Name: Implantation de Ferumoxides Étiqueté cellules souches mésenchymateuses humaines dans les lésions du cartilage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: Découvrez une méthode reproductible pour implanter des cellules souches mésenchymateuses humaines étiquetées au Ferumoxides dans les lésions cartilagineuses. Cette technique permet le suivi par IRM 7T des implants cellulaires.

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Ce travail a été soutenu par une subvention de l&#39;Institut national de l&#39;arthrite et les maladies cutanées musculo-squelettiques, le NIH RO1AR054458.

1. Étiquetage des hMSCs avec Endorem <ol><li> Les cellules sont cultivées à 80% de confluence d'au moins 18 heures avant l'étiquetage. </li><li> Pendant ce temps, les médias étiquetage est préparé en ajoutant à l'échantillon Endorem à une dose de 100 ug Fe / ml du milieu sans sérum. </li><li> Après les cellules sont cultivées jusqu'à confluence, la culture médiatique est aspirée et les cellules ne sont lavées avec du PBS 1x ou un milieu sans sérum. </li><li> Ensuite, la solution de rinçage est aspiré et les médias d'étiquetage préalablement préparé est ajouté. Les cellules sont ensuite incubées à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 4 heures. </li><li> Après 4 heures d'incubation, l'étiquetage des médias est aspiré et les cellules sont rincées avec du PBS et la trypsine, comme d'habitude. </li><li> Une fois trypsinées, les cellules sont lavées 3x avec PBS et centrifugés à 400rcf pendant 5 minutes. </li><li> Après cette étape de lavage, les cellules sont remises en suspension, compté, évalué pour la viabilité, et utilisés au besoin pour l'expérimentation. </li></ol> 2. Préparation d'agarose <ol><li> Après que les cellules ont été marqués, il est temps pour préparer la solution d'agarose. </li><li> Sur une échelle plus fine, de 80 mg d'agarose en poudre sont pesés et ajoutés à 2 ml de PBS. </li><li> Cette solution est ensuite agitée doucement et autoclavés. </li><li> Après environ 40 min, la solution fluide agarose peuvent être retirés de l'autoclave. Le volume devrait être mesurée et ajustée en conséquence avec préchauffé PBS. </li><li> Puis la solution est refroidie à 42 ° C </li></ol> 3. Créer MASI <ol><li> Lorsque la solution d'agarose a atteint la température désirée, les cellules sont comptées et centrifugé pour la dernière fois dans un tube Eppendorf de 1.5 ml. </li><li> Après centrifugation, le surnageant est éliminé et les cellules sont mélangées avec le DMEM pour atteindre une concentration de 30 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Maintenant, les cellules sont mélangées avec de l'agarose 42 ° C au chaud. </li><li> Une pointe de la pipette froid peut entraîner agarose à solidifier l'intérieur de la pointe, il est donc conseillé de préchauffer le bout par pipetage chaude PBS stérile haut et en bas </li><li> Maintenant, le même volume d'agarose comme support est repris et soigneusement mélangé avec la cellule-media-suspension ainsi que d'une suspension homogène est créé. </li><li> Garder le tube Eppendorf dans un bain d'eau préchauffée, tout en mélangeant afin que l'agarose ne refroidit pas assez pour se solidifier. </li><li> Lorsque la suspension est homogène, les cellules sont implantées dans le vice. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1793/1793fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Coronale pondérée en T2 images SE (TR 4000 ms / TE 18,27 ms) d'un spécimen de la rotule avec hMSCs implanté dans les lésions du cartilage.

<ol><li>Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+and+functional+maturation+of+bovine+mesenchymal+stem+cells+in+long-term+agarose+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).</li>
<li>Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li>
<li>Rahfoth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+allograft+chondrocytes+embedded+in+agarose+gel+into+cartilage+defects+of+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits.</a> Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).</li>
<li>Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+hESCs+and+hMSCs+with+iron+oxide+nanoparticles+for+non-invasive+in+vivo+tracking+with+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

Le protocole décrit fournit une manière reproductible à l&#39;étiquette MSC avec des nanoparticules d&#39;oxyde de fer et implanter ces étiquetés MSC dans des défauts du cartilage. Cette technique permet non invasive représentation de greffes de cellules souches à des défauts du cartilage en IRM, ce qui permet une détection précoce de l&#39;échec MASI. Une luxation ou d&#39;efflux des cellules marquées peuvent être diagnostiqués à partir d&#39;une disparition de l&#39;étiquette à partir du site de transplantation sur de...

