L'importance de la concentration de protéines correct pour Cinétique et Détermination d'affinité en analyse structure-fonction

L'objectif général de cet article vidéo est de fournir des réponses aux deux questions suivantes. Premièrement, peut-on rendre les études des interactions protéiques plus fiables en mesurant la fraction d'un échantillon de protéine qui est réellement capable de se lier à une autre protéine ? Deuxièmement, comment l'analyse cinétique peut-elle nous permettre de mieux comprendre les relations entre structure et fonction ?

Ces deux questions seront abordées dans une expérience mettant en œuvre le Corp X 100, un instrument qui détecte les interactions protéiques en temps réel sans utiliser d'étiquettes. Cette expérience examinera l'interaction de la cystatine B bovine avec la protéase cystéique papaine ; la structure cristalline des deux protéines en complexe indique plusieurs résidus impliqués dans la liaison à la protéase, permettant ainsi de déterminer comment chacun des résidus interagissant affecte l'interaction entre la cystatine B et la papaine. Plusieurs variants de la cystatine B sont produits par mutagenèse dirigée.

Dans de telles expériences, il existe toujours un risque que les protéines recombinantes ne se replient pas correctement, s'agrègent ou se dégradent, conduisant à des résultats incorrects et non reproductibles. VIACORE X 100 est capable de déterminer la fraction de protéine disponible pour la liaison par une analyse de concentration sans étalonnage, abrégée CFCA. Cette approche permet de déterminer la concentration de protéine conservant une activité de liaison, même en l'absence d'étalons de calibration.

La CFCA sera utilisée ici pour déterminer la concentration des variants de la cystatine B. Ces données seront ensuite utilisées comme entrée pour déterminer la cinétique de liaison des variants de la cystatine B à la Pépin, également évaluée à l'aide de BOR X 100. Bonjour, je suis CLA gram de GE Healthcare en Suède.

Aujourd'hui, ma collègue Eva Pool va vous montrer comment réaliser une analyse des relations structure-fonction à l'aide de BOR X 100. Les protéines recombinantes peuvent présenter un repliement incorrect ou perdre leur activité de liaison au fil du temps, et ce comportement ne peut pas être détecté par des méthodes reposant sur la mesure de la concentration totale. Cela peut en effet conduire à des données cinétiques erronées après la détermination des concentrations par analyse de concentration sans étalonnage. B.A core X 100 est utilisé pour analyser la cinétique et l'affinité de l'interaction entre des variants de la cystatine B et la pepsine.

Ces paramètres permettront de mieux comprendre le mécanisme de liaison. Nous commençons par une brève explication de la conception expérimentale ; commençons donc. L'interaction entre la cystine, la protéase, la papaine et l'inhibiteur cystatine B est dominée par des contacts hydrophobes, comme le révèle la structure cristalline des deux protéines en complexe.

Depuis le côté de l'inhibiteur, les zones de contact sont les extrémités N et C terminales et deux boucles en épingle à cheveux. Dans cette étude, quatre mutants sont analysés, chacun comportant une mutation de la cystéine en trois positions vers la sérine, introduite afin d'empêcher la dimérisation de la cystatine B. Sur la base du contexte révélé par la structure cristalline, la leucine 73 a été mutée en glycine, l'histidine 75 en glycine, et la tyrosine 97 a été remplacée par une alanine. Les deux mutations en glycine ont été introduites afin d'évaluer l'importance des chaînes latérales de l'histidine 75 et de la leucine 73 pour la liaison à la pepsine ; le résidu de tyrosine a été muté en alanine pour étudier l'interaction entre l'extrémité C terminale de la cystatine B et la pepsine.

Les trois mutants doubles ainsi que le mutant simple INE trois à Syrien sont testés pour leur interaction avec une variante catalytiquement inactive de la papaine S-méthyl popine. Cette forme catalytiquement inactive du Protéus possède un groupe méthyle fixé sur la CYS 25 dans la fente active. Par souci de simplicité, nous appellerons cette variante propan tout au long du protocole.

La CFCA repose sur la mesure de la vitesse de liaison dans des conditions où celle-ci est limitée par la diffusion des molécules d'analyte vers la surface. Cela est favorisé par des niveaux élevés d'immobilisation du ligand. Avant de commencer la procédure d'immobilisation, placez le tampon HEPs utilisé lors des expériences sur le plateau gauche et insérez les deux tubulures.

