Etudier Piscines vésicules synaptiques utilisant des colorants styryle photoconversion

Cette vidéo démontre la procédure de photoconversion du colorant Styro Dye FM 1-43. Pour étudier les pools de vésicules synaptiques chez Drosophila melanogaster, des larves de Drosophila sont d'abord disséquées afin d'exposer les muscles ventraux qui constituent la préparation de la jonction neuromusculaire ou JNM. Les préparations sont incubées dans un tampon contenant le FM D, représenté ici en gris, qui marque la membrane cellulaire.

Ils sont ensuite stimulés électriquement ou chimiquement pour induire la fusion physique de la vésicule dont la membrane est internalisée par la suite. L'exocytose stimulée sera marquée avec le colorant FM D. Le colorant FM extracellulaire est ensuite éliminé par lavage, ce qui le retire de la membrane plasmique, puis le tissu est fixé sous une illumination continue de haute intensité. Le colorant est complètement décoloré et la couleur noire apparaît en raison de la précipitation du diaminobenzidine.

Ce précipité peut ensuite être visualisé par microscopie électronique en transmission. Bonjour, je suis Philippe o Paso du laboratoire de Sylvia Olli à l'Institut européen des neurosciences de Gaon, en Allemagne. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de photoconversion FM des jonctions neuromusculaires.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le recyclage des vésicules synaptiques. Bon, commençons en travaillant sous un microscope stéréo. Commencez par piquer une larve de drosophile, côté dorsal vers le haut, dans une boîte revêtue de soie de verre.

Couvrez-le avec du sérum physiologique pour drosophile à l’aide d’une aiguille de seringue et utilisez des ciseaux de dissection pour sectionner le côté dorsal longitudinalement. Ensuite, retirez les organes internes. Puis, étirez la préparation et épinglez-la à nouveau dans la boîte de Pétri.

Plusieurs muscles ventraux peuvent ensuite être utilisés pour protéger les colorants FM utilisés dans cette procédure contre le photoblanchiment. Cette procédure doit être réalisée dans des conditions de faible luminosité. Recouvrez la préparation de drosophile pincée avec une solution saline pour drosophile contenant 90 millimolaire de chlorure de potassium et 10 micromolaire de FM 1-43 pour stimuler chimiquement les nerfs.

Incuber pendant une minute à température ambiante après la stimulation. Retirer la solution stimulante et plonger la préparation contenant la drosophile fixée dans un bécher rempli de 100 millilitres de solution saline pour drosophile, deux fois, afin d'éliminer le colorant extracellulaire FM 1 43, en travaillant sous une hotte de sécurité chimique.

Fixer le préparat de la jonction neuromusculaire dans du glutaraldéhyde 2,5 % dans du tampon salin phosphate ou PBS pendant 45 minutes à température ambiante. Rincer le préparat une fois avec du PBS, puis le retirer du plat en forme de cigare et l'immerger dans du chlorure d'ammonium 100 millimolaire pendant 15 minutes, afin de neutraliser les groupes aldéhydes libres du fixateur en excès.

À l’aide d’un tampon PBS normal, laver la solution de chlorure d’ammonium, placer la préparation de la jonction neuromusculaire dans une nouvelle boîte de Pétri et l’immerger dans du DAB (diamine benzidine) filtré à 1,5 milligramme par millilitre dans du PBS, puis incuber pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Positionner l’échantillon sous un microscope à fluorescence équipé d’une source lumineuse à lampe à mercure, dont le logement contient un miroir réflecteur, en utilisant un objectif sec à faible grossissement.

Localisez l'échantillon. Ensuite, à l'aide d'un cube de filtres standard à excitation bleue et fluorescence verte, mettez le signal fluorescent au point. Les jonctions neuromusculaires apparaissent sous forme de points brillants sur les muscles.

Ensuite, en utilisant le même jeu de filtres de fluorescence, éclairez l'échantillon à intensité maximale jusqu'à ce que le FM D soit complètement éliminé. En utilisant un objectif de 20 x, un temps de 30 à 45 minutes devrait suffire. Toutefois, la durée de la photoconversion varie selon l'intensité de l'éclairage, la pénétration de la DAB dans le prélèvement et l'objectif utilisé.

