Name: Microfluidiques Co-culture de cellules épithéliales et des bactéries denquête sur les Soluble signal médiée par des interactions (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-20T17:03:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Apprenez la co-culture microfluidique de cellules épithéliales et de bactéries pour étudier les interactions hôte-pathogène. Ce modèle imite le tractus gastro-intestinal et permet d'évaluer l'impact des signaux solubles sur la colonisation par EHEC.

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Ce travail a été soutenu en partie par la National Science Foundation (EFAC 0.846.453) et le National Institutes of Health (1R01GM089999).

1. La fabrication des maîtres de silicium en utilisant la norme SU-8 photolithographie 1 (non représenté dans cette vidéo). <ol><li> Utiliser des méthodes standard de SU-8 photolithographie pour créer un SU-8 "maîtres" (SU-8 2050, MicroChem, Newton, MA) pour fabriquer les différents composants (PDMS de différentes épaisseurs, de co-culture de chambre) dans une salle blanche. Ces moules maître peut être fabriqué dans toute installation de microfabrication (par exemple, Stanford Microfluidique Fonderie; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li> Avant de réplication PDMS, exposer le SU-8 maîtres d'fluorosilane la vapeur dans un dessiccateur attaché à une source de vide pour faciliter la libération facile de PDMS par le maître. Ajouter une goutte de fluorosilane d'une serviette en papier et appliquer le vide pendant une minute. Retirez le vide et laissez 30 min pour le dépôt de fluorosilane. Gardez le SU-8 de maître dans un récipient fermé pour une utilisation future. </li></ol> 2. Réplique de moulage de PDMS de SU-8 master 2 <ol><li> La couche fluidique et la couche de contrôle sont réalisés par moulage réplique de PDMS de SU-8 maître. </li><li> Mélanger le PDMS pré-polymère et cross-linker à un poids de 10h01. Ratio et dégazer dans un dessiccateur pendant 1 heure (ou jusqu'à ce que les bulles d'air sont éliminés du mélange PDMS). </li><li> Placez le SU-8 maître dans une boîte de Pétri et verser délicatement le mélange PDMS sur le dessus de la SU-8 maître. Degas le PDMS à nouveau. </li><li> Spin le moule à 1200 rpm pendant une minute pour obtenir une épaisseur uniforme d'environ 100 microns de PDMS sur le moule. </li><li> Chauffer la boîte de Pétri contenant le PDMS et le SU-8 moule maître à 80 ° C pendant une heure pour guérir le PDMS. </li><li> Retirez le guérir PDMS-couverte SU-8 maîtres de la plaque chauffante. </li><li> Peler le moule PDMS du maître SU-8. </li><li> Percez quatre trous dans le moule PDMS en utilisant un calibre 20 à bout émoussé l'aiguille pour les entrées bactéries deux, une sortie et un port pneumatique. </li></ol> 3. Collage de multicouches appareils PDMS: Cet appareil est assemblé avec trois couches, une couche supérieure qui contient le canal principal, une couche de pneumatiques milieu, et une couche inférieure bactérienne qui contient les canaux pour les bactéries. Les trois couches sont assemblés comme décrit ci-dessous. <ol><li> Mouiller les membranes en PDMS avec du méthanol et soigneusement les peler de leur SU-8 du moule maître à l'aide d'une pince propre. Membranes Déposer sur une plaque en téflon. </li><li> Placez la membrane pneumatique et la couche fluidique sur une chambre à plasma d'oxygène. Tourner sur le plasma pendant 40 secondes (10 sccm pression d'oxygène, de puissance RF 100W). </li><li> Après une exposition au plasma, d'aligner (dans les 10 minutes) de la membrane sur le fond du canal PDMS l'aide de pinces. Addition de méthanol sur la membrane et les couches PDMS permet la libre circulation des couches, et rend l'alignement facile. Dans ce cas, le dispositif est placé sur un morceau de gaze pour permettre aux vapeurs de méthanol à s'échapper. </li><li> Guérissez les couches alignées PDMS sur une plaque chauffante à 80 ° C pendant 8 h. </li><li> Après collage de la membrane pneumatique sur la couche inférieure, répétez les étapes 3.2 à 3.4 pour coller le canal supérieur sur le dispositif de PDMS assemblés composites. </li></ol> 4. L'assemblage du dispositif de PDMS 3,4 <ol><li> Percez des trous dans les ports d'entrée et de sortie utilisés pour l'ensemencement des cellules eucaryotes et les bactéries. </li><li> Relier les tubes Tygon (0,01 pouces OD) aux ports et à exploiter la couche pneumatiques en tirant avec une seringue de 