Name: Un dispositif microfluidique pour quantifier chimiotactisme des bactéries dans des gradients de concentration stable (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-19T17:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Découvrez un dispositif microfluidique pour quantifier le chimiotactisme bactérien dans des gradients stables. Cette méthode permet d'étudier le mouvement d'E. coli RP 4 37 en réponse à des signaux chimiques.

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1. La fabrication des maîtres de silicium en utilisant la norme SU-8 photolithographie 1 (non représenté dans cette vidéo). <ol><li> Utilisez du papier standard SU-8 méthodes photolithographie pour créer un SU-8 "maître" (SU-8 2025, MicroChem, Newton, MA) pour la fabrication du moule de PDMS qui contient le réseau microfluidique et la chambre de chimiotactisme. Ces moules maître peut être fabriqué dans toute installation de microfabrication (par exemple, Stanford Microfluidique Fonderie; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li> Avant de réplication PDMS, exposer le SU-8 maître à fluorosilane vapeur dans un dessiccateur attaché à une source de vide pour faciliter la libération facile de PDMS par le maître. Ajouter une goutte de fluorosilane d'une serviette en papier et appliquer le vide pendant une minute. Retirez le vide et laissez 30 min pour le dépôt de fluorosilane. Gardez le SU-8 de maître dans un récipient fermé pour une utilisation future. </li></ol> 2. Réplique de moulage de PDMS de SU-8 maître: La couche fluidique et la couche de contrôle sont réalisés par moulage réplique de PDMS de SU-8 maître. <ol><li> Mélanger le PDMS pré-polymère et cross-linker à un poids de 10h01. Ratio et dégazer dans un dessiccateur pendant 1 heure (ou jusqu'à ce que les bulles d'air sont éliminés du mélange PDMS). </li><li> Placez le SU-8 maître dans une boîte de Pétri et verser délicatement le mélange PDMS sur le dessus de la SU-8 master à l'épaisseur souhaitée. </li><li> Chauffer la boîte de Pétri contenant le PDMS et le SU-8 moule maître à 80 ° C pendant deux heures pour guérir le PDMS. </li><li> Retirez le guérir PDMS-couverte SU-8 maîtres de la plaque de cuisson, éplucher les moisissures PDMS de la SU-8 maître. La structure désirée sera intégré dans le moule PDMS. </li><li> Percez des trous dans le moule PDMS pour les tubes du générateur de gradient et l'entrée des cellules en utilisant un calibre 20 à bout émoussé aiguille. </li></ol> 3. Collage de dispositifs de PDMS: <ol><li> Nettoyer une lame de microscope en verre avec de l'isopropanol et sec à l'azote ou un courant d'air. </li><li> Exposez le PDMS et lame de verre pour un plasma d'oxygène dans un Asher plasma. </li><li> Apportez le moule PDMS en contact avec la lame de verre. Chauffer la lame contacté et le moule PDMS à 65 ° C pendant 15 min. </li></ol> 4. L'assemblage du dispositif de PDMS <ol><li> En utilisant une lame de rasoir, couper des tubes à un angle de 45 ° à la bonne longueur requise pour le périphérique. </li><li> Insérez une extrémité du tube dans les trous percés dans l'appareil (par exemple, sortie) en utilisant une pince. </li><li> En utilisant une pince, insérez un émoussé 30 aiguille de calibre dans l'autre extrémité du tube. </li><li> Répétez l'étape 4.2 pour tous les trous restants. </li><li> Recueillir 1ml de tampon de chimiotactisme (CB) dans une seringue de 3 ml, en prenant soin d'enlever les bulles d'air de la seringue. </li><li> Correction d'un manchon de l'aiguille à une extrémité de la tubulure de sortie. </li><li> Ajouter CB à l'embout de l'aiguille, et appuyez sur l'embout de l'aiguille pour enlever les bulles d'air. </li><li> Poussez un peu CB de la pointe de la seringue et raccorder la seringue 3 mL à l'embout de l'aiguille, sans piégeage de l'air. </li><li> Poussez CB à travers le dispositif jusqu'à ce que tous hubs aiguilles restantes sont remplies avec des CB. Cela devrait éliminer la majorité des bulles d'air. </li><li> Remplir deux seringues 500μL avec CB contenant les concentrations appropriées de l'chemoeffector testé. Éliminer la formation de bulles d'air en poussant une petite