Un dispositif microfluidique pour quantifier chimiotactisme des bactéries dans des gradients de concentration stable

Des E. coli RP437 sont introduits dans un dispositif de chimiotaxie où ils sont exposés à des gradients de concentration spatiale définis. Les cellules pénétrant dans la chambre rencontrent le point médian du gradient de concentration. Selon que le signal est perçu comme un attractant ou un répulsif, les bactéries se déplacent rapidement vers le haut ou vers le bas du gradient de concentration.

Bonjour, je suis Derek Engler du Laboratoire de biotechnologie moléculaire des systèmes et du Département de génie chimique de l'Université Texas A&M. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d'étudier la chimiotaxie bactérienne dans un dispositif microfluidique. Nous utilisons cette procédure dans nos laboratoires pour étudier la manière dont E. coli RP437 migre dans un gradient de concentration de sulfate de nickel.

Commençons. La couche fluidique et la couche de commande sont fabriquées par moulage par réplication de Polyméthyl SUBOXANE ou de PDMS à partir du moule maître en SU-huit. Pour commencer cette procédure, mélangez le prépolymère de PDMS et l'agent de réticulation selon un rapport pondéral de 10 à 1.

Dégazer le mélange dans un dessiccateur pendant une heure jusqu'à ce que les bulles d'air soient éliminées. Lorsque le mélange de PDMS est prêt, placer le moule maître SU huit dans une boîte de Pétri et verser soigneusement le mélange par-dessus le moule maître SU huit jusqu'à l'épaisseur souhaitée. Chauffer la boîte de Pétri contenant le PDMS et le moule maître SU huit à 80 degrés Celsius pendant deux heures afin de polymériser le PDMS.

Après deux heures, retirez du plateau chauffant le SSU huit maître recouvert de PDMS polymérisé et décollez le moule en PDMS du maître SU huit. La structure souhaitée sera intégrée au moule en PDMS à l’aide d’une aiguille émoussée de calibre 20 ; percez quatre trous dans le moule en PDMS pour y connecter des tubes destinés au générateur de gradient, à l’entrée des cellules et à la sortie des cellules. Nous sommes maintenant prêts à assembler le dispositif en PDMS afin de sceller le dispositif en PDMS.

Tout d'abord, nettoyez une lame de microscope en verre avec de l'isopropanol et séchez-la à l'aide d'un flux d'air. Ensuite, exposez le moule en PDMS et la lame de verre à un plasma d'oxygène dans un graveur à plasma pendant environ 30 secondes. Mettez en contact le moule en PDMS avec la lame de verre. Chauffez l'ensemble lame de verre et moule en PDMS mis en contact à 65 degrés Celsius sur une plaque chauffante pendant 15 minutes.

Pour assembler le dispositif en PDMS, utilisez une lame de rasoir pour couper le tube à un angle de 45 degrés à la longueur requise selon le montage du microscope. Puis, à l’aide de pinces, insérez une extrémité du tube dans l’un des quatre trous percés dans le dispositif.

Insérez un embout d'aiguille 30G à bout émoussé dans l'autre extrémité du tube. Répétez l'insertion du tube et de l'embout d'aiguille pour tous les trous restants. Chargez un millilitre de chémo-taxines, de tampon ou de CB dans une seringue de trois millilitres.

Veiller à éliminer l'air de la seringue. Ajouter le CB sur le raccord de l'aiguille de sortie à l'aide d'une pipette et tapoter le raccord de l'aiguille pour enlever toute bulle d'air. Expulser un peu de CB de l'extrémité de la seringue de trois millilitres et connecter la seringue au raccord de l'aiguille sans emprisonner d'air.

Poussez le CB à travers le dispositif jusqu'à ce que tous les embouts d'aiguille restants soient remplis de CB. Cela devrait éliminer la majorité des bulles d'air. Ensuite, remplissez deux seringues de 500 microlitres avec du CB contenant les concentrations appropriées de l'effecteur chimique testé.

Éliminer la formation de bulles d'air en expulsant une petite goutte du contenu de la seringue et en mettant en contact les gouttes de liquide situées dans l'embase de l'aiguille, puis en fixant la seringue pour préparer des bactéries hautement mobiles. Pour l'expérience de chimiotaxie, faire croître une culture de E. coli RP437 exprimant une GFP, en présence d'un plasmide, dans un bouillon tripton ou TB à 32 degrés Celsius avec agitation le jour suivant. Utiliser la culture de nuit pour ensemencer une culture de 20 millilitres de TB dans un flacon Erlenmeyer de 250 millilitres jusqu'à une densité optique à 600 nanomètres d'environ 0,05.

Faire croître la culture à 32 degrés Celsius avec agitation lorsque les cellules présentent une DO 600 d'environ 0,35 à 0,45. Les récolter par centrifugation à basse vitesse, puis resuspendre les cellules à une DO 600 d'environ 0,35 dans du CB contenant l'effecteur chimiotactique à la concentration attendue au milieu du canal. Enfin, ajouter des cellules mortes marquées par la RFP à une DO 600 d'environ 0,35 aux cellules vivantes exprimant la GFP.

