Un dispositif microfluidique pour quantifier chimiotactisme des bactéries dans des gradients de concentration stable

E Coli RP 4 37 sont introduits dans un appareil de chimiotaxie où ils sont exposés à une concentration spatiale définie. Les cellules de gradient entrant dans la chambre rencontrent le point médian du gradient de concentration. Selon que le signal est perçu comme un attractif ou un répulsif, les bactéries se déplacent rapidement vers le haut ou vers le bas du gradient de concentration.

Bonjour, je m’appelle Derek Engler et je travaille au Laboratoire de biotechnologie des systèmes moléculaires et au Département de génie chimique de l’Université Texas a et m. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’étude des taxes de chimiothérapie bactériennes dans un dispositif microfluidique. Nous utilisons cette procédure dans nos laboratoires pour étudier comment e coli RP 4 37 migre dans le gradient de concentration du sulfate de nickel.

Alors commençons. La couche fluidique et la couche de contrôle sont réalisées par moulage réplique de Polyméthyl SUBOXANE ou PDMS à partir du maître SU huit. Pour commencer cette procédure, mélangez le prépolymère PDMS et l’agent de réticulation dans un rapport de poids de 10 pour un.

Dégazez le mélange dans un dessécheur pendant une heure jusqu’à ce que les bulles d’air soient éliminées. Lorsque le mélange PDMS est prêt, placez le SU eight master dans une boîte de Pétri et versez soigneusement le mélange sur le SU eight master jusqu’à l’épaisseur souhaitée. La boîte de Pétri contenant le PDMS et le moule maître SU huit à 80 degrés Celsius pendant deux heures pour durcir le PDMS.

Après deux heures, retirez le SSU eight master recouvert de PDMS durci de la plaque chauffante et décollez le moule PDMS du SU eight master. La structure souhaitée sera intégrée dans le moule PDMS à l’aide d’une aiguille à extrémité émoussée de calibre 20 perforée quatre trous dans le moule PDMS pour le tube vers le générateur de gradient, l’entrée et la sortie de la cellule. Nous sommes maintenant prêts à assembler le dispositif PDMS pour le coller.

Tout d’abord, nettoyez une lame de microscope en verre avec de l’isopropanol et essayez-la avec un Airstream. Ensuite, exposez le moule PDMS et la lame de verre au plasma d’oxygène dans un graveur plasma pendant environ 30 secondes. Mettez le moule PDMS en contact avec la lame de verre Chauffez la lame en contact et le moule PDMS à 65 degrés Celsius sur une plaque chauffante pendant 15 minutes.

Pour assembler l’appareil PDMS, utilisez une lame de rasoir pour couper le tube à un angle de 45 degrés à la bonne longueur requise en fonction de la configuration du microscope. Puis à l’aide d’une pince. Insérez une extrémité du tube dans l’un des quatre trous perforés dans l’appareil.

Insérez un embout d’aiguille émoussé de calibre 30 dans l’autre extrémité du tube. Insertion répétée du tube et du moyeu de l’aiguille pour tous les trous restants. Chargez un millilitre de taxes de chimiothérapie, de tampon ou de CB dans une seringue de trois millilitres.

En prenant soin d’évacuer l’air de la seringue. Ajoutez du CB dans l’embout de l’aiguille de sortie à l’aide d’une pipette et tapotez l’embout de l’aiguille pour éliminer les bulles d’air. Poussez un peu de CB hors de l’extrémité de la seringue de trois millilitres et connectez la seringue à l’embout de l’aiguille sans emprisonner l’air.

Poussez CB à travers l’appareil jusqu’à ce que tous les embouts d’aiguille restants soient remplis de CB. Cela devrait éliminer la majorité des bulles d’air. Ensuite, remplissez deux seringues de 500 microlitres avec du CB contenant les concentrations appropriées de l’effecteur de chimiothérapie testé.

Éliminez la formation de bulles d’air en expulsant une petite goutte du contenu de la seringue et en touchant les gouttes de liquide dans le moyeu de l’aiguille et en fixant la seringue pour préparer les bactéries très mobiles. Pour l’expérience de chimiotaxie, cultivez une culture nocturne d’e coli RP 4 37 avec une expression GFP, plasmide dans un bouillon tripton ou TB à 32 degrés Celsius en secouant le lendemain. Utilisez la culture de nuit pour inoculer une culture de 20 millilitres de TB dans un erlenmeyer de 250 millilitres à une densité optique à 600 nanomètres d’environ 0,05.

Cultivez la culture à 32 degrés Celsius en secouant lorsque les cellules sont à une OD 600 d’environ 0,35 à 0,45. Récoltez-les par centrifugation à basse vitesse, résus en suspension des cellules à un OD 600 d’environ 0,35 en CB contenant l’effecteur de chimiothérapie à la concentration attendue au milieu du canal. Enfin, ajoutez des cellules mortes marquées RFP à aucun D 600 d’environ 0,35 à la GFP exprimant des cellules vivantes.