20ml. </li><li> Placez le modèle PDMS et d'une lame de verre pré-nettoyés dans une chambre à plasma d'oxygène. Tourner sur le plasma pendant 20 sec (pression d'oxygène 20 sccm, RF 300W) sans appliquer le vide. </li><li> Afin d'éviter tout contact entre l'île mur (PDMS) collage à la lame de verre, se connecter immédiatement une seringue à l'appareil et appliquer le vide en tirant la seringue et le maintenant en place. </li><li> Appuyez doucement sur le modèle de PDMS sur le verre (dans les 2 minutes). </li><li> Cure le dispositif de PDMS à 80 ° C pendant 10 minutes. </li></ol> 5. Traiter la surface du verre avec de la fibronectine <ol><li> Stériliser appareil sous UV pendant 15 minutes après le raccordement de tuyaux Tygon à chaque port. </li><li> Remplissez et le débit du PBS stérile dans le canal pour enlever tous les débris dans le canal. Appliquer des flux pendant 10 minutes pour enlever les bulles d'air. Les bulles d'air peuvent facilement échapper à la PDMS en raison de sa perméabilité aux gaz. </li><li> Remplir une solution de teinture de couleur dans le canal pneumatique pour éviter la formation de bulles d'air dans le canal. </li><li> Afin de faciliter l'ensemencement des cellules eucaryotes sur le verre, introduire un 1 ug / ml solution de fibronectine dans l'appareil et laisser incuber pendant 40 min à 37 ° C. </li><li> Laver la fibronectine excédent avec 1 ml de milieu de croissance. </li></ol> 6. Formation et évaluation des commensaux E. coli dans les biofilmsîles <ol><li> Diluer les bactéries commensales (par exemple, E. coli BW25113/pCM18) dans les médias M9 minimale à OD 600 ~ 1 pour former un biofilm commensales dans les chambres fermées / îles. </li><li> Fermer le mur île par l'application positive liquide à haute pression. Un convertisseur de pression artisanales air-liquide est utilisé pour prévenir la formation de bulles d'air dans le canal. </li><li> Introduire le commensal E. coli dans les îles avec la vanne fermée, et permettent aux bactéries d'attacher pendant 1 heure à 32 ° C. </li><li> Laver les bactéries seules et perfuser une suspension diluée bactérienne (DO 600 ~ 0,05) à 0.25mL/hr pendant 12 heures. </li><li> Rincer le biofilm avec des produits frais milieux de croissance DMEM pour enlever les bactéries faiblement attachés et se préparer pour la fixation des cellules eucaryotes. </li><li> Image du biofilm en utilisant un Leica TCS SP5 microscope confocal à balayage laser (Bannockburn, IL), et de visualiser l'architecture du biofilm en utilisant le logiciel Imaris 5. </li></ol> 7. Ensemencement des cellules eucaryotes autour des îles bactérienne 6-8 <ol><li> Trypsiniser cellules HeLa par flacon de culture tissulaire et remettre en suspension dans des milieux DMEM pour une densité de semis de 5 x 10 5 cellules / ml. </li><li> Présentez les cellules HeLa dans l'appareil à un débit de 2 mL / min en utilisant une pompe seringue Picoplus (Harvard Apparattus, MA). Assurez-vous que le mur île est abaissé pour que le biofilm bactérien est séparée de la région de cellules HeLa. Cette étape doit être effectuée sur la scène d'un microscope optique afin que l'uniformité de l'ensemencement peut être déterminée. </li><li> Serrer la sortie de la cellule afin de réduire le mouvement de la suspension cellulaire dans le canal et incuber pendant 6 h à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Perfuser l'appareil avec un milieu de croissance à 0,5 ml / h pour enlever les cellules seules. </li><li> Actualiser les médias DMEM pour HeLa et commensaux E. coli toutes les 6 heures. </li></ol> 8. Introduction de bactéries pathogènes dans l'île et l'exposition aux cellules eucaryotes <ol><li> Préparer E. coli O157: H7 (EHEC) pour infecter les cellules HeLa à une multiplicité d'infection (MOI) de 100:1 200:1 (nombre de cellules HeLa par EHEC). </li><li> Rincer et laver faiblement attachés bactéries commensales. </li><li> Introduire une suspension diluée EHEC (DO600 ~ 0,1) dans les îles. </li><li> Incuber appareil à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur pendant 6 heures sans écoulement pour permettre à EHEC pour être exposé à des signaux présents dans le biofilm commensales. </li><li> Soulevez le mur de PDMS pour exposer EHEC dans les îles commensales de cellules HeLa pendant 6 heures. </li><li> Rincer le canal avec du PBS et les taches pour les cellules vivantes et mortes en utilisant le kit Live / Dead (L3224, Invitrogen, CA). </li><li> L'emplacement