L'importance de la concentration de protéines correct pour Cinétique et Détermination d'affinité en analyse structure-fonction

L’objectif général de cet article vidéo est d’apporter des réponses aux deux questions suivantes. Premièrement, les études sur les interactions protéiques peuvent-elles être rendues plus fiables en mesurant la fraction d’un échantillon de protéine qui est réellement capable de se lier à une autre protéine ? Deuxièmement, comment l’analyse cinétique peut-elle nous donner une meilleure compréhension des relations entre la structure et les fonctions ?

Ces deux questions seront abordées dans une expérience impliquant Corp X 100, un instrument qui détecte les interactions protéiques en temps réel sans utiliser d’étiquettes. Cette expérience examinera l’interaction de la cystatine B bovine avec la cystine protéase papaïne, la structure cristalline des deux protéines en complexes pointe vers plusieurs résidus impliqués dans la liaison à la protéase pour déterminer comment chacun des résidus en interaction affecte l’interaction cystatine B papine. Plusieurs variantes de la cystatine B sont produites par mutagénèse dirigée.

Dans de telles expériences, il est toujours possible que les protéines recombinantes ne se replient pas correctement, ne s’agrègent pas ou ne se détériorent pas, ce qui conduit à des résultats incorrects et non reproductibles. VIACORE X 100 a la capacité de déterminer la fraction de protéine disponible pour la liaison par analyse de concentration sans étalonnage abrégée CFCA. Cette approche permet de déterminer la concentration de protéines avec une activité de liaison conservée même lorsque les étalons d’étalonnage ne sont pas disponibles.

Le CFCA sera utilisé ici pour déterminer la concentration des variants de la cystatine B. Ces données seront ensuite utilisées comme données d’entrée dans la détermination de la cinétique de liaison des variants de la cystatine B à Pepin, qui est également évaluée à l’aide de BOR X 100. Bonjour, je suis CLA gram de GE Healthcare en Suède.

Aujourd’hui, ma collègue Eva Pool va vous montrer comment effectuer une analyse de la relation structure-fonction à l’aide de BOR X 100 Les protéines recombinantes peuvent présenter un repliement incorrect ou une activité de bac lâche au fil du temps, et ce comportement ne peut pas être détecté par des méthodes qui reposent sur la mesure de la concentration totale. Cela peut en effet conduire à des données cinétiques incorrectes à la suite des mesures de concentration par analyse de concentration sans étalonnage. B.A core X 100 est utilisé pour analyser la cinétique et l’affinité de l’interaction des variants de la cystatine B avec le pepane.

Ces paramètres vous donneront un aperçu du mécanisme de liaison. Nous commençons par une brève explication de la conception expérimentale, alors commençons. L’interaction entre la cystine, la protéase, la papine et l’inhibiteur cystatine B est dominée par des contacts hydrophobes comme le révèle la structure cristalline des deux protéines en complexe.

Du côté de l’inhibiteur, les zones de contact sont les Ns terminaux N et C et deux boucles en épingle à cheveux. Dans cette étude, quatre mutants sont examinés, chacun d’entre eux contenant de la cystéine trois à la mutation syrienne introduite afin d’empêcher la dimérisation de la cystatine B.Sur la base du contexte révélé dans la structure cristalline, la leucine 73 a été mutée en glycine, l’histamine 75 en glycine et la tyrosine 97 a été changée en alanine. Les deux mutations de la glycine ont été introduites pour examiner l’importance des chaînes latérales de l’histidine 75 et de la leucine 73 pour la liaison au Pépin, le résidu de la tyrosine a été muté en alanine pour étudier l’interaction entre l’extrémité C de la cystatine B et le Pépin.

Les trois mutants doubles ainsi que les trois mutants uniques d’INE à seul mutant syrien sont testés pour leur interaction avec une variante catalytiquement inactive de la méthylpopine Papain S. Cette forme catalytiquement inactive de Proteus a un groupe méthyle attaché à CYS 25 dans la fente active. Par souci de simplicité, nous appellerons cette variante propan tout au long du protocole.