Ces cellules mortes serviront de témoin interne afin de s'assurer que toute migration n'est pas due à des effets de flux. La suspension cellulaire est désormais prête à être chargée dans le dispositif microfluidique pour l'expérience de chimiotaxie. Pour commencer l'expérience de chimiotaxie, retirez une partie du CB de l'embout d'entrée des cellules, puis rechargez avec la suspension cellulaire.

Remplissez délicatement une seringue de 50 microlitres avec les cellules resuspendues. Effectuez cette opération lentement, car les flagelles peuvent être cisaillés, ce qui réduirait la mobilité. Fixez la seringue de 50 microlitres au raccord d'entrée de l'aiguille comme indiqué précédemment, en expulsant une petite goutte du contenu de la seringue, en mettant la goutte en contact avec le liquide présent dans le raccord de l'aiguille, puis en fixant la seringue. Placez l'appareil sur la platine d'un microscope à fluorescence équipé d'une caméra haute vitesse pour l'acquisition d'images.

Placer les deux seringues d'entrée dans la pompe à seringue et démarrer le flux de manière à former le gradient et à faire circuler les cellules à travers le tube. Une fois que les cellules sont entrées dans la chambre de chimiotaxie, attendre environ 20 minutes pour que le système se stabilise. Avant l'acquisition d'images, capturer des images de fluorescence vertes (cellules vivantes) et rouges (cellules mortes) en direct à différents endroits le long de la longueur de la chambre.

Typiquement, nous collectons 100 images à chaque emplacement à des intervalles de trois secondes. Les images de fluorescence acquises peuvent être analysées à l'aide de tout logiciel d'analyse d'images disponible commercialement, tel qu'Image J ou Metamorph, ou à l'aide de codes simples écrits en Matlab. Dans cet exemple, nous utiliserons des codes MATLAB.

Commencez par supprimer les pixels de fond dans l'image à l'aide de ce seuil d'intensité des pixels, et retirez tous les pixels dont l'intensité est inférieure au seuil. Cela permet de minimiser le bruit. Lors de l'analyse, utilisez la position des cellules mortes pour déterminer le centre de l'image.

Ceci représente la position où les cellules sont entrées dans la chambre de chimiotaxie et où elles seraient détectées en l'absence de migration. Ensuite, localisez les cellules vivantes sur l'image, divisez l'image en canaux et déterminez le nombre de cellules vivantes dans chaque canal. Dans nos travaux antérieurs, la chambre de chimiotaxie large de 10 à 50 micromètres était divisée en 64 canaux, chacun mesurant environ 16 micromètres de large.

Après avoir répété ces étapes pour toutes les images, certains des décomptes totaux de cellules pour chaque canal sur l'ensemble des images. Cela fournit le nombre total de cellules détectées dans chaque canal au cours de la durée de l'expérience. Calculez les chimiotaxies, le coefficient de partage ou CPC, qui représente la direction de la migration.

En effectuant les étapes suivantes, attribuez un multiplicateur de plus un et de moins un à chaque cellule située respectivement du côté de haute concentration ou droit et du côté de basse concentration ou gauche des cellules mortes. Additionnez toutes les valeurs multipliées puis normalisez par rapport au nombre total de cellules détectées. Calculez le chimiotactisme, le coefficient de migration ou CMC, qui pondère la migration des cellules par la distance parcourue.

Une cellule qui se déplace jusqu’au canal de position de concentration maximale 64 se voit attribuer un facteur de pondération de plus un, tandis qu’une cellule qui progresse à mi-chemin vers le côté de plus forte concentration reçoit un facteur de pondération de plus 0,5. Une cellule se déplaçant jusqu’à la position de concentration minimale la plus éloignée est pondérée par moins un. La somme de tous les comptages cellulaires pondérés est normalisée par rapport au nombre total de cellules afin de générer le CMC.

Ce graphique montre un gradient de concentration linéaire ou un profil formé dans le dispositif microfluidique à l'aide de l'isothiocyanate de fluorescéine. La formation d'un gradient de concentration est illustrée sur cette figure à l'aide de colorants bleu et jaune. L'entrée cellulaire était CA afin qu'aucun écoulement ne passe à travers, et on observe qu'une gamme de couleurs entre le bleu et le jaune est formée.

Voici des images en fausses couleurs provenant d'une expérience de chimiotaxie représentative dans laquelle des e coli RP 4 37 ont été exposés à un gradient allant de zéro à 100 micromolaire de L-aspartate ou de zéro à 225 micromolaire de sulfate de nickel dans le dispositif. La migration des bactéries vertes vivantes vers l'aspartate ou à l'opposé du nickel a été filmée toutes les 2,5 secondes pendant 30 minutes. Les bactéries mortes, montrées en rouge, ont servi de témoin pour les effets de flux dans le dispositif.

La répartition spatiale du RP 4 37 dans le dispositif microfluidique en l'absence de gradient est illustrée dans ce graphique, comparée à sa réponse à un gradient d'aspartate et à un gradient de sulfate de nickel. Nous venons de vous montrer comment surveiller les chimiotaxies de la souche RP 4 37 d’E. coli dans un gradient de sulfate de nickel. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de minimiser le vortexage des cellules afin d'utiliser une sous-population présentant une forte mobilité.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.