des images multiples sur un microscope Zeiss Axiovert 200M fluorescence et estimer le nombre de cellules vivantes et mortes. </li></ol> 9. Résultats Représentant 9 La séquence des événements dans les infections des voies gastro-intestinal a été imité par le développement d'une monocouche de cellules HeLa et un commensal E. biofilm coli et d'exposer à l'EHEC biofilm commensales avant l'infection des cellules HeLa. Les étapes impliquées dans la fabrication de la microfluidique de co-culture du modèle sont présentés dans la figure 1. Figure 2A montre un rendu en 3 dimensions de l'appareil de co-culture. Les deux régions dans le dispositif de co-culture de la chambre de culture de cellules eucaryotes et les bactéries de l'île sont montrés dans la figure 2B avec des colorants de couleurs différentes (violet pour les régions eucaryotes et vert pour l'île de bactéries). La faisabilité d'isoler les régions de culture bactérienne de la région environnante eucaryotes est montré dans la figure 2C utilisant des colorants de couleurs. La figure 3 montre des résultats représentatifs de la co-culture de cellules épithéliales et des bactéries. Figure 3A montre la colonisation du biofilm commensales (vert) île par EHEC (rouge). La figure 3B montre la juxtaposition de cellules épithéliales et commensaux E. coli avec des EHEC dans l'île bactérienne. La DP exprimant la GFP EHEC et exprimer les bactéries commensales sont localisés dans l'île quand le mur de PDMS est abaissé, ce qui illustre la faisabilité d'isoler l'île bactérienne de cellules épithéliales. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: Schéma de l'ensemencement des cellules dans le modèle de co-culture. (1) Le mur de PDMS est abaissé pour former une île, les bactéries commensales sont introduits dans l'île, et la fibronectine est coulé autour de l'île. (2) des cellules HeLa sont ensemencées dans les régions qui entourent l'île. (3) Après les cellules HeLa atteignent la confluence et le biofilm commensales a développé, à EHEC est introduit dans l'île. (4) Le mur de PDMS est levépour exposer les cellules HeLa qui entoure l'île d'EHEC. En médaillon montre les détails du fonctionnement de la vanne. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2a.jpg" alt="Figure 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2a"> <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2bc.jpg" alt="Figure 2bc" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2bc"> Figure 2: Modèle microfluidiques pour la co-culture de cellules épithéliales et des bactéries. (A) en trois dimensions restitution de l'appareil de co-culture montrant pneumatique actionné régions piégeage pour former des îlots bactérienne chez les cellules épithéliales. Chaque île bactérienne (1200 um de diamètre et 1000 um d'intervalle) a une entrée et une sortie pour fournir un milieu de croissance et d'élimination des déchets de l'île. (B) Micrographie de l'appareil de co-culture avec des colorants de couleurs montrant les différentes régions (zone de cellules épithéliales, les îles bactérienne). (C) La fidélité du système de piégeage pneumatique est démontré par l'abaissement du mur PDMS (panneau de gauche) en utilisant un canal pneumatique activé (en bleu), l'introduction de teinture pourpre dans les iles fermée, et qui coule colorant jaune autour d'elle pendant 48 h. Lorsque le mur de PDMS est soulevée (à droite), la région île est exposée à la teinture jaune entoure. La barre d'échelle représente 500 um. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3: Co-culture de cellules HeLa et les bactéries. (A) image de fluorescence de la DP-exprimant EHEC et exprimant la GFP E. coli dans les BW25113 île. (B) Superposition d'transmise, vert, rouge et des images de fluorescence dans l'appareil. La barre d'échelle représente 200 um.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
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</ol>

Essais classiques pour l&#39;attachement des agents pathogènes et la colonisation d&#39;utiliser une monocouche de cellules eucaryotes dans des plaques de culture de tissu dans lequel des agents pathogènes sont ajoutés. Ces modèles ne sont pas physiologiquement pertinents car ils n&#39;intègrent pas un biofilm bactérien commensal développés sur les cellules eucaryotes. La simple addition d&#39;une culture pré-cultivé des bactéries aux cellules eucaryotes est peu probable d&#39;aboutir à cette conformation que les biofil...

