Etudier Piscines vésicules synaptiques utilisant des colorants styryle photoconversion

Cette vidéo montre la procédure de conversion de photos du Styro Dye FM 1 43. Pour étudier les bassins de vésicules synaptiques chez la drosophila melanogaster, les larves de drosophile sont d’abord disséquées pour exposer les muscles ventraux qui constituent la jonction neuromusculaire ou préparation NMJ. Les préparations sont incubées dans un tampon contenant la FM D illustrée ici en gris marquage de la membrane cellulaire.

Ils sont ensuite stimulés électriquement ou chimiquement pour induire une fusion physique de la membrane vésiculaire intériorisée par la suite. L’exocytose stimulée sera colorée avec FM D.Le colorant FM extracellulaire est ensuite lavé, en l’enlevant de la membrane plasmique, et le tissu est fixé sous un éclairage continu de haute intensité. Le colorant est complètement blanchi et la couleur noire apparaît en raison du di amino Ben et des précipitations.

Ce précipité peut ensuite être visualisé par transmission em. Bonjour, je m’appelle Philippe o Paso et je travaille dans le laboratoire de Sylvia Olli à l’Institut européen des neurosciences de Gaon, en Allemagne. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de conversion de photos FM dans la jonction neuromusculaire.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le recyclage vésical synaptique. D’accord, alors commençons à travailler sous un microscope de dissection. Commencez par épingler une larve de drosophile, côté dorsal vers le haut, dans un plat enduit de protection sociale.

Couvrez-le de solution saline de drosophile à l’aide d’une aiguille de seringue et trouvez des ciseaux de dissection qui sectionnent longitudinalement la face dorsale. Retirez ensuite les organes internes. Ensuite, étirez la préparation et à nouveau, épinglez-la sur le plat sigar.

Plusieurs muscles ventraux peuvent ensuite être utilisés pour protéger les colorants FM utilisés dans cette procédure contre le blanchiment. Cette procédure doit être effectuée dans des conditions de faible luminosité. Couvrez la préparation de drosophile pincée avec une solution saline de drosophile contenant 90 millimolaires de chlorure de potassium et 10 micromolaires FM.1 43 die pour stimuler chimiquement les nerfs.

Incuber pendant une minute à température ambiante après la stimulation. Retirez la solution stimulante et immergez le plat avec la drosophile épinglée. Préparation dans un bécher rempli de 100 millilitres de solution saline de drosophile deux fois pour retirer la matrice extracellulaire FM 1 43 travaillant sous une cagoule de sécurité chimique.

Fixez la préparation de la jonction neuromusculaire dans 2,5 % de glutaraldéhyde dans une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS pendant 45 minutes à température ambiante. Lavez une fois la préparation avec du PBS, puis retirez-la du plat à cigares et plongez-la dans 100 millimolaires de chlorure d’ammonium pendant 15 minutes. Pour éteindre les groupes aldéhydes libres du fixateur d’aldéhyde fessier restant.

À l’aide de PBS normal, lavez la solution de chlorure d’ammonium, placez la préparation de la jonction neuromusculaire dans un nouveau plat à cigare et immergez-la dans un filtre de 1,5 milligramme par millilitre. Diamine benzine ou DAB dans PBS et incuber pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Placez l’échantillon sous un microscope fluorescent équipé d’une source lumineuse à lampe à mercure avec un boîtier de lampe contenant un miroir arrière à l’aide d’un objectif sec à faible grossissement.

Trouvez l’échantillon. Ensuite, à l’aide d’un cube de filtre de fluorescence vert d’excitation bleue normal, mettez le signal fluorescent au point. Les jonctions neuromusculaires apparaissent comme des points lumineux sur les muscles.

Ensuite, à l’aide du même ensemble de filtres de fluorescence, éclairez l’échantillon à l’intensité maximale jusqu’à ce que le FM D soit complètement blanchi. Avec un objectif 20x, 30 à 45 minutes devraient suffire. Cependant, le temps de conversion des photos varie en fonction de l’intensité de l’éclairage, de l’intensité de la pénétration du DAB dans la préparation et de l’objectif utilisé.