Le CFCA repose sur la mesure du taux de liaison dans des conditions où le taux est limité par la diffusion des molécules d’analyte à la surface. Ceci est favorisé par des niveaux élevés d’immobilisation du ligand. Avant de commencer la procédure d’immobilisation, placez le tampon HEP utilisé dans les expériences sur le plateau de gauche et insérez les deux tubes.

Placez également une bouteille de déchets vide sur le plateau de droite. Insérez ensuite un nouveau capteur gypsum five dans l’initialisation de l’instrument via le logiciel Core X 100, et sur l’écran de démarrage, cliquez sur l’élément de l’outil de puce de quai. Cliquez sur démarrer le document dans le logiciel.

Ensuite, utilisez l’assistant d’immobilisation pour configurer le pape et l’immobilisation en visant l’accouplement à la censure CM cinq à partir de l’écran de démarrage, cliquez sur le bouton autres options, puis sélectionnez les assistants. Une fenêtre s’affiche avec les assistants disponibles. Sélectionnez l’immobilisation puis cliquez sur le nouveau bouton En bas à droite, le premier écran de l’assistant d’immobilisation apparaît visant l’accouplement au capteur de gypse cinq est la valeur par défaut.

Cochez la case sous la cellule d’écoulement deux pour l’immobiliser dans la cellule d’écoulement deux. La cellule d’écoulement un n’est pas modifiée afin de l’utiliser comme surface de référence parmi les trois options disponibles ci-dessous. Cochez la case spécifier le temps de contact sur la droite le niveau cible passe au temps de contact, spécifiez un temps de contact de 900 secondes.

Ensuite, entrez les paramètres d’immobilisation sous la solution de ligand de capture de la molécule de slash. Entrez papain. Cliquez ensuite sur suivant.

L’écran suivant affiche la disposition du rack d’échantillons. La position un tiendra et éthanolamine utilisé pour désactiver l’actif restant après le couplage de visée du ligand papaïne à la surface de la puce. Insérez la solution d’éthanolamine en position un dans la position deux.

Placez le ligand papaïne la papaïne est stockée dans un excès de sulfate de méthyle et fait allusion à 50 microgrammes par millilitre dans un tampon d’acétate de sodium de 10 millimolaires. pH 4,5 reconstituer les réactifs de couplage EDC et NHS du kit de couplage d’amine avec pipette d’eau distillée double 85 microlitres d’EDC dans un flacon. Couvrez-le et placez-le en position trois.

Utilisez le même volume pour le NHS en position quatre. Notez que le fichier cinq doit être bouché et vide pour que l’instrument puisse mélanger ED, C et NHS dans ce fichier. N’oubliez pas non plus de remplir le fichier de lavage en position H2O avec de l’eau fraîche déminéralisée.

Lorsque le rack est rempli selon le contour à l’écran, cliquez sur charger les échantillons et chargez le rack dans l’instrument. Lorsque le rack est chargé, cliquez sur Suivant. Avant le début de la course, une liste de contrôle s’affiche.

Assurez-vous que tous les points sont remplis au moment où ils le sont. La course est lancée en appuyant sur le bouton de démarrage. La course est lancée pendant la procédure d’immobilisation.

Les données sont collectées en temps réel. Tout d’abord, les réactifs de couplage sont injectés. Ensuite, le pape est couplé à la surface de la puce et la procédure se termine par la désactivation des esters actifs restants.

Après l’exécution, une fenêtre de dialogue résume le résultat de l’exécution. Dans cette fenêtre, le niveau d’immobilisation est affiché. L’ensemble de la procédure d’accouplement devrait aboutir à environ 3000 RU de papaïne immobilisée.

Une fois que la papaïne a été immobilisée dans la puce du capteur, commencez l’analyse CFCA en diluant les échantillons de mutant de cystatine B à une concentration totale d’environ 10 nanomolaires dans au moins 300 microlitres. Enregistrez le facteur de dilution tel que nous l’utiliserons plus tard dans la configuration du test. Commencez par ouvrir la boîte de dialogue de l’assistant comme décrit dans la section précédente dans la section concentration du dossier de test.

Choisissez l’étalonnage libre, puis choisissez nouveau. Le premier écran de l’assistant affiche la séquence d’injection. Les paramètres peuvent rester inchangés puisque la puce de capteur CM cinq et une approche de test d’immobilisation directe sont utilisées ici.

