Name: Le sperme de récolte et linsémination artificielle des souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Apprenez l'insémination artificielle chez la souris en extrayant le sperme des mâles pour féconder les femelles ovulantes. Cette méthode permet un contrôle précis du timing dans les études de développement et la recherche transgénique.

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Je tiens à remercier Mike Dewey partir du Centre de stock génétique Peromyscus pour ses précieux renseignements, la patience et de connaissances sur la reproduction chez les rongeurs.

Insémination Artificielle L&#39;insémination artificielle est utilisée à la place d&#39;accouplements naturels pour augmenter les chances que toutes les femelles ont deviennent enceintes. 2 mâles a été utilisé pour chaque 1 femelles superovulées ou une femelle connue pour être en oestrus. Les épididymes caudae de souris mâles matures ont été placés dans une suspension de lait de 9% et tranchées ouvertes avec 18 aiguilles de calibre. Le sperme a été autorisée à nager librement pendant quelques minutes puis les épididymes ont été prises à partir du mélange. La suspension a été évaluée avec un microscope pour confluence et les spermatozoïdes mobiles. Un émoussée de calibre 22 de 1 ½ pouce de long aiguille a été utilisée pour administrer le sperme. Un virage à 120 ° a été placé environ 3 / 4 ème de la descente de l&#39;aiguille. L&#39;aiguille a été insérée dans le vagin jusqu&#39;à la courbure et 0,025 - 0.05mls injecté. Si un assistant est utilisé pour maintenir les femmes dans la position appropriée, l&#39;utilisation d&#39;anesthésiques n&#39;est pas nécessaire. Préparation <ol><li> Utilisez 4 mâles pour 6 femelles </li><li> Euthanasier les mâles à le vivarium </li><li> Préparer environ 5 ml de lait de 9% par du lait en poudre </li><li> Mettez 1,5 ml en boîte de Petri petits </li><li> Découpez l&#39;épididyme et le canal déférent </li><li> Mettre en 1.5ml de lait 9% </li><li> L&#39;utilisation de deux aiguilles de calibre 18, et en utilisant de longues mouvement de coupe avec des aiguilles, tranche ouverte l&#39;épididyme et le canal déférent de libérer le sperme </li><li> Prenez à gauche en sortant sur un tissu et vérifier les spermatozoïdes sous le microscope </li></ol> Injection <ol><li> Utilisez une aiguille émoussée à 120 ° d&#39;angle </li><li> Maintenez la souris dans la main et injecter le mélange. Si à l&#39;aise avec une personne qui détient et l&#39;injection, deux personnes peuvent être utilisées. Pas d&#39;anesthésie devrait être utilisée, comme le sait comment cela pourrait influer sur la procédure. </li><li> Utiliser 0,05 ml de sperme / mélanger le lait par femelle </li></ol> Femelles receveuses <ol><li> Ne le frottis vaginal des femelles receveuses (à cette époque l&#39;femelles receveuses doivent être en proestrus / œstrus) </li><li> Les femelles qui n&#39;ont pas atteint l&#39;oestrus par Jour 5 ne devrait probablement pas utilisés </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Outil</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-30</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 18 G</td><td>Outil</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Lait en poudre</td><td>Réactif</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>Outil</td><td>National Scientific Company</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>Pinces</td><td>Outil</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5060</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Outil</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco&amp;rsquo;s</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille émoussée 22 G</td><td>Outil</td><td>Give to me</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

le sperme de récolte et l&#39;insémination artificielle des souris

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Les rongeurs de l&#39;Peromyscus genre (souris sylvestre) sont les plus répandus natif mammifères nord-américain. Peromyscus espèces sont utilisées dans un large éventail de recherche, y compris la toxicologie, l&#39;épidémiologie, l&#39;écologie, du comportement, et les études génétiques. Ici, ils fournissent un modèle utile pour les démonstrations de l&#39;insémination artificielle. Des méthodes similaires à celles affichées ici ont déjà été utilisées dans plusieurs études de souris sylvestres, mais aucun protocole détaillé a été publié. Ici nous démontrons la méthode de base de l&#39;insémination artificielle. Cette méthode consiste à extraire les testicules du rongeur, puis à isoler les spermatozoïdes de l&#39;épididyme et le canal déférent. Les spermatozoïdes matures, maintenant dans un mélange de lait, sont placés dans l&#39;appareil génital de la femelle au moment de l&#39;ovulation. La fertilisation est compté comme 0 jours pour la synchronisation du développement embryonnaire. Les embryons peuvent alors être récupérées au moment du point désiré et manipulés. L&#39;insémination artificielle peut être utilisé dans une variété d&#39;espèces de rongeurs, où le calendrier exact est cruciale embryon ou difficiles à obtenir. Cette technique est vitale pour les espèces ou souches (y compris les plus Peromyscus) qui ne peut s&#39;accouplent immédiatement et / ou lorsque l&#39;accouplement est difficile à évaluer. En outre, l&#39;insémination artificielle permet timing exact pour le développement de l&#39;embryon, soit dans la cartographie des progrès de développement et / ou travaux transgéniques. Réduction du nombre d&#39;animaux peut être utilisé depuis la fécondation est garanti. Cette méthode a été essentielle à la poursuite du système Peromyscus, et nous espérons bénéficier d&#39;autres aussi.