goutte de contenu de la seringue et touchant la chute du liquide dans le moyeu de seringues et attachant. </li><li> De même, connectez une seringue contenant CB à l'entrée des bactéries. Ce sera retirée lorsque les bactéries sont introduites dans le dispositif. </li></ol> 5. La croissance des très mobiles E. coli <ol><li> Cultivez cultures d'une nuit de E. coli RP437 avec une expression de la GFP plasmide dans 20 ml de bouillon de tryptone (TB) à 32 ° C avec agitation. Ajouter des concentrations appropriées d'antibiotiques pour maintenir le plasmide. Dans notre protocole, nous utilisons un pCM182 faible nombre de copies de plasmide pour détecter des bactéries basée sur la fluorescence dans l'appareil. Pour E. coli, les cultures en croissance à 32 ° C est recommandée pour la motilité élevée, que la motilité est inférieur à des températures élevées. </li><li> Utilisez la culture de la nuit pour inoculer une culture de 20 mL de la tuberculose dans un erlenmeyer de 250 ml pour une densité optique à 600nm de ~ 0,05. Cultiver la culture avec agitation à 32 ° C. </li><li> Récolter les cellules à une DO 600 de ~ 0,35 0,45 par centrifugation à basse vitesse à 400 xg pendant 5 min. </li><li> Resuspendre les cellules d'une DO 600 de ~ 0,35 en CB contenant les chemoeffector à la concentration attendue dans le milieu du chenal. </li><li> Ajouter DP marqué les cellules mortes à une DO 600 de ~ 0,35 dans les cellules exprimant la GFP en direct. Les morts (rouge), les cellules sont utilisées comme contrôle interne pour s'assurer que toute migration n'est pas due aux effets de flux. </li></ol> 6. Chimiotactisme surveillance <ol><li> Retirez une partie de la CB de l'aiguille d'entrée de cellulemoyeu. Remplir avec la suspension cellulaire. </li><li> Doucement remplir la seringue 50 pl avec les cellules en suspension. Cette étape doit être fait lentement que les flagelles peuvent être cisaillées et permettra de réduire la motilité. </li><li> Fixer la seringue 50 pl au hub d'entrée-aiguille comme décrit dans l'étape étapes 4.10. </li><li> Placez l'appareil sur la scène d'un microscope à fluorescence équipé d'une caméra à haute vitesse d'acquisition d'images. Placez les seringues d'entrée (à la fois les 500 seringues gradient ul et la seringue de 50 uL de cellules) dans la seringue et d'initier des flux tels que le gradient est formé et les cellules sont coule à travers le tube. </li><li> Une fois que les cellules entrent dans la chambre chimiotactisme, attendez environ 20 minutes pour le système de se stabiliser avant d'imagerie. </li><li> Recueillir verts (vivants) et rouges (mort) des images de fluorescence à différents endroits le long de la longueur de la chambre (correspondant à différents temps d'exposition). Généralement, nous recueillons de 100 images à chaque endroit, à intervalles 3 sec. </li></ol> 7. Analyse des données: Les étapes suivantes peuvent être effectuées en utilisant un logiciel de retouche disponibles dans le commerce d'analyse (par exemple, ImageJ, Metamorph) ou en utilisant des codes simple écrit en Matlab. <ol><li> Enlever les pixels du fond dans l'image (par exemple, l'intensité des pixels seuil fixé et enlever tous les pixels qui ont l'intensité inférieure au seuil). Ce bruit minimise dans l'analyse. </li><li> Utilisez la position des cellules mortes (fluorescence rouge) pour déterminer le centre de l'image. Puisque les cellules mortes ne montrent pas de chimiotactisme, cela représente la position où les cellules entra dans la chambre chimiotactisme et serait détectée en l'absence de toute migration. </li><li> Localisez des cellules vivantes (fluorescence verte) dans l'image. </li><li> Diviser l'image en canaux et déterminer le nombre de cellules vivantes dans chaque canal. Dans notre travail avant 3, la gamme 1050 um chimiotactisme chambre a été divisée en 64 canaux qui sont chacun 16 ~ um de large. </li><li> Répétez les étapes 7.1 7.3 pour toutes les images et la somme du nombre total de cellules pour chaque canal à travers toutes les images. Cela donne le nombre total de cellules détectées à chaque canal au cours de la durée de l'expérience. </li><li> Calculer