Cliquez sur suivant dans l’écran suivant. Laissez les cases à cocher Ouvrir avant l’exécution et Exécuter les cycles de démarrage cochées. De plus, laissez le nombre de cycles de démarrage par défaut inchangé à trois.

Entrez heaps buffer dans le nom du champ de solution. Cliquez ensuite sur suivant. Dans l’écran suivant, entrez le nom de la solution de régénération, qui est de l’hydroxyde de sodium de 20 millimolaires.

Laissez les autres paramètres inchangés. Cliquez sur Suivant pour afficher l’exemple de table. Configurez les échantillons en fonction de la table d’échantillons.

Chaque ligne de la table d’échantillonnage entraîne deux cycles. L’un avec un débit de 10 microlitres par minute et l’autre avec 100 microlitres par minute. Commencez la course avec un blanc.

Entrez ensuite le nom facteur de dilution, coefficient de diffusion à 20 degrés Celsius et poids moléculaire. Pour chaque mutant, le coefficient de diffusion peut être calculé à l’aide de l’outil Web sur le site Web du produit. Un lien vers cet outil est fourni dans le navigateur d’assistance du logiciel.

Comme il est recommandé d’exécuter chaque échantillon et de le dupliquer, copiez l’intégralité de la table de la ligne vide vers le dernier échantillon et collez-la au bas de la table. Cliquez sur suivant pour continuer. L’écran suivant affiche le support d’échantillons.

Placez les échantillons et les réactifs dans le rack selon la disposition décrite par le logiciel. Chargez le rack dans l’instrument en appuyant sur le bouton de chargement des échantillons. Cliquez ensuite sur suivant.

Après le chargement des échantillons, un écran de rappel avec une liste de contrôle s’affiche. Assurez-vous de tout vérifier, puis appuyez sur Démarrer. Les données sont collectées en temps réel pendant le trajet.

Une fois l’exécution terminée, fermez la fenêtre affichant les données collectées. Observez qu’un nouvel élément de résultat est apparu dans la fenêtre principale. Pour calculer les concentrations à partir des données, sélectionnez le nouvel élément de résultat et cliquez sur le bouton.

Évaluer via le noyau X 100. Le logiciel d’évaluation commence à afficher toutes les données collectées à partir de la barre d’outils, sélectionnez l’analyse de concentration, puis l’étalonnage libre dans le menu. Dans la première fenêtre, choisissez les données à inclure dans l’analyse.

Faites défiler la liste et parcourez la liste des vues afin d’afficher les données de tous les échantillons. Si vous souhaitez exclure des données, décochez la case de la liste. Cliquez sur Suivant pour lancer le calcul.

Le modèle d’interaction CFCA est automatiquement ajusté aux données expérimentales lorsque l’ajustement est terminé, les résultats sont rapportés pour chaque échantillon dans la fenêtre de résultats. Passez en revue les raccords de chaque échantillon en sélectionnant la ligne correspondante dans le tableau. La colonne appelée concentration mesurée indique la concentration dans l’échantillon qui a été analysé.

La concentration dans l’échantillon d’origine est calculée à l’aide du facteur de dilution entré précédemment et indiqué dans la colonne Concentration calculée Une fois terminé, cliquez sur Terminer pour enregistrer le résultat. Maintenant que nous connaissons les concentrations des protéines grâce à l’analyse CFCA, nous disposons d’une excellente base pour nos mesures cinétiques ultérieures. L’analyse cinétique va maintenant nous aider à comprendre l’importance des résidus d’acides aminés clés pour le mécanisme de liaison.

Commençons par la configuration de l’analyse cinétique. L’analyse cinétique commence par l’intégration d’une nouvelle puce de capteur CM five dans l’instrument de l’écran de démarrage. Choisissez de créer un flux de travail de test pour l’affinité de Kinetic.

Dans le coin supérieur gauche, une fenêtre de dialogue apparaît dans laquelle des informations sur le ligand sont saisies. Entrez le nom papaïne dans la case du nom du ligand et choisissez une autre protéine dans la liste des types d’espèces. Sélectionnez ensuite le ligand d’immobilisation de manière covalente à l’aide de la puce de capteur CM cinq parmi les deux approches alternatives de fixation de ligand présentées, le flux de travail de test recommandé est maintenant décrit sur le côté droit de la fenêtre.