Placez également une bouteille vide pour les déchets sur le plateau droit. Insérez ensuite un nouveau capteur Gypsum Five dans l'appareil, initialisez-le à l'aide du logiciel Core X 100 et, à l'écran de démarrage, cliquez sur l'élément de l'outil de puce d'arrimage. Cliquez sur Démarrer l'arrimage dans le logiciel.

Ensuite, utilisez l'assistant d'immobilisation pour configurer le capteur et l'immobilisation en choisissant le couplage à CM5 à partir de l'écran d'accueil : cliquez sur le bouton autres options, puis sélectionnez assistants. Une fenêtre s'affiche avec les assistants disponibles. Sélectionnez immobilisation, puis cliquez sur le bouton nouveau. En bas à droite, la première écran de l'assistant d'immobilisation apparaît ; le couplage au capteur CM5 est sélectionné par défaut.

Cochez la case sous la cellule d'écoulement deux pour immobiliser dans la cellule d'écoulement deux. La cellule d'écoulement un est laissée inchangée afin de l'utiliser comme surface de référence parmi les trois options disponibles ci-dessous. Cochez la case « spécifier une durée de contact », l'objectif sur la droite passe à « durée de contact », indiquez une durée de contact de 900 secondes.

Ensuite, saisissez les paramètres d'immobilisation sous solution de molécule de capture ou de ligand. Saisissez la papaine. Cliquez ensuite sur suivant.

L'écran suivant affiche la disposition du support d'échantillons. La position un contiendra l'éthanolamine utilisée pour désactiver les groupes réactifs restants après la couplage ciblé de la papaine ligand à la surface de la puce. Insérez la solution d'éthanolamine à la position un à la position deux.

Placer le ligand papaine ; la papaine est conservée en excès de sulfate de méthyle et diluée à 50 microgrammes par millilitre dans un tampon acétate de sodium 10 millimolaire, pH 4,5. Reconstituer les réactifs de couplage EDC et NHS du kit de couplage des amines avec de l'eau doublement distillée ; pipeter 85 microlitres d'EDC dans un flacon. Boucher le flacon et le placer à la position trois.

Utilisez le même volume de NHS à la position quatre. Remarquez que le fichier cinq doit être bouchonné et vide afin que l'appareil puisse mélanger l'ED, le C et le NHS dans ce fichier. N'oubliez pas non plus de remplir le fichier de lavage à la position H2O avec de l'eau déionisée fraîche.

Lorsque le support est rempli conformément au plan affiché à l'écran, cliquez sur charger les échantillons et insérez le support dans l'instrument. Une fois le support chargé, cliquez sur suivant. Avant le début de l'analyse, une liste de vérification s'affiche.

Vérifiez que tous les points à puces sont respectés lorsqu'ils le sont. L'exécution est lancée en appuyant sur le bouton de démarrage. L'exécution est lancée pendant la procédure d'immobilisation.

Les données sont collectées en temps réel. Premièrement, les réactifs de couplage sont injectés. Ensuite, le papier est couplé à la surface de la puce et la procédure se termine par l'inactivation des esters actifs restants.

Après l'exécution, une fenêtre de dialogue résume le résultat de l'analyse. Dans cette fenêtre, le niveau d'immobilisation est affiché. L'ensemble de la procédure de couplage doit permettre d'immobiliser environ 3000 RU de papaine.

Une fois que la papaine a été immobilisée sur la puce du capteur, commencez l'analyse CFCA en diluant les échantillons mutants de la cystatine B jusqu'à une concentration totale d'environ 10 nanomolaires dans au moins 300 microlitres. Notez le facteur de dilution, car nous l'utiliserons ultérieurement lors de la configuration du test. Commencez par ouvrir la boîte de dialogue assistant, comme décrit dans la section précédente, dans la section concentration du dossier d'analyse.

Choisissez « sans étalonnage », puis choisissez « nouveau ». Le premier écran de l'assistant affiche la séquence d'injection. Les paramètres peuvent rester inchangés, puisque la puce capteur CM5 et une approche de dosage par immobilisation directe sont utilisées ici.