le coefficient de partage chimiotactisme (PCC), qui représente la direction de la migration, comme suit: Chaque cellule située dans la haute concentration (à droite) et une faible concentration (à gauche) sur les côtés des cellules mortes est attribué un coefficient multiplicateur de 1 et -1 , respectivement. C'est une cellule qui migre d'un gradient est multipliée par 1 tandis que les cellules en descendant la pente sont multipliés par -1. Toutes les valeurs sont multipliés sont additionnés et normalisés pour le nombre total de cellules détectées. Par exemple, une valeur CPC de 0,40 indique que 40% de plus des bactéries totales déplacé sur le côté haute concentration que le côté faible concentration (ie, le chemoeffector un attractif que plus de bactéries ont été détectées le déplacement jusqu'à la pente). </li><li> Calculer le coefficient de migration chimiotactisme (CMC), qui pèse la migration des cellules par la distance parcourue, comme suit: Poids de la numération des cellules dans chaque canal par un facteur qui est proportionnelle à la distance que les cellules migrent. Une cellule qui se déplace vers le plus éloigné à forte concentration de position (canal 64) est donné un facteur de pondération de 1, tandis que celui qui se déplace à mi-chemin dans le côté plus forte concentration se voit attribuer un facteur de pondération de 0,5, et une cellule de passer à la plus éloignée faible concentration de position est pondéré par -1. Somme toute la numération des cellules pondérées et normaliser le nombre de cellules pour générer la CMC. </li></ol> 3,4 résultats représentatifs: Nous avons utilisé le dispositif microfluidique (figure 1A) décrit ici pour enquêter sur le chimiotactisme des E. coli dans des gradients d'attractifs (l'acide aspartique, autoinducteur-2) et des répulsifs (NiSO 4, l'indole) 3,4. Le prototype de chimiotactisme souche 5 E. coli exprimant la GFP RP437 a été utilisé, avec la kanamycine tué E. coli TG1 cellules exprimant une protéine fluorescente rouge pour surveiller les effets des flux. Le gradient de concentration formé dans le dispositif μFlow est montré dans la figure 1B. L'entrée de la cellule a été plafonné, de sorte qu'il n'y avait pas de flux à travers elle et un gradient stable de 0 à 100 ng / mL de fluoresscein a été établi dans l'appareil. L'intensité d'un pixel à travers le dispositif a été utilisé pour déterminer le profil de concentration de fluorescéine. Les données montrent que les bactéries rencontrez un dégradé linéaire quand ils entrent dans la chambre de chimiotactisme. Figure 2A et B montre des images de fluorescence de E. coli RP437 migrer en réponse à des gradients de l'acide aspartique (0 100 M) et NiSO 4 (0 225 uM). Les réponses observées à ces attractif et répulsif canoniques sont comme prévu. Figure 3A montre la répartition chiffrée des E. coli RP437 en l'absence d'un gradient de concentration (ie, la pente nulle de l'acide aspartique), tandis queFigures 3B et C montrent la distribution des gradients de l'acide aspartique et NiSO 4. La spécificité de ces réponses (ie, le biais de la migration) se présente comme une E. coli RP437 Δ tar souche (ie, la souche qui n'ont pas les chémorécepteurs de goudron qui est utilisé dans E. coli au sens acide aspartique et de nickel) ne démontre pas le biais de la migration dans la présence d'un gradient de concentration de l'acide aspartique ou NiSO 4. Les tendances évidentes dans les profils de distribution spatiale sont également compatibles avec le PCC et les valeurs calculées CMC. Les valeurs PCC pour la migration de E. coli dans le RP437 gradients de l'acide aspartique ou de sulfate 4 sont 0,33 et -0,33, respectivement. Les valeurs correspondantes sont de CMC et de 0,13 -0,14, respectivement. En revanche, le PCC et MCC valeurs avec les E. coli RP437 Δ tar souche dans des gradients de l'acide aspartique ou NiSO 4 sont négligeables. En outre, le PCC et le CMC dans un gradient nul de l'acide aspartique sont 0,03 et 0,02, respectivement, et indiquer l'absence de biais dans la migration en l'absence d'un gradient. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1a.jpg" alt="Figure 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1b.jpg" alt="Figure 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1b"> Figure 1. Schématiques périphériques et gradient de concentration. Représentation schématique (A) du dispositif microfluidique chimiotactisme. Le dispositif se compose d'un module de gradient de mélange (20 x 100 x 18 750 um) et un module d'observation chimiotactisme (20 x 1050 x 11 500 um). Les largeurs des deux canaux de gradient entrer dans le dispositif sont de 500 um et la largeur de l'entrée de bactéries est de 50 um. L'encart montre un gradient de molécule de signalisation (gris) et les bactéries migrent en réponse à elle. Des bactéries vivantes sont dépeints comme des ovales solide, alors que les bactéries mortes sont représentés par des ovales ouverts. (B) Un gradient de concentration entre 0 et 100 ng / ml de fluorescéine a été générée dans l'appareil et imagées par microscopie à fluorescence. Images de fluorescence ont été acquises après 30 min et quantifiée par analyse d'image. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Chimiotactisme des E. coli RP437 dans le dispositif microfluidique. E. coli RP437 a été exposé à un gradient de (A) 0-100 pM L-aspartate ou (B) 0 à 225 uM NiSO 4 dans l'appareil et la migration des bactéries vivantes (vert) en direction de L-aspartate ou loin de nickel imagée à toutes les secondes de 2,5 pour 30 min. Bactéries mortes (en rouge) a servi de contrôle pour les effets d'écoulement dans le dispositif. Les images ont été quantifiés en utilisant une développée en interne l'analyse programme3. Les données présentées sont représentatives des pseudo-couleur des images à partir de trois expériences indépendantes. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3a.jpg" alt="Figure 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="La figure 3a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3b.jpg" alt="Figure 3b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3b"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3c.jpg" alt="Figure 3c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3c"> Figure 3: Quantification des profils de migration d'un attractif et répulsif canoniques. La distribution spatiale des RP437 dans le dispositif microfluidique en réponse à (A) uniformes 100 pM L-aspartate (ie, pas de gradient), (B) un gradient de 0 100 uM de l'aspartate, et (C) un gradient de 0 225 uM de NiSO 4 . La distribution des cellules mortes est représentée par une ligne solide, la distribution de cellules RP437 est montré comme une ligne pointillée, et la distribution de cellules RP437 eda + tar Δ est montré comme une ligne pointillée. Les données présentées sont en moyenne de trois expériences indépendantes.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
<li>Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+GFP+fluorescence+in+cells+of+Streptococcus+gordonii+under+conditions+of+low+pH+and+low+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration.</a> Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).</li>
<li>Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Flow-Based+Microfluidic+Device+for+Quantifying+Bacterial+Chemotaxis+in+Stable%2C+Competing+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).</li>
<li>Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEnglert%2C+DL+%22Microfluidic+techniques+for+the+analysis+of+bacterial+chemotaxis%22">Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis</a>. , Humana press. (2009).</li>
<li>Mao, H., Cremer, P. S., &amp, M. anson <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).</li>
</ol>

Le coefficient de partage chimiotactisme (PCC) et le coefficient de migration chimiotactisme (CMC) peut être calculé comme décrit dans Mao et al 5. Si une cellule est détectée sur le côté haute concentration, il est donné une valeur de 1, alors qu&#39;une cellule détectée sur le côté faible concentration est donné une valeur de -1. Les valeurs sont additionnées et divisées par le nombre total de cellules pour générer le PCC. Le signe de la CPC (positive ou négative) donne la direction de la migratio...