Ce protocole illustre des méthodes pour extraire le sperme des testicules des mâles et ensuite inséminer les souris femelles. Cette procédure est utile lorsque l&#39;heure précise est nécessaire dans les études de développement ainsi que les travaux transgéniques.

Le sperme de récolte et l&#39;insémination artificielle des souris

Les rongeurs du genre Peromyscus (souris sylvestres) sont les mammifères indigènes les plus répandus en Amérique du Nord. Les espèces de Peromyscus sont utilisées dans un large éventail de recherches...

Je m'appelle Amanda Dli du laboratoire du Dr Paul Verana à l'Université de Californie à Irvine. Aujourd'hui, je vais démontrer la procédure d'insémination artificielle. Cela consiste à extraire le sperme du mâle, puis à introduire ce sperme dans une femelle en cours d'ovulation.La raison pour laquelle vous souhaiteriez faire cela est que le mâle et la femelle peuvent ne pas s'accoupler au moment où vous en avez besoin, ou ils peuvent ne pas s'accoupler du tout. Là encore, cela peut également être utilisé avec du sperme congelé si une lignée de souris est très importante. Cette procédure est très importante à voir démontrée, car de nombreux manuels et revues ne montrent pas la méthode appropriée pour manipuler la souris.La souris peut être manipulée et injectée par une seule personne sans utiliser d'anesthésique sur la femelle. Cela implique que la femelle n'est en aucune façon blessée et garantit que la fécondation puisse suivre le meilleur chemin possible. Les instruments de dissection que nous utiliserons sont deux paires de pinces fines et une paire de ciseaux pointus.Ceux-ci seront utilisés pour isoler les meilleurs spermatozoïdes provenant des testicules et du tissu adipeux. Une fois cette étape terminée, nous utiliserons la pince pour isoler l'épididyme. Du lait à 9 % est utilisé pour transférer les spermatozoïdes dans l'organisme femelle.Il est composé d'un XPBS provenant de lait en poudre acheté dans un magasin d'alimentation local. Celui-ci est placé dans une petite boîte de Pétri de manière isolée afin que les spermatozoïdes se trouvent dans une zone localisée. Des aiguilles de calibre 18 sont utilisées pour inciser l'épididyme afin que les spermatozoïdes puissent sortir et nager dans la solution de lait à 9 % contenue dans la boîte de Pétri.On prélève les spermatozoïdes obtenus et les concentrations observées dans une solution de lait à 9 % à l’aide d’une aiguille de calibre 22, à extrémité émoussée et formant un angle de 120 degrés. Celle-ci est fixée à une seringue d’un millilitre, puis 0,025 millilitre est injecté chez la femelle de souris arachide, ou rongeur Polyus rodentis. En réalité, les Para cus constituent les mammifères endogènes d’Amérique du Nord les plus abondants ; l’espèce Polyus est présente dans la région sud-est de la Floride aux États-Unis.Comme vous pouvez le constater, ses yeux sont un peu plus grands que chez Mus musculus. De plus, son pelage est plus clair, ce qui lui permet également de se fondre dans les dunes de sable de la région de Floride.Je vais isoler la région entière du testicule de cette souris. Elle a un an ici, car on sait qu’elles peuvent se reproduire en captivité jusqu’à l’âge de quatre ans. Et la durée de vie en captivité est en réalité inconnue, car elles ont vécu jusqu’à sept ans.La première chose que je vais faire est d'imbiber la région inférieure de ce mâle avec de l'éthanol à 70 %. Cela garantit que les poils ne gênent pas. Comme vous pouvez le voir, les renflements ici sont les testicules.Je vais pratiquer une incision à travers la couche externe de la peau, faire une petite incision sur la paroi interne, puis effectuer de larges coupes horizontales. En fait, je trouve plus facile à ce stade de simplement extraire les testicules, car le bourrelet adipeux est très volumineux et facile à visualiser. Une fois les testicules sortis, vous devez effectuer deux coupes : une près du bourrelet adipeux afin de l'isoler, puis une autre en dessous de l'épididyme, qui le relie à la paroi du côté opposé ; veillez à couper suffisamment bas pour ne pas endommager l'épididyme.Les testicules sont composés de cette grande structure en forme de repli ici. En outre, l'épididyme se trouve ici, longeant les testicules jusqu'à