Cliquez sur suivant dans l'écran suivant. Laissez les cases à cocher « prime avant l'exécution » et « exécuter les cycles d'amorçage » cochées. Laissez également le nombre par défaut de cycles d'amorçage inchangé à trois.

Saisir le tampon heaps dans le champ nom de la solution. Ensuite, cliquer sur suivant. Dans l'écran suivant, saisir le nom de la solution de régénération, soit l'hydroxyde de sodium à 20 millimolaire.

Laissez les autres paramètres inchangés. Cliquez sur suivant pour afficher le tableau des échantillons. Préparez les échantillons conformément au tableau des échantillons.

Chaque ligne du tableau d'échantillons donne lieu à deux cycles : un avec un débit de 10 microlitres par minute et un autre avec un débit de 100 microlitres par minute. Commencez l'analyse avec un blanc.

Ensuite, saisissez le nom, le facteur de dilution, le coefficient de diffusion à 20 degrés Celsius et la masse moléculaire. Pour chaque mutant, le coefficient de diffusion peut être calculé à l'aide de l'outil en ligne sur le site web du produit. Un lien vers cet outil est fourni dans le navigateur d'assistance du logiciel.

Étant donné qu'il est recommandé d'analyser chaque échantillon en double, copiez l'ensemble du tableau depuis la ligne vide jusqu'au dernier échantillon, puis collez-le au bas du tableau. Cliquez sur suivant pour continuer. L'écran suivant affiche le support d'échantillons.

Placer les échantillons et les réactifs dans le support selon la disposition indiquée par le logiciel. Charger le support dans l'appareil en appuyant sur le bouton charger les échantillons. Ensuite, cliquer sur suivant.

Après le chargement des échantillons, un écran-rappel avec une liste de vérification s'affiche. Assurez-vous de tout vérifier, puis appuyez sur démarrer. Les données sont collectées en temps réel pendant l'analyse.

Lorsque l'exécution est terminée, fermez la fenêtre affichant les données recueillies. Observez qu'un nouvel élément de résultat est apparu dans la fenêtre principale. Afin de calculer les concentrations à partir des données, sélectionnez cet élément de résultat et cliquez sur le bouton.

Évaluer via Core X 100. Lancer le logiciel d'évaluation affichant toutes les données recueillies depuis la barre d'outils, sélectionner l'analyse de concentration, puis l'étalonnage sans étalon dans le menu. Dans la première fenêtre, choisir les données à inclure dans l'analyse.

Faites défiler la liste et parcourez la liste des affichages afin de visualiser les données de tous les échantillons. Si vous souhaitez exclure des données, supprimez la coche dans la liste. Cliquez sur suivant pour démarrer le calcul.

Le modèle d'interaction CFCA est automatiquement ajusté aux données expérimentales ; lorsque l'ajustement est terminé, les résultats sont affichés pour chaque échantillon dans la fenêtre des résultats. Parcourez les ajustements pour chaque échantillon en sélectionnant la ligne correspondante dans le tableau. La colonne appelée concentration mesurée indique la concentration dans l'échantillon analysé.

La concentration dans l'échantillon d'origine est calculée à l'aide du facteur de dilution saisi précédemment et affichée dans la colonne « concentration calculée ». Une fois terminé, cliquez sur « Terminer » pour enregistrer le résultat. Maintenant que nous connaissons les concentrations des protéines obtenues par l'analyse CFCA, nous disposons d'une excellente base pour nos mesures cinétiques ultérieures. L'analyse cinétique va désormais nous aider à comprendre l'importance des résidus d'acides aminés clés pour le mécanisme de liaison.

Commençons par la configuration de l'analyse cinétique. L'analyse cinétique débute par le positionnement d'une nouvelle puce capteur CM5 dans l'appareil depuis l'écran de démarrage. Choisissez de créer un protocole d'essai pour l'affinité cinétique.

Dans le coin supérieur gauche, une fenêtre de dialogue apparaît permettant de saisir les informations relatives au ligand. Saisissez le nom « papain » dans la zone de nom du ligand et choisissez une autre protéine dans la liste des types d'espèces. Ensuite, sélectionnez l'option de fixation covalente du ligand en utilisant la puce capteur CM5 parmi les deux approches alternatives de liaison du ligand proposées ; le protocole d'essai recommandé est désormais décrit sur le côté droit de la fenêtre.