<table><tbody><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>masque de photolithographie haute résolution (16 256 ppp)</td><td>Fineline-Imaging Inc, CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridécafluorooctyl)silane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77279</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30002.02</td><td></td></tr><tr><td>centrifugeuse programmable</td><td>Laurell Tech Corp</td><td>WS0650S</td><td></td></tr><tr><td>aligneur de masque</td><td>Neurotronix</td><td>Q4000</td><td></td></tr><tr><td>gravure au plasma d'oxygène</td><td>March Plasma System, CA</td><td>CS-1701</td><td></td></tr><tr><td>pompe à seringue</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de viabilité/cytotoxicité Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td>L-3224</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluidiques co-culture de cellules épithéliales et des bactéries d&#39;enquête sur les soluble signal médiée par des interactions

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

La gastro-intestinal humain intestinal (GI) est un environnement unique dans lequel les cellules épithéliales intestinales et non pathogènes (commensaux) les bactéries coexistent. Il a été proposé que le microenvironnement des rencontres que l&#39;agent pathogène dans la couche commensale est importante pour déterminer l&#39;ampleur de la colonisation. Les méthodes de culture actuelles pour enquêter sur la colonisation des pathogènes ne sont pas bien adaptés pour enquêter sur cette hypothèse car ils ne permettent pas de co-culture de bactéries et de cellules épithéliales d&#39;une manière qui imite le microenvironnement tractus gastro-intestinal. Nous décrivons ici un microfluidique de co-culture modèle qui permet la culture indépendante des cellules eucaryotes et les bactéries, et de tester l&#39;effet du microenvironnement commensale sur la colonisation d&#39;agents pathogènes. Le modèle de co-culture se manifeste par l&#39;élaboration d&#39;un commensal<em&gt; Escherichia coli</emBiofilm&gt; parmi les cellules HeLa, suivie par l&#39;introduction de entérohémorragique<em&gt; E. coli</em&gt; (EHEC) dans l&#39;île commensaux, dans une séquence qui imite la séquence des événements dans les infections des voies gastro-intestinales.

Ce protocole décrit une microfluidique de co-culture de modèle pour la culture simultanée et localisée des cellules épithéliales et des bactéries. Ce modèle peut être utilisé pour étudier le rôle des différents signaux moléculaires solubles sur la pathogenèse ainsi que l&#39;écran de l&#39;efficacité des souches bactériennes probiotiques putatifs.

Microfluidiques Co-culture de cellules épithéliales et des bactéries d&#39;enquête sur les Soluble signal médiée par des interactions

Le tractus gastro-intestinal (GI) humain est un environnement unique dans lequel les cellules épithéliales intestinales et les bactéries non pathogènes (commensales) coexistent. Il possède...