un dispositif microfluidique pour quantifier chimiotactisme des bactéries dans des gradients de concentration stable

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chimiotactisme permet aux bactéries de l&#39;approche des sources de produits chimiques attractives ou pour éviter les sources de produits chimiques répulsifs. Bactéries surveiller en permanence la concentration de chemoeffectors spécifiques en comparant la concentration actuelle à la concentration détectée quelques secondes plus tôt. Cette comparaison permet de déterminer le sens net de mouvement. Bien que plusieurs gradients concurrentes coexistent souvent dans la nature, les approches conventionnelles d&#39;enquêter sur le chimiotactisme des bactéries ne sont pas optimales pour quantifier la migration en réponse aux gradients de concentration d&#39;attractifs et répulsifs. Ici, nous décrivons le développement d&#39;un modèle de chimiotactisme microfluidique pour présenter des gradients de concentration précis et stable des chemoeffectors aux bactéries et quantitativement enquêter sur leur réponse au gradient appliqué. L&#39;appareil est polyvalent dans ce gradients de concentration de toute concentration désirée et la force absolue du gradient peuvent être facilement générés par le mélange diffusif. L&#39;appareil est démontré en utilisant la réponse de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; RP437 aux gradients d&#39;acides aminés et des ions de nickel.

Ce protocole décrit le développement d&#39;un dispositif microfluidique pour étudier la chimiotaxie bactérienne dans des gradients de concentration stable de chemoeffectors.

Un dispositif microfluidique pour quantifier chimiotactisme des bactéries dans des gradients de concentration stable

La chimiotaxie permet aux bactéries de s'approcher de sources de produits chimiques attracteurs ou d'éviter des sources de produits chimiques répulsifs. Les bactéries surveillent constamment le...

Des E. coli RP437 sont introduites dans un dispositif de chimiotaxie où elles sont exposées à des gradients de concentration spatiale définis. Les cellules pénétrant dans la chambre rencontrent le point médian du gradient de concentration. Selon que le signal est perçu comme un attractant ou un répulsif, les bactéries se déplacent rapidement soit en amont, soit en aval du gradient de concentration.Bonjour, je suis Derek Engler du Laboratoire de biotechnologie moléculaire des systèmes et du Département de génie chimique de l'Université Texas A&M. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'étudier la chimiotaxie bactérienne dans un dispositif microfluidique. Nous utilisons cette procédure dans nos laboratoires pour analyser la manière dont E. coli RP437 migre dans un gradient de concentration de sulfate de nickel.Commençons. La couche fluidique et la couche de commande sont fabriquées par moulage par réplication de Polyméthyl SUBOXANE ou de PDMS à partir du moule maître SU huit. Pour commencer cette procédure, mélangez le prépolymère de PDMS et l'agent de réticulation selon un rapport pondéral de 10 à 1.Dégazez le mélange dans un dessiccateur pendant une heure jusqu'à ce que les bulles d'air soient éliminées. Lorsque le mélange de PDMS est prêt, placez le moule SU huit dans une boîte de Pétri et versez soigneusement le mélange par-dessus le moule SU huit jusqu'à l'épaisseur souhaitée. Chauffez la boîte de Pétri contenant le PDMS et le moule maître SU huit à 80 degrés Celsius pendant deux heures afin de polymériser le PDMS.Après deux heures, retirez du banc chauffant le SSU huit maître recouvert de PDMS polymérisé et décollez le moule en PDMS du maître SU huit. La structure souhaitée sera intégrée au moule en PDMS à l'aide d'une aiguille de calibre 20 à extrémité émoussée ; percez quatre trous dans le moule en PDMS pour y connecter des tubulures menant au générateur de gradient, à l'entrée des cellules et à la sortie des cellules. Nous sommes maintenant prêts à assembler le dispositif en PDMS afin de sceller ce dernier.Tout d'abord, nettoyez une lame de