Après l’éclairage, examinez l’échantillon sous la lumière de transmission. Si la conversion photo a eu lieu, un précipité brun foncé doit être visible. Retournez à la lunette de dissection, puis utilisez des ciseaux pour couper la tache photoconvertie de la larve.

Revenez à l’étendue de la dissection. Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper la tache convertie en photo des larves. Placez maintenant l’échantillon dans un tube micro-fuge contenant du PBS en travaillant sous une cagoule de sécurité chimique et en portant un équipement de sécurité approprié, y compris des gants et des lunettes de protection.

Préparez 300 microlitres de tétroxyde d’osmium à 1 % par échantillon. Placez maintenant l’échantillon dans une fiole en verre recouverte de plastique et ajoutez la solution préparée de tétroxyde d’osmium pour postfixer la préparation. Pendant l’incubation de l’échantillon, préparez des solutions séparées contenant 30, 50, 70, 90, 95 et 100 % d’éthanol.

Lavez l’échantillon quatre à cinq fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune. Après chaque lavage, utilisez un PE en plastique sur votre pipette pour transférer l’échantillon dans un nouveau flacon. Après le dernier lavage, transférez l’échantillon dans une fiole en verre propre.

Ensuite, déshydratez l’échantillon en le plaçant dans la série de solutions d’éthanol. Commencez par incuber dans un millilitre d’éthanol à 30 %. Ensuite, après cinq minutes, retirez l’éthanol à l’aide d’une pipette de pâturage et remplacez-le par un millilitre d’éthanol à 50 %.

Poursuivez la déshydratation en incubant la préparation de la jonction neuromusculaire dans les solutions à 70, 90 puis à 95 %. L’échantillon sera ensuite incubé dans une solution d’éthanol à 95 % plus de fois que dans de l’éthanol à 100 % trois fois après la déshydratation. Ajoutez deux millilitres de résine EIN à l’éthanol et placez l’échantillon sur un rotateur incubé.

Deux à quatre heures à température ambiante après une rotation à 100 % et placez l’échantillon dans un ballon ouvert pour permettre à l’éthanol restant de s’évaporer pendant quatre à six heures. Versez l’EIN frais dans un moule. Ajouter les préparations et incuber à 60 degrés Celsius pendant 36 heures.

Lorsque les préparations intégrées à l’EIN sont prêtes, utilisez un ultra-microtome pour préparer des sections minces de 50 à 80 nanomètres I à l’aide d’un couteau à diamant. Les échantillons sont découpés en lames minces. Les sections s’écoulent sur le bain-marie du couteau et peuvent ensuite être ramassées sur des grilles EM normales.

Les préparations sont maintenant prêtes à être prises en images à l’aide des procédures EM conventionnelles. Des jonctions neuromusculaires isolées de Drosophila Melangaster ont été stimulées à l’aide de membranes riches en potassium et internalisées. Ont été colorés à l’aide de FM 1 43 comme indiqué ici.

La fluorescence d’une terminaison nerveuse peut être observée à l’aide d’un microscope à épifluorescence conventionnel. Sous un éclairage continu, le colorant est complètement blanchi et lorsque l’éclairage continue, une couleur noire apparaît en raison de la précipitation de benzine de dino. Cette terminaison nerveuse contient des vésicules synaptiques, mais aucune d’entre elles n’est photoconvertie.

Cela peut être causé par un éclairage insuffisant ou une mauvaise pénétration de l’aminobenzine DIA dans les tissus. En revanche, trop d’éclairage entraîne une obscurité globale terminale où aucune vésicule ou organite n’est distinguable avec la quantité appropriée de conversion de photo d’éclairage. Cette micrographie montre un bhuton synaptique dans lequel on voit un bassin de vésicules sombres indiquant la conversion de photos FM.

Nous venons de vous montrer comment convertir en photo des vésicules synaptiques étiquetées avec fem die. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de toujours calibrer soigneusement les temps d’éclairage pour l’étape de conversion. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé. Bonne chance dans vos expériences.