Ce protocole illustre l'utilisation d'un nouveau modèle de co-culture microfluidique permettant la culture indépendante de cellules eucaryotes et de bactéries afin d'évaluer l'effet du microenvironnement commensal sur la colonisation par des pathogènes. Le modèle de co-culture est mis en œuvre en développant un biofilm de E. coli commensal parmi des cellules HeLa, suivi de l'introduction d'Escherichia coli entérohémorragique (EHEC) dans l'îlot commensal, selon une séquence qui imite la succession des événements observée lors d'une infection du tube digestif.L'étendue résultante de la colonisation des cellules épithéliales par l'EHEC est visualisée à l'aide de la microscopie à fluorescence. Bonjour, je viens du laboratoire de biotechnologie des systèmes moléculaires du Département de génie chimique de l'Université Texas et M. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de cultiver des bactéries et des cellules eCard ensemble dans un dispositif microfluidique de manière à imiter l'organisation du tube digestif humain.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier comment la colonisation des cellules épithéliales par des bactéries pathogènes est influencée par les signaux auxquels elles sont exposées dans le tractus tri avant la colonisation. Commençons donc. Avant toute expérimentation, préparez un moule en silicone conçu et fabriqué selon l'usage expérimental prévu.Par exemple, la Stanford Microfluidics Foundry peut fabriquer des matrices modèles à partir desquelles des moules répliques expérimentaux peuvent être réalisés ultérieurement. Pour le dispositif à trois couches décrit dans ce protocole, des moules pour deux membranes destinées à la couche de culture de cellules eucaryotes et à la couche pneumatique, ainsi qu’un canal bactérien, sont nécessaires. Les hauteurs de canal pour les couches bactérienne, pneumatique et de culture de cellules eucaryotes sont respectivement de 5, 200 et 100 micromètres. Avant de préparer un moule réplique, exposez la matrice en SU-8 à la vapeur de fluorocycline dans un dessiccateur relié à une source de vide. Pour faciliter le démoulage facile du moule en PDMS à partir de la matrice, ajoutez une goutte de fluoro-silane sur une serviette en papier placée dans la chambre à vide, puis appliquez le vide pendant une minute.Supprimez le vide et laissez 30 minutes pour le dépôt de fluoro. Conservez le maître en SU-8 dans une boîte de Pétri pour une utilisation ultérieure afin de créer des moules par réplique. Préparez le prépolymère de PDMS et l'agent de réticulation selon un rapport pondéral de 10 pour 1, mélangez soigneusement, puis dégazez le mélange dans une chambre sous vide pendant une heure.Pour éliminer les bulles d'air, placez le moule SU huit dans une boîte de Pétri et versez soigneusement du PDMS sur le moule en utilisant cinq grammes de PDMS pour le et 30 grammes de PDMS pour la couche bactérienne. Dégazez à nouveau le PDMS pendant 10 minutes afin d'éliminer les bulles d'air. Ensuite, faites tourner le moule pendant une minute afin de répartir uniformément le PDMS en une membrane continue.Dans ce protocole, la membrane de culture cellulaire eucaryote est centrifugée à 1200 tr/min pour une épaisseur de 150 micromètres, et la membrane pneumatique est centrifugée à 800 tr/min pour une épaisseur de 250 micromètres. Après la centrifugation, laissez le plat de Pétri contenant la membrane PDMS et le moule maître SU8 reposer 15 minutes à température ambiante avant de chauffer sur une plaque chauffante à 80 degrés Celsius pendant une heure. Pour réticuler le PDMS, après réticulation, humidifiez le PDMS avec du méthanol et décollez-le soigneusement des moules maîtres SU8 à l’aide de pinces propres.Placer la couche bactérienne sur un stéréoscope et, à l’aide d’une aiguille de calibre 20 à extrémité émoussée, percer trois trous : deux entrées pour les bactéries et une sortie. Le dispositif en trois couches est assemblé dans l’ordre suivant : liaison de la couche pneumatique à la couche bactérienne, puis liaison de la couche de culture de cellules eucaryotes à l’ensemble couche bactérienne plus couche pneumatique.Placer la membrane pneumatique et la couche bactérienne sur une lame de verre et exposer au plasma dans une chambre à plasma d'oxygène pendant 40 secondes à une pression d'oxygène de 10 centimètres cubes par minute normalisés, ou SCCM, et