Il commence par une étape d'immobilisation suivie d'une étape de test. Appuyez sur continuer pour poursuivre. Enregistrez le flux de travail du test en saisissant un nom et en appuyant sur enregistrer.

Le logiciel décrit désormais le flux de travail du test à l’aide de boutons associés à chaque étape. La première étape dans la préparation de la surface du capteur consiste à déterminer un pH de mobilisation. Étant donné que ce pH est connu, appuyez sur Entrer une valeur connue dans la boîte de dialogue qui s’affiche.

Saisissez le nom du tampon « acétate » et le pH 4,5, puis choisissez « enregistrer ». Le flux de travail du dosage est désormais mis à jour avec une coche verte indiquant que cette étape est terminée. Il est maintenant temps d'immobiliser : appuyez sur le bouton « exécuter » dans l'étape d'immobilisation.

Cela ouvre l'assistant identique à celui utilisé pour le propane et l'immobilisation dans l'analyse CFCA ; l'immobilisation de la papaine en vue de l'analyse cinétique est configurée de la même manière ici, à l'exception près qu'une solution plus diluée est injectée pendant une durée plus courte. Ceci afin d'immobiliser une quantité moindre de papaine, évitant ainsi des situations où les taux de liaison des mutants de la kystatine seraient limités par la diffusion, permettant ainsi de mesurer les données cinétiques de manière isolée. Étant donné que le nom du ligand et le pH d'immobilisation ont été indiqués lors des étapes précédentes du protocole d'essai, ces paramètres sont déjà prédéfinis ici.

La seule mise à jour requise est de 50 secondes pour le temps de contact. L'immobilisation se poursuit ensuite comme indiqué précédemment. Le niveau de liaison attendu après immobilisation est de 50 R u.

Une coche verte à côté du bouton de lancement indique que l'immobilisation est terminée. Ensuite, saisissez la solution de régénération dans le flux de travail à l'étape. Trouvez les conditions de régénération en cliquant sur « Saisir les valeurs connues » dans la boîte de dialogue qui apparaît.

Saisissez la solution de régénération et le temps de contact. Ensuite, cliquez sur enregistrer. Maintenant que le ligand est immobilisé et que les conditions de régénération ont été saisies, tout est prêt pour générer les données cinétiques dans la boîte d'essai d'affinité cinétique : appuyez sur le bouton de démarrage, première étape de la cinétique.

L'assistant d'affinité décrit la séquence d'injection de chaque cycle pour la cinétique à cycle unique, qui est utilisée ici ; il n'est donc pas nécessaire de modifier quoi que ce soit. Cliquez sur suivant pour continuer. À l'étape suivante, conservez les paramètres par défaut indiquant l'amorçage du système avant l'analyse.

Choisissez d'effectuer un seul cycle de démarrage afin d'équilibrer la surface de la puce. Ensuite, définissez les paramètres d'injection de l'échantillon. Étant donné que la solution de régénération a été spécifiée précédemment et que le paramètre est prédéfini, il n'est pas nécessaire de modifier quoi que ce soit dans l'écran.

Cliquez sur suivant. Enfin, spécifiez les échantillons. Saisissez deux lignes pour chaque variante mutante, une vide et l'autre avec l'échantillon.

Un cycle vide est indiqué en réglant le paramètre de concentration maximale à zéro. Deux variants de la cystatine B peuvent être analysés lors de chaque essai. Pour chaque mutant, saisissez le poids moléculaire, la concentration maximale et le facteur de dilution, puis appuyez sur suivant.

Dans l'écran suivant, l'emplacement de la plaque d'échantillons est indiqué. Préparez une série de dilutions des échantillons de protéines et placez les vials avec leurs bouchons dans la plaque. Comme indiqué à l'écran, un vial contenant du tampon est placé à la position 13 et un vial contenant la solution de régénération est placé à la position 14. Veillez à remplir l'emplacement pour l'eau avec de l'eau fraîche.

Placer la plaque dans l'appareil et charger les échantillons en appuyant sur le bouton charger les échantillons, puis cliquer sur suivant. Comme précédemment, effectuer un contrôle final avant de lancer l'expérience en appuyant sur démarrer ; les données d'interaction apparaissent en temps réel. Une fois l'analyse terminée, procéder immédiatement à l'analyse des variants restants de la cystatine B selon la méthode qui vient d'être démontrée.