<table><tbody><tr><td>D-MEM à forte concentration de glucose</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sans Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,05 %</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>25399-120</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin fœtal (FBS)</td><td></td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td></td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ferumoxides (Endorem)</td><td></td><td>Guerbet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose de type VII</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9045</td><td>Diluer l'agarose dans du PBS pour une concentration finale de 4 %</td></tr></tbody></table>

implantation de ferumoxides Étiqueté cellules souches mésenchymateuses humaines dans les lésions du cartilage

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

Le domaine du génie tissulaire intègre les principes de l&#39;ingénierie, la biologie cellulaire et en médecine vers la régénération des cellules spécifiques et des tissus fonctionnels. Matrice des implants de cellules souches associées (MASI) visent à régénérer les défauts du cartilage due à l&#39;arthrite ou de lésions traumatiques commune. Adulte cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont la capacité de se différencier en cellules de la lignée chondrocytaire et ont montré des résultats prometteurs pour les technologies basées sur les cellules articulaires réparation du cartilage. Autologue MSC peut être isolé d&#39;une variété de tissus, peut être étendu dans les cultures cellulaires sans perdre leur potentiel de différenciation, et ont démontré la différenciation chondrocytaire in vitro et in vivo 1, 2. Afin d&#39;assurer la rétention locale et la viabilité des cellules souches mésenchymateuses transplantées dans les lésions du cartilage, un échafaudage est nécessaire, qui prend également en charge de différenciation et la prolifération subséquente. L&#39;architecture de la formation des guides et des tissus échafaudage permet la matrice extracellulaire, produite par les cellules souches, à se développer. Des recherches antérieures ont montré que 2% d&#39;agarose échafaudage peut soutenir le développement du cartilage hyalin stable et ne pas induire des réponses immunitaires 3. Conservation à long terme des cellules souches transplantées dans le MASI est essentiel pour la régénération du cartilage. Étiquetage des CSM avec des nanoparticules d&#39;oxyde de fer permet à long terme dans le suivi in vivo avec des techniques non invasives d&#39;imagerie IRM 4. Cette présentation fera la démonstration des techniques de MSC étiquetage avec des nanoparticules d&#39;oxyde de fer, la génération de cellules-agarose des constructions et l&#39;implantation de ces constructions dans des défauts du cartilage. Les constructions étiquetées peuvent être suivis de façon non invasive avec MR-imagerie.

Objectif de la présentation est de montrer une méthode hautement reproductible pour générer la matrice associée implants de cellules souches dans les lésions du cartilage, qui peuvent être visualisées avec l&#39;IRM. Les cellules souches sont étiquetés avec approuvée par la FDA Ferumoxides, mélangés avec l&#39;agarose, implantés dans les lésions du cartilage et imagé avec un scanner IRM 7T.

Implantation de Ferumoxides Étiqueté cellules souches mésenchymateuses humaines dans les lésions du cartilage

Le domaine de l'ingénierie tissulaire intègre les principes de l'ingénierie, de la biologie cellulaire et de la médecine afin de parvenir à la régénération de cellules spécifiques et...