Elle commence par une étape d’immobilisation suivie d’une étape de dosage. Appuyez sur continuer pour continuer. Enregistrez le flux de travail de test comme demandé en saisissant un nom et en appuyant sur Enregistrer.

Le logiciel décrit désormais le flux de travail du test à l’aide de boutons associés à chaque étape. La première étape de la préparation de la surface du capteur consiste à trouver un pH de mobilisation. Comme ce pH est connu, appuyez sur entrer la valeur connue dans la boîte de dialogue qui apparaît.

Entrez le nom du tampon acétate et pH 4,5 et choisissez Enregistrer. Le flux de travail du test est maintenant mis à jour avec une coche verte pour indiquer que cette étape est terminée. Il est maintenant temps d’immobiliser : appuyez sur le bouton de course dans l’étape immobilisée.

Cela fait apparaître le même assistant que celui utilisé pour le propane et l’immobilisation pour l’analyse CFCA L’immobilisation du papin pour l’analyse cinétique est mise en place de la même manière ici, sauf qu’une solution plus diluée est injectée pendant moins de temps. Ceci afin d’immobiliser moins de papin pour éviter les situations où les taux de liaison des mutants de la cystatine sont limités par la diffusion afin que les données cinétiques puissent être mesurées de manière isolée. Étant donné que le nom du ligand et le pH d’immobilisation ont été saisis dans les étapes précédentes du flux de travail de test, ces deux éléments sont prédéfinis ici.

La seule mise à jour requise est de 50 secondes pour le temps de contact. L’immobilisation se déroule alors comme indiqué précédemment. La liaison attendue après le niveau d’immobilisation est de 50 R ru.

Une coche verte à côté du bouton d’exécution indique que l’immobilisation est terminée. Ensuite, entrez la solution de régénération dans le flux de travail de l’étape. Trouvez les conditions de régénération en cliquant sur entrer des valeurs connues dans la boîte de dialogue qui s’affiche.

Entrez la solution de régénération et le temps de contact. Cliquez ensuite sur Enregistrer. Maintenant que le ligand est immobilisé et que les conditions de régénération sont entrées, tout est réglé pour générer des données cinétiques dans la boîte de test d’affinité de la cinétique d’exécution, appuyez sur le bouton d’exécution pour la première étape de la cinétique.

L’assistant d’affinité décrit la séquence d’injection de chaque cycle pour la cinétique à cycle unique, qui est utilisée ici, il n’est pas nécessaire de changer quoi que ce soit. Cliquez sur Suivant pour continuer. À l’étape suivante, conservez les paramètres par défaut indiquant l’amorçage du système avant l’exécution.

Choisissez d’exécuter un cycle de démarrage afin d’équilibrer la surface de la puce. Ensuite, définissez les paramètres d’injection de l’échantillon. Étant donné que la solution de régénération a été spécifiée précédemment et que le paramètre est prédéfini, il n’est pas nécessaire de modifier les paramètres à l’écran.

Cliquez sur suivant. Enfin, spécifiez les échantillons. Entrez deux rangées pour chaque variante mutante, l’une vide et l’autre avec l’échantillon.

Un cycle d’ébauche est indiqué en réglant le paramètre de concentration le plus élevé sur zéro. Deux. Des variantes de la cystatine B peuvent être adaptées à chaque cycle. Pour chaque mutant, entrez le poids moléculaire, la concentration la plus élevée et le facteur de dilution, appuyez sur suivant.

Dans l’écran suivant, le support d’échantillons est décrit. Préparez une série de dilutions des échantillons de protéines et placez les flacons avec les bouchons dans le support Comme indiqué sur l’écran, un flacon avec tampon est placé en position 13 et un flacon avec la solution de régénération est placé en position 14. Assurez-vous de remplir la position eau avec de l’eau douce.

Placez le rack dans la machine et chargez les échantillons en appuyant sur le bouton Charger les échantillons et cliquez sur Suivant. Comme précédemment, effectuez une dernière vérification avant de procéder à l’exécution de l’expérience en appuyant sur démarrer les données d’interaction qui apparaissent en temps réel. Une fois l’essai terminé, procédez immédiatement à l’analyse des variantes restantes de la cystatine B conformément à ce qui vient d’être démontré.

