écoulement, il est important de prendre en compte la flottabilité des billes ainsi que la chimie de surface des colloïdes et des collecteurs. Lorsqu'on réduit l'échelle au régime microfluidique, les effets de surface peuvent dominer les phénomènes observés. Pratiquement n'importe quelle structure physique peut être intégrée dans la conception de cellules d'écoulement microfluidiques.

Voilà donc tout ce qu'il y a à savoir. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.