une puissance radiofréquence ou RF de 100 watts. L'ajout de méthanol dans les membranes facilite le mouvement libre des couches et rend l'alignement plus facile. Dans les 10 minutes suivant l'exposition au plasma d'oxygène, placer la couche bactérienne dans une boîte de Pétri à l'aide de pinces et d'un stéréoscope.Aligner la membrane pneumatique centrale avec la couche bactérienne en vous basant sur les orifices d'entrée et de sortie destinés aux bactéries. Après l'alignement, placer la boîte de Pétri munie de la structure PDMS alignée sur une plaque chauffante à 80 degrés Celsius pendant huit heures afin d'assurer la liaison. Une fois cette étape terminée, percer un trou dans la couche pneumatique pour contrôler le canal pneumatique.Ensuite, répétez les étapes d'assemblage à l'alignement afin de lier le canal de culture de cellules eucaryotes au dispositif composite en PDMS assemblé. Percez des trous dans les orifices d'entrée et de sortie utilisés pour l'ensemencement des cellules eucaryotes. Connectez un tube tigon aux orifices et faites fonctionner la couche pneumatique en tirant avec une seringue de 20 millilitres.Placer la structure composite en PDMS et une lame de verre préalablement nettoyée dans une chambre à plasma d'oxygène. Activer le plasma pendant 20 secondes sans appliquer le vide. Retirer la structure composite en PDMS de la chambre à plasma d'oxygène et y connecter une seringue de 20 millilitres.Tirez immédiatement pour créer un vide afin d'éviter tout contact entre les valves et le verre. Faites glisser dans l'minute suivant. Après l'exposition au plasma, appuyez délicatement la structure composite en PDMS sur le verre.Chauffer l'appareil en PDMS sur une plaque chauffante à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, relier un tube teflon à chaque orifice et stériliser l'appareil sous rayonnement UV pendant 15 minutes. Puis, remplir une seringue d'un millilitre avec 500 microlitres de PBS stérile et introduire le liquide dans le canal afin d'éliminer tout débris.Si une bulle d'air est observée, pincez le tube de sortie avec un microtube de centrifugeuse einor et appliquez une légère pression pour expulser la bulle à travers les couches de PDMS perméables aux gaz. Remplissez le canal pneumatique avec de l'eau stérile afin d'éviter la formation de bulles d'air dans le canal.Un convertisseur pression air-liquide fait maison est utilisé pour empêcher la formation de bulles d'air dans le canal pneumatique. Pour préparer l'ensemencement de cellules eucaryotes sur le verre, introduire 500 microlitres de fibronectine dans la région de culture cellulaire par l'entrée de culture de cellules eucaryotes. À l'aide d'une seringue, garder la vanne fermée et incuber pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius.Enfin, lavez l'excès de fibronectine avec un millilitre de milieu de croissance à l'aide de la pompe à seringue. L'appareil est maintenant prêt à être utilisé pour l'expérience visant à former un biofilm commensal. Diluez les bactéries dans un milieu minimal M9 jusqu'à une DO 600 d'environ un. Dans cet exemple, nous utilisons une souche de laboratoire d'E. coli, mais toute souche bactérienne non pathogène peut être utilisée.Fermer la vanne séparant les zones de culture de cellules bactériennes et eucaryotes en appliquant une pression hydrostatique positive. Introduire 0,2 millilitre d’*E. coli* à une DO 600 d’environ 1,0 dans les îlots à l’aide d’une pompe à seringue et laisser les bactéries s’attacher pendant une heure à 32 degrés Celsius. Après incubation.Perfuser une suspension bactérienne diluée avec une DO 600 d'environ 0,05 et du milieu minimal M neuf à raison de 0,25 millilitre par heure pendant 12 heures. À l’aide de la pompe à seringue, rincer le biofilm avec 0,5 millilitre de milieu DMEM frais, sans sérum et sans antibiotique, à raison de 0,5 millilitre par heure en utilisant une pompe à seringue afin d’éliminer les bactéries faiblement attachées et de préparer l’image du biofilm pour l’attachement des cellules eucaryotes. À l’aide d’un microscope confocal à balayage laser Leica T-C-S-S-P cinq, visualiser l’architecture du biofilm à l’aide du logiciel MS.Essuyez les yeux avec de la trypsine, récupérez les cellules HeLa à partir d’un flacon de culture tissulaire et resuspendez-les. Suspendez-les dans un milieu DMEA jusqu’à un volume total de 0,1 