Si les variants restants de la cystatine B sont exécutés successivement, omettez l'étape d'amorçage et le cycle de démarrage en décochant les cases correspondantes à l'étape. Lorsque chaque exécution est terminée, les données peuvent être consultées à partir du lien. Tous les résultats du protocole d'essai.

Une fenêtre de dialogue affichant tous les résultats générés dans ce flux de travail apparaît. Afin de calculer les constantes cinétiques, sélectionnez le résultat à évaluer puis appuyez sur évaluer ; un logiciel d'évaluation Core X 100 redémarre et affiche toutes les données collectives. Sélectionnez « cinétique-affinité » dans le menu de la barre d'outils.

Dans le premier écran, le mutant cystéine trois vers syrien est sélectionné pour évaluation. Les données provenant de ce mutant sont affichées conjointement avec l'essai à blanc réalisé pour ce mutant ; passez à l'écran suivant en cliquant sur Suivant. L'écran suivant affiche les données obtenues après soustraction de l'essai à blanc à l'essai avec l'échantillon.

Choisissez d'évaluer la cinétique en cliquant sur le bouton de cinétique. Sélectionnez ensuite l'ajustement des données à un modèle d'interaction un-à-un. En cliquant sur le bouton d'ajustement, l'ajustement s'affiche à l'écran au fur et à mesure de son calcul.

Une fois prêt, des contrôles de qualité sont automatiquement appliqués et mis en évidence en bas de page. Examinez les éléments du contrôle de qualité, puis observez les données des grammes de capteur afin de vous assurer que les courbes de capteur présentent une courbure suffisante. Examinez également le graphique des résidus, qui montre les différences entre les données recueillies et le modèle ajusté.

Portez attention aux écarts systématiques et non aléatoires. Cet ajustement est acceptable. Examinez maintenant les données cinétiques dans l'onglet rapport.

La constante de vitesse d'association, la constante de vitesse de dissociation et la constante d'équilibre de dissociation. Une fois terminé, appuyez sur terminer et répétez la même procédure pour tous les autres mutants. Voici des résultats représentatifs de l'analyse CFCA pour les différentes variantes de la cystatine B examinées.

Les données de concentration de liaison spécifique sont extraites des chromatogrammes obtenus à des débits de 10 et 100 microlitres par minute. En comparant la concentration déterminée par une mesure à deux cycles de 80 avec celle déterminée par CFCA, il est clair que, bien que dans la plupart des cas la protéine soit entièrement active pour la variante leucine 73 glycine, la fraction de protéine active est très faible. La cinétique de liaison des variants de la cystatine B à la pepsine est déterminée à l’aide de la cinétique en cycle unique.

Les graphiques du capteur montrent des données soustraites du blanc et de la référence, avec une cinétique correspondant à un modèle d'interaction un-à-un superposée en noir. La concentration de liaison spécifique mesurée par CFCA pour la variante de la leucine 73 représente seulement environ 10 % de la concentration totale de protéine déterminée par une mesure à deux 80. Lorsqu'on utilise la bonne concentration pour calculer les paramètres cinétiques, il devient clair que la vitesse d'association pour Lucien 73 est similaire à celle des autres variantes.

Bien que les taux d'association des mutants soient comparables à celui de la protéine de type sauvage, la constante de vitesse de dissociation des mutants peut être supérieure d'environ deux ordres de grandeur, avec une augmentation correspondante de la constante d'équilibre de dissociation. La réduction des affinités dépend principalement de taux de dissociation accrus, indiquant que la seconde boucle de liaison ainsi que l'extrémité C-terminale de la cystatine B contribuent à l'affinité de liaison en maintenant l'inhibiteur attaché à l'enzyme une fois le complexe formé. L'utilisation d'une analyse de concentration sans étalonnage a été essentielle pour parvenir à cette conclusion, car l'un des mutants s'est révélé avoir une activité de liaison très faible. Mon collègue Pol vous a maintenant montré comment utiliser le bi core X 100 dans une étude fonctionnelle structurée. Lors de la réalisation de ces expériences, il est important de se rappeler que, bien que l'analyse de concentration et l'analyse cinétique reposent sur la même procédure de liaison, les conditions expérimentales sont assez différentes.