Après l'illumination, examiner l'échantillon en lumière transmise. Si la photoconversion a eu lieu, un précipité brun foncé devrait être visible. Revenir au microscope stéréoscopique, puis utiliser des ciseaux pour découper la zone photoconvertie de la larve.

Retournez au microscope de dissection. Ensuite, utilisez des ciseaux pour découper la zone photoconvertie des larves. Placez maintenant l'échantillon dans un tube microfuge contenant du PBS, en travaillant sous une hotte de sécurité chimique et en portant des équipements de protection appropriés, y compris des gants et une protection oculaire.

Préparez 300 microlitres de tétraoxyde d'osmium à 1 % par échantillon. Placez maintenant l'échantillon dans un flacon en verre avec un bouchon en plastique et ajoutez la solution de tétraoxyde d'osmium préparée pour postfixer la préparation. Pendant l'incubation de l'échantillon, préparez des solutions séparées contenant de l'éthanol à 30, 50, 70, 90, 95 et 100 %.

Lavez l'échantillon quatre à cinq fois avec du PBS pendant cinq minutes à chaque fois. Après chaque lavage, utilisez un embout en plastique sur votre pipette pour transférer l'échantillon dans un nouveau flacon. Après le dernier lavage, transférez l'échantillon dans un flacon en verre propre.

Ensuite, déshydratez l'échantillon en le plaçant dans une série de solutions d'éthanol. Commencez par une incubation dans un millilitre d'éthanol à 30 %. Puis, après cinq minutes, retirez l'éthanol à l'aide d'une pipette Pasteur et remplacez-le par un millilitre d'éthanol à 50 %.

Procédez à la déshydratation en incubant la préparation de la jonction neuromusculaire dans des solutions à 70 %, 90 %, puis 95 %. L'échantillon sera ensuite incubé dans une solution d'éthanol à 95 % plus de fois que dans de l'éthanol à 100 %, et ce trois fois après la déshydratation. Ajoutez deux millilitres de résine EIN à un mélange éthanol un-à-un et placez l'échantillon sur un rotateur pour l'incuber.

Deux à quatre heures à température ambiante après agitation à 100 %ein, puis placer l'échantillon dans un flacon ouvert afin de permettre l'évaporation de l'éthanol résiduel pendant quatre à six heures. Verser de l'EIN frais dans un moule. Ajouter les préparations et incuber à 60 degrés Celsius pendant 36 heures.

Lorsque les préparations intégrées de l'EIN sont prêtes, utilisez un ultramicrotome pour préparer des coupes minces de 50 à 80 nanomètres à l’aide d’un couteau en diamant. Les échantillons sont découpés en sections minces. Les sections flottent sur le bain d’eau du couteau et peuvent ensuite être récupérées sur des grilles standard pour ME.

Les préparations sont désormais prêtes à être observées à l'aide de procédures conventionnelles de microscopie électronique. Les jonctions neuromusculaires isolées de Drosophila melanogaster ont été stimulées à l'aide d'un milieu riche en potassium et les membranes internalisées ont été marquées à l'aide de FM 1-43, comme illustré ici.

La fluorescence d'un terminaison nerveuse peut être observée à l'aide d'un microscope à fluorescence épi conventionnel. Sous une illumination continue, le colorant est complètement décoloré et, lorsque l'illumination se poursuit, une couleur noire apparaît en raison de la précipitation du dino benzène. Cette terminaison nerveuse contient des vésicules synaptiques, mais aucune d'entre elles n'est photoconvertie.

Cela pourrait être dû à un éclairage insuffisant ou à une mauvaise pénétration du DIA amino benzine dans le tissu. En revanche, un excès d'éclairage entraîne un terminal globalement sombre où aucune vésicule ni organelle n'est discernable ; avec la quantité appropriée d'éclairage, la photoconversion peut être observée. Cette micrographie montre un bouton synaptique dans lequel un pool de vésicules sombres est visible, indiquant une photoconversion FM.

Nous venons de vous montrer comment photoconvertir des vésicules synaptiques marquées avec fem die. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de toujours bien calibrer avec soin les durées d'illumination pour l'étape de conversion. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé. Bonne chance avec vos expériences.