millilitre à une densité d’ensemencement de cinq fois 10 à la puissance 5 cellules par millilitre. Introduisez les cellules HeLa dans la région eucaryote du dispositif à un débit de deux millilitres par minute à l’aide d’une pompe à seringue Pico Plus.Ensuite, à l’aide d’un microscope optique, s’assurer que la vanne séparant la région bactérienne commensale de la région des cellules eucaryotes est complètement fermée afin que le biofilm bactérien soit distinct de la région des cellules helo. À l’aide d’un microcentrifugeur einor, pincer la sortie des cellules pour réduire le mouvement de la suspension cellulaire dans le canal et incuber pendant six heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Après l’incubation, perfuser le dispositif à l’aide d’une pompe à seringue avec 50 microlitres de milieu de croissance DMEM à raison de 0,5 millilitre par heure.Pour éliminer les cellules non attachées, renouvelez le milieu DMEM pour les régions de hela et d’e coli commensal toutes les six heures. Préparez l’e coli oh 1 5 7 H sept, ou EHEC, dans un milieu M neuf afin d’infester les cellules hela à une multiplicité d’infection ou MOI de 100 à 200 cellules EHEC pour une cellule hela. Éliminez les bactéries commensales faiblement attachées comme décrit dans la section précédente. Introduisez une suspension diluée de 100 microlitres d’EHEC (OD 600 d’environ 0,1) dans les îlots à l’aide d’une pompe à seringue à un débit de 0,25 millilitre par heure.Après cela, incuber l'appareil à 37 degrés Celsius dans un incubateur contenant 5 % de dioxyde de carbone pendant six heures sans flux, afin de permettre aux EHEC d'être exposés aux signaux présents dans le biofilm commensal. Après l'incubation, ouvrir la vanne séparant les régions bactériennes commensales et les cellules eucaryotes en utilisant une pompe à vide pour créer un vide, et maintenir la vanne ouverte pendant six heures. Cela exposera les HEC présents dans le biofilm bactérien commensal aux cellules HeLa. Incuber ensuite à nouveau pendant six heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur contenant 5 % de dioxyde de carbone.Introduire une solution de coloration vivant-mort dans le dispositif préparé conformément aux instructions du fabricant. Pour la coloration de la viabilité des cellules helo, injecter 0,1 millilitre de solution tampon dans la zone eucaryote du dispositif à l’aide d’une seringue d’un millilitre, comme témoin pour l’estimation de la mort des cellules helo. En l’absence d’EHEC, répéter les trois étapes précédentes et introduire dans le dispositif un milieu DMEM stérile, sans sérum ni antibiotique.Au lieu de cela, observez plusieurs emplacements sur un microscope à fluorescence Zeiss AIOt 200 M, et estimez le nombre de cellules épithéliales vivantes en vert parmi les cellules épithéliales mortes en rouge en comptant le nombre de cellules vertes sur des images obtenues à au moins sept emplacements. Nous allons maintenant présenter quelques images représentatives du dispositif microfluidique à couche capillaire. Sur cette image, nous utilisons un colorant alimentaire inerte pour représenter les différentes régions de culture.Le colorant violet représente la région de culture cellulaire eucaryote, tandis que le colorant vert représente le biofilm bactérien commensal. Sur cette image, nous démontrons la faisabilité de maintenir les régions eucaryotes et bactériennes distinctes l'une de l'autre, le colorant violet dans la région bactérienne étant bien séparé du colorant jaune environnant. La colonisation du biofilm bactérien commensal exprimant une protéine verte par des bactéries pathogènes exprimant une protéine rouge est illustrée ici.Comme le montre cette image, les bactéries EHEC et les bactéries commensales sont distinctes des cellules HeLa qui entourent le biofilm bactérien. Nous venons de vous montrer comment assembler un dispositif microfluidique en couche sèche pour la co-culture de bactéries et de cellules épithéliales, et pour étudier habituellement l'effet des signaux solubles sur la colonisation par les pathogènes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à éliminer toutes les bulles présentes dans le dispositif et d'utiliser le pathogène à un multiplicateur de contamination cellulaire approprié.Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.

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