L'objectif de cette présentation est de démontrer une méthode simple et reproductible de production de MASI à l'aide d'oxydes para marqués par des HME pour le suivi de thérapies basées sur les cellules souches. Pour le marquage par imagerie par résonance magnétique, le milieu est préparé, ajouté dans un flacon T75 et incubé pendant quatre heures. Les cellules sont ensuite trypsinisées et lavées.Trois fois après le lavage, les cellules sont remises en suspension et du gel d'agarose est ajouté dans le tube. Les cellules sont maintenant prêtes à être implantées dans les défauts du cartilage. Bonjour, je suis Alex.J'ai besoin de reprendre à partir du laboratoire de High Delta Blink, le Laboratoire des Milieux de Contraste du Département de Radiologie de l'Université de Californie à San Francisco. Je suis Lydia Men. Également du Laboratoire des Milieux de Contraste.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant de marquer des cellules souches hématopoïétiques médicinales avec des nanoparticules d'oxyde de fer afin de générer des agrégats cellulaires, puis d'implanter ces agrégats dans des défauts du cartilage. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour suivre non-invasivement les cellules souches mésenchymateuses par imagerie par résonance magnétique. Commençons donc.Pour commencer, les cellules sont cultivées jusqu'à une confluence de 80 %, au moins 18 heures avant l'étiquetage. Pendant cette période, préparez le milieu d'étiquetage afin qu'il soit prêt à l'emploi lorsque les cellules atteindront la confluence. Pour ce faire, ajoutez de l'end durum à l'échantillon à une dose de 100 microgrammes de fer par millilitre de milieu sans sérum.Une fois les cellules arrivées à confluence, aspirez le milieu de culture et lavez les cellules avec du PBS ou un milieu sans sérum. Ensuite, aspirez la solution de rinçage et ajoutez le milieu de marquage préparé. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre heures.Après une incubation de quatre heures, aspirez le milieu de marquage. Rincez les cellules avec du PBS, puis avec du trypsine glacée. Une fois dissociées, lavez les cellules trois fois avec du PBS et centrifugez-les à 400 RCF pendant cinq minutes.Après cette étape de lavage, resuspendez les cellules, comptez-les, évaluez leur viabilité, puis utilisez-les selon les besoins pour l'expérimentation. Voyons maintenant comment créer des implants de cellules souches associés à la matrice. Commencez par préparer une solution d'agar fraîche.Une fois que l'agros a refroidi à 42 degrés Celsius, comptez les cellules et centrifugez-les dans un tube einor de 1,5 millilitre. Après la centrifugation, éliminez le surnageant et mélangez les cellules avec le milieu modifié d’Eagle de dobe echo afin d’obtenir une concentration de 30 fois 10 puissance 6 cellules par millilitre. Avant de mélanger les cellules avec l’agros chaud, préchauffez l’embout de pipette en aspirant et en expulsant plusieurs fois du PBS stérile et chaud. Cela empêchera l’agros de se solidifier à l’intérieur de l’embout.Ensuite, prélevez le même volume d'aros que celui du milieu et mélangez-le soigneusement à la suspension cellulaire en veillant à ne créer aucune bulle. Maintenez le tube einor à l'intérieur d'un bain-marie préchauffé pendant le mélange afin que l'agros ne refroidisse pas suffisamment pour se solidifier lorsque la suspension est homogène. Les cellules sont implantées dans le défaut et sont désormais prêtes pour l'imagerie par RM.Nous allons maintenant vous présenter quelques résultats représentatifs, d'abord de notre technique de marquage, puis de notre technique d'implantation. Après le marquage, les cellules dans les flacons conservent la même apparence que les cellules non marquées. Comme prévu, la viabilité des cellules marquées est inchangée, comme le montre le test de la caspase trois.La combinaison de cellules marquées avec des agrégats conduit à une perte de signal dans les implants, comme observé sur les images IRM pondérées en T2 ; les cellules non marquées ne présentent aucun signal. Les sections présentant une diminution de la densité cellulaire dans les constructions d'agrégats se colorent en bleu de Prusse. Confirmez l'accumulation intracellulaire de fer.Nous venons de vous montrer comment marquer des cellules souches mésenchymateuses avec la nanoparticule d'oxyde de fer end interim. Comment créer des constructions d'agros avec les cellules marquées et comment les implanter dans des défauts du cartilage. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de vous souvenir de préchauffer votre embout de pipette avant d'ajouter du aros chaud à la suspension cellulaire.Il est également essentiel que M. Imaging évite la formation de bulles. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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L&#39;utilisation de cellules souches humaines périvasculaires pour la régénération osseuse

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Traitement des défauts ostéochondraux à genou la commune du lapin par implantation de cellules allogéniques souches mésenchymateuses dans caillots de fibrine

Culture de cellules humaines mésenchymateuses stromales (CSMh) avec du sérum autologue, réduit les risques de rejet par un matériau xénogénique et d'autres effets négatifs. Elle permet aussi la récupération d'un sous-ensemble de progéniteurs mésodermiques, qui peut délivrer CSMh frais. Incorporation CSMh dans un caillot de fibrine autologue permet une manipulation facile et l'implantation chirurgicale efficace.

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Découvrez une méthode reproductible pour implanter des cellules souches mésenchymateuses humaines étiquetées au Ferumoxides dans les lésions cartilagineuses. Cette technique permet le suivi par IRM 7T des implants cellulaires.

Implantation de Ferumoxides Étiqueté cellules souches mésenchymateuses humaines dans les lésions du cartilage

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