microscope en verre avec de l'isopropanol et séchez-la à l'aide d'un flux d'air. Ensuite, exposez le moule en PDMS et la lame de verre à un plasma d'oxygène dans un graveur à plasma pendant environ 30 secondes. Mettez en contact le moule en PDMS avec la lame de verre. Chauffez l'ensemble lame et moule en PDMS mis en contact à 65 degrés Celsius sur une plaque chauffante pendant 15 minutes.Pour assembler le dispositif en PDMS, utilisez une lame de rasoir pour couper le tube à un angle de 45 degrés à la longueur requise selon le montage du microscope. Ensuite, à l’aide de pinces, insérez une extrémité du tube dans l’un des quatre trous percés dans le dispositif.Insérez un embout d'aiguille 30G à bout émoussé dans l'autre extrémité du tube. Répétez l'insertion du tube et de l'embout d'aiguille pour tous les trous restants. Chargez un millilitre de chemo taxis, de tampon ou de CB dans une seringue de trois millilitres.Veiller à éliminer l'air de la seringue. Ajouter le CB sur le raccord de l'aiguille de sortie à l'aide d'une pipette et tapoter le raccord de l'aiguille pour enlever toute bulle d'air. Expulser un peu de CB de l'extrémité de la seringue de trois millilitres et connecter la seringue au raccord de l'aiguille sans emprisonner d'air.Poussez le CB à travers le dispositif jusqu'à ce que tous les embouts d'aiguille restants soient remplis de CB. Cela devrait éliminer la majorité des bulles d'air. Ensuite, remplissez deux seringues de 500 microlitres avec du CB contenant les concentrations appropriées de l'effecteur chimiotactique testé.Éliminer la formation de bulles d'air en expulsant une petite goutte du contenu de la seringue, en mettant en contact les gouttes de liquide situées dans l'embase de l'aiguille, puis en fixant la seringue afin de préparer des bactéries hautement mobiles. Pour l'expérience de chimiotaxie, cultiver une culture sur une nuit d'Escherichia coli RP437 exprimant une GFP, en présence d'un plasmide, dans un bouillon triptonique ou TB à 32 °C sous agitation. Utiliser cette culture sur une nuit pour ensemencer une culture de 20 millilitres de TB dans un flacon Erlenmeyer de 250 millilitres, afin d'obtenir une densité optique à 600 nanomètres d'environ 0,05.Faire croître la culture à 32 degrés Celsius avec agitation lorsque les cellules présentent une DO 600 d'environ 0,35 à 0,45. Les récolter par centrifugation à basse vitesse, puis resuspendre les cellules à une DO 600 d'environ 0,35 dans du CB contenant l'effecteur chimiotactique à la concentration attendue au milieu du canal. Enfin, ajouter des cellules mortes marquées par la RFP à une DO 600 d'environ 0,35 aux cellules vivantes exprimant la GFP.Ces cellules mortes serviront de témoin interne afin de s'assurer que toute migration n'est pas due à des effets de flux. La suspension cellulaire est désormais prête à être chargée dans le dispositif microfluidique pour l'expérience de chimiotaxie. Pour commencer l'expérience de chimiotaxie, retirez une partie du CB de l'embout d'entrée des cellules, puis rechargez avec la suspension cellulaire.Remplissez délicatement une seringue de 50 microlitres avec les cellules resuspendues. Procédez lentement, car les flagelles peuvent être cisaillés, ce qui réduirait la mobilité. Fixez la seringue de 50 microlitres au raccord d'entrée de l'aiguille comme indiqué précédemment, en expulsant une petite goutte du contenu de la seringue, en mettant la goutte en contact avec le liquide présent dans le raccord de l'aiguille, puis en fixant la seringue. Placez l'appareil sur la platine d'un microscope à fluorescence équipé d'une caméra haute vitesse pour l'acquisition d'images.Placer les deux seringues d'entrée dans la pompe à seringue et démarrer le flux de manière à former le gradient et à faire circuler les cellules à travers le tube. Une fois que les cellules sont entrées dans la chambre de chimiotaxie, attendre environ 20 minutes pour que le système se stabilise. Avant l'acquisition d'images, enregistrer des images de fluorescence vert vif et rouge mort à différents endroits