Si les variantes restantes de la cystatine B sont exécutées successivement, omettez l’étape principale et le cycle de démarrage en décochant les cases correspondantes à l’étape. Une fois chaque exécution terminée, les données sont accessibles à partir du lien. Tous les résultats sont dans le flux de travail du test.

Une fenêtre de dialogue avec tous les résultats générés dans ce flux de travail s’affiche. Afin de calculer les constantes de vitesse cinétique, sélectionnez le résultat à évaluer et appuyez sur évaluer pour qu’un logiciel d’évaluation core X 100 soit redémarré en affichant toutes les données collectives. Sélectionnez Affinité cinétique dans le menu de la barre d’outils.

Dans le premier écran, la cystéine trois au mutant syrien est sélectionnée pour évaluation. Les données de ce mutant sont affichées avec l’exécution à vide effectuée pour ce mutant en cliquant dessus. Prochain. L’écran suivant affiche les données avec l’exécution à vide soustraite de l’exécution avec l’échantillon.

Choisissez d’évaluer la cinétique en cliquant sur le bouton Cinétique. Choisissez maintenant d’ajuster les données à un modèle d’interaction individuelle. En cliquant sur le bouton ajustement, l’ajustement s’affiche à l’écran au fur et à mesure qu’il est calculé.

Une fois qu’il est prêt, des contrôles de qualité sont automatiquement appliqués et mis en évidence en bas. Examinez les éléments de contrôle qualité, puis examinez les données des grammes du capteur pour vous assurer que les grammes du capteur présentent une courbure suffisante. Jetez également un coup d’œil au graphique résiduel montrant les différences entre les données collectées et le modèle ajusté.

Faites attention aux écarts systématiques et non aléatoires. Cet ajustement est acceptable. Jetez maintenant un coup d’œil aux données cinétiques dans l’onglet rapport.

La constante de taux d’association, la constante de taux de dissociation et la constante de dissociation à l’équilibre. Une fois terminé, appuyez sur terminer, répétez la même procédure pour tous les autres mutants. Voici les résultats représentatifs de l’analyse de la CFCA pour les différents variants de la cystatine B examinés.

Les données spécifiques de concentration de liaison sont extraites des grammes du capteur obtenus à des débits de 10 et 100 microlitres par minute. En comparant la concentration déterminée par une mesure de deux 80 avec celle déterminée par CFCA, il est clair que si dans la plupart des cas, la protéine est pleinement active pour la variante de la leucine 73 glycine, la fraction de protéine active est très faible. La cinétique des variants de la cystatine B se liant à la pépine est déterminée à l’aide de la cinétique d’un seul cycle.

Les grammes du capteur affichent des données vides et de référence soustraites avec cinétique pour un modèle d’interaction un-à-un superposé en noir. La concentration de liaison spécifique mesurée par CFCA pour la variante de la leucine 73 n’est que d’environ 10 % de la concentration totale en protéines, déterminée par une mesure de deux 80. En utilisant la concentration correcte dans le calcul des paramètres cinétiques, il devient clair que le taux d’association pour Lucien 73 est similaire à celui des autres variantes.

Bien que les taux d’association des mutants soient comparables à ceux de la protéine de type sauvage, la constante de vitesse de dissociation des mutants peut être supérieure de près de deux ordres de grandeur avec une augmentation correspondante de la constante de dissociation à l’équilibre. La réduction des affinités dépend principalement de l’augmentation des taux de dissociation, indiquant que la deuxième boucle de liaison et l’extrémité C terminale de la cystatine B contribuent à l’affinité de liaison en maintenant l’inhibiteur attaché à l’enzyme une fois que le complexe a été formé, l’utilisation de l’analyse de concentration sans étalonnage était essentielle pour cette conclusion car l’un des mutants s’est avéré avoir une très faible activité de liaison, Mon collègue Pol vous a maintenant montré comment utiliser bi core X 100 dans une étude de fonction structurée. Lors de la réalisation de ces expériences, il est important de se rappeler que bien que l’analyse de concentration et l’analyse cinétique soient basées sur la même procédure de liaison, les conditions expérimentales sont très différentes.