ce point situé ici. L'épididyme ressemble également à un enroulement de spaghettis à la base, tandis que la couche de tissu adipeux se situe au sommet.La première chose que je fais est de découper l'épiderme pour le séparer du testicule. Une fois cela fait, un léger tirage est effectué pour séparer la couche adipeuse de l'épiderme. Une fois cette étape terminée, je retourne les testicules et tente d'isoler autant que possible l'épididyme de la couche adipeuse.Une fois ceci effectué, il est très facile de déchirer légèrement l'épididyme pour le séparer des testicules. Ce faisant, on isole l'ensemble de l'épididyme de ces testicules. L'épididyme s'est en réalité rompu le long du côté des testicules.Il y a donc deux sections différentes à isoler ici. Une en bas, qui est encore connectée, et une autre partie en haut, que je vais de nouveau retourner afin de l’isoler dans ma main gauche, ce qui me permettra de découper avec ma main droite et d’enlever immédiatement la graisse. Vous avez ainsi les deux parties distinctes des EPIs.Je vais prendre les EPI et ensuite les placer dans le lait à 9 % où je récolterai ce sperme. Pour l'instant, je m'organise par isolement, afin de pouvoir les traiter individuellement. Fondamentalement, vous voulez éliminer la majeure partie du tissu adipeux, et voici le point essentiel.Vous devez effectuer des mouvements longs afin que les spermatozoïdes puissent nager jusqu'au mélange de lait. Ce mélange est principalement composé de matières grasses. Celui-ci est bien long, détruisant presque entièrement le tissu.J'essaie de faire suffisamment d'incisions ici pour accéder à toutes les différentes poches où les spermatozoïdes seront stockés. L'autre chose à éviter est de découper des morceaux trop petits, car lorsque vous tenterez de prélever les spermatozoïdes par la suite, je pense qu'ils obstrueront l'aiguille de calibre 22. Je vais les laisser reposer pendant une minute afin de m'assurer que tous les spermatozoïdes ont quitté l'épididyme.Les lignes sinueuses en mouvement que vous observez, provoquant le déplacement du liquide, sont les spermatozoïdes eux-mêmes. Les taches correspondent aux granules de dépôt de lait, ce qui explique pourquoi l'image est légèrement plus sombre, car elle se trouve dans une suspension de lait. Comme vous pouvez le voir, les spermatozoïdes sont encore actifs, leurs queues étant en mouvement.La prochaine étape consiste à aspirer la solution de sperme à 9 % dans la seringue. Vous devez l'incliner sur le côté, car il n'y a pas beaucoup de liquide au départ. Il suffit de l'aspirer.Si vous obtenez un caillot, il est très facile à enlever. Utilisez simplement une lampe chimique pour essuyer l'extrémité de votre embout. Une fois que vous avez aspiré une partie de la solution, selon le nombre de souris que vous avez, vous devez éliminer autant que possible l'air présent dans la seringue.Cela se fait simplement en tapotant la seringue pour faire remonter la bulle d'air vers le haut. Ces femelles ne sont pas anesthésiées de quelque manière que ce soit, et vous pouvez ainsi constater qu'il est possible de procéder à l'injection sans utiliser d'anesthésique. Vous devez injecter la pointe du dispositif de manière verticale.Le vagin a en réalité une forme en J, donc si vous injectez et reculez ensuite la seringue, vous devez injecter au maximum 0,05, ce que j'ai fait. Comme vous pouvez le voir, c'est largement suffisant car cela ressort. Je viens de vous montrer comment inséminer artificiellement une femelle.Ce que nous avons fait, c'est isoler des spermatozoïdes du polyon de Paramécie mâle et les injecter dans une femelle en cours d'ovulation. Une fois cette étape réalisée, la fécondation devrait avoir lieu chez la femelle OV au moment de l'insémination artificielle ou peu après. Douze heures après, un embryon de cellule T devrait s'être développé.

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Apprenez l'insémination artificielle chez la souris en extrayant le sperme des mâles pour féconder les femelles ovulantes. Cette méthode permet un contrôle précis du timing dans les études de développement et la recherche transgénique.

Le sperme de récolte et l'insémination artificielle des souris

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