Ces cellules mortes feront l’objet d’un contrôle interne pour s’assurer qu’aucune migration n’est due à des effets d’écoulement. La suspension cellulaire est maintenant prête à être chargée dans le dispositif microfluidique pour l’expérience de chimiotaxie. Pour commencer l’expérience de chimiotaxie, retirez une partie du CB de la recharge de l’aiguille d’entrée de la cellule avec la suspension cellulaire.

Remplissez doucement une seringue de 50 microlitres avec les cellules remises en suspension. Faites-le lentement car les flagelles peuvent être cisaillés, ce qui réduira la motilité. Fixez la seringue de 50 microlitres à l’embout de l’aiguille d’entrée comme indiqué précédemment en poussant une petite goutte du contenu de la seringue et en touchant la goutte au liquide dans l’embout de l’aiguille et en fixant la seringue positionnez l’appareil sur la platine d’un microscope à fluorescence équipé d’une caméra à grande vitesse pour l’acquisition d’images.

Placez les deux seringues d’entrée dans le pousse-seringue et initiez l’écoulement de manière à ce que le gradient se forme et que les cellules s’écoulent à travers le tube. Une fois que les cellules entrent dans la chambre de chimio-taxes, attendez environ 20 minutes pour que le système se stabilise. Avant l’imagerie, collectez des images de fluorescence vertes et rouges mortes à différents endroits sur toute la longueur de la chambre.

En général, nous collectons 100 images à chaque endroit à trois secondes d’intervalle. Les images de fluorescence acquises peuvent être analysées à l’aide de n’importe quel programme d’analyse d’images disponible dans le commerce, tel que Image J ou metamorph, ou à l’aide de codes simples écrits dans matlab. Dans cet exemple, nous allons utiliser des codes MATLAB.

Commencez par supprimer les pixels d’arrière-plan de l’image via ce seuil d’intensité de pixel défini, puis supprimez tous les pixels dont l’intensité est inférieure au seuil. Cela minimise le bruit. Dans l’analyse, utilisez la position des cellules mortes pour déterminer le centre de l’image.

Cela représente la position où les cellules sont entrées dans la chambre de chimiotaxie et où elles seraient détectées en l’absence de toute migration. Ensuite, localisez les cellules actives dans l’image, divisez l’image en canaux et déterminez le nombre de cellules actives dans chaque canal. Dans nos travaux précédents, la chambre de chimio-taxes de 10 à 50 micromètres de large a été divisée en 64 canaux d’environ 16 micromètres de large chacun.

Après avoir répété ces étapes pour toutes les images, une partie du nombre total de cellules pour chaque canal est comprise dans toutes les images. Cela donne le nombre total de cellules détectées à chaque canal pendant la durée de l’expérience. Calculez les taxes de chimiothérapie, le coefficient de partage ou CPC, qui représente le sens de la migration.

En effectuant les étapes suivantes, attribuez un multiplicateur de plus un et moins un à chaque cellule située respectivement dans la partie haute concentration ou les côtés droit et gauche des cellules mortes. Additionnez toutes les valeurs multipliées et normalisez le nombre total de cellules détectées. Calculez les taxes de chimiothérapie, le coefficient de migration, ou CMC, qui pondère la migration des cellules en fonction de la distance parcourue.

Une cellule qui se déplace vers la position de concentration la plus éloignée, le canal 64, reçoit un facteur de pondération de plus un, tandis qu’une cellule qui se déplace à mi-chemin du côté de la concentration la plus élevée reçoit un facteur de poids de plus 0,5 et une cellule. Le déplacement vers la position de concentration la plus éloignée est pondéré par moins un. Une partie de tous les nombres de cellules pondérés et normalisés au nombre de cellules pour générer la CMC.

Ce graphique montre un gradient ou un profil de concentration linéaire formé dans le dispositif microfluidique à l’aide d’isothiocyanate de fluorescéine. La formation d’un gradient de concentration est démontrée sur cette figure à l’aide de colorants de couleur bleu et jaune. L’entrée de la cellule était CA de sorte qu’il n’y avait pas de flux à travers elle, et on peut voir qu’une gamme de couleurs entre le bleu et le jaune se forme.

Voici des images pseudo-couleurs d’une expérience de chimiotaxie représentative dans laquelle e coli RP 4 37 a été exposé à un gradient de zéro à 100 micromolaires de L aspartate ou de zéro à 225 micromolaires de sulfate de nickel dans le dispositif. La migration des bactéries vertes vivantes vers l’al-aspartate ou loin du nickel a été imagée toutes les 2,5 secondes pendant 30 minutes. Les bactéries mortes indiquées en rouge servaient de contrôle des effets de flux dans l’appareil.

La distribution spatiale de RP 4 37 dans le dispositif microfluidique en l’absence de gradient est illustrée dans ce graphique par rapport à sa réponse à un gradient d’aspartate et à un gradient de sulfate de nickel. Nous venons de vous montrer comment surveiller les taxes de chimiothérapie d’e coli RP 4 37 dans un gradient de sulfate de nickel. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de minimiser le vortex des cellules afin qu’une sous-population à forte motilité puisse être utilisée.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.