le long de la longueur de la chambre.Typiquement, nous collectons 100 images à chaque emplacement à des intervalles de trois secondes. Les images de fluorescence acquises peuvent être analysées à l'aide de tout logiciel d'analyse d'images disponible commercialement, tel qu'Image J ou Metamorph, ou à l'aide de codes simples écrits en Matlab. Dans cet exemple, nous utiliserons des codes MATLAB.Commencez par supprimer les pixels de fond dans l'image à l'aide de ce seuil d'intensité des pixels, et retirez tous les pixels dont l'intensité est inférieure au seuil. Cela permet de minimiser le bruit. Lors de l'analyse, utilisez la position des cellules mortes pour déterminer le centre de l'image.Ceci représente la position où les cellules sont entrées dans la chambre de chimiotaxie et où elles seraient détectées en l'absence de toute migration. Ensuite, localisez les cellules vivantes sur l'image, divisez l'image en canaux et déterminez le nombre de cellules vivantes dans chaque canal. Dans nos travaux antérieurs, la chambre de chimiotaxie large de 10 à 50 micromètres a été divisée en 64 canaux, chacun mesurant environ 16 micromètres de large.Après avoir répété ces étapes pour toutes les images, certains des décomptes totaux de cellules pour chaque canal sur l'ensemble des images. Cela donne le nombre total de cellules détectées à chaque canal pendant toute la durée de l'expérience. Calculez les chimiotaxies, le coefficient de partage ou CPC, qui représente la direction de la migration.En effectuant les étapes suivantes, attribuez un facteur multiplicateur de plus un et de moins un à chaque cellule située respectivement du côté de haute concentration ou droit et du côté de basse concentration ou gauche des cellules mortes. Additionnez toutes les valeurs multipliées puis normalisez-les par rapport au nombre total de cellules détectées. Calculez le chimiotactisme, le coefficient de migration ou CMC, qui pondère la migration des cellules par la distance parcourue.Une cellule qui se déplace jusqu’au canal de position de concentration maximale 64 se voit attribuer un facteur de pondération de plus un, tandis qu’une cellule qui progresse à mi-chemin vers le côté de plus forte concentration reçoit un facteur de pondération de plus 0,5. Une cellule se déplaçant jusqu’à la position de concentration minimale la plus éloignée est pondérée par moins un. La somme de tous les comptages cellulaires pondérés est normalisée par rapport au nombre total de cellules afin de générer le CMC.Ce graphique montre un gradient de concentration linéaire ou un profil formé dans le dispositif microfluidique à l'aide de l'isothiocyanate de fluorescéine. La formation d'un gradient de concentration est illustrée sur cette figure à l'aide de colorants bleu et jaune. L'entrée des cellules était en position CA afin qu'aucun écoulement ne la traverse, et l'on observe qu'une gamme de couleurs entre le bleu et le jaune est formée.Voici des images en fausses couleurs provenant d'une expérience de chimiotaxie représentative dans laquelle des e coli RP 4 37 ont été exposés à un gradient allant de zéro à 100 micromolaire de L-aspartate ou de zéro à 225 micromolaire de sulfate de nickel dans le dispositif. La migration des bactéries vertes vivantes vers l'aspartate ou à l'opposé du nickel a été filmée toutes les 2,5 secondes pendant 30 minutes. Les bactéries mortes, montrées en rouge, ont servi de témoin pour les effets de flux dans le dispositif.La distribution spatiale du RP 4 37 dans le dispositif microfluidique en l'absence de gradient est indiquée sur ce graphique, comparée à sa réponse à un gradient d'aspartate et à un gradient de sulfate de nickel. Nous venons de vous montrer comment surveiller les chimiotaxies de la souche RP 4 37 d’E. coli dans un gradient de sulfate de nickel. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de minimiser le vortexage des cellules afin d'utiliser une sous-population hautement mobile.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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