Name: Le sperme de récolte et linsémination artificielle des souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Apprenez l'insémination artificielle chez la souris en extrayant le sperme des mâles pour féconder les femelles ovulantes. Cette méthode permet un contrôle précis du timing dans les études de développement et la recherche transgénique.

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Je tiens à remercier Mike Dewey partir du Centre de stock génétique Peromyscus pour ses précieux renseignements, la patience et de connaissances sur la reproduction chez les rongeurs.

Insémination Artificielle L&#39;insémination artificielle est utilisée à la place d&#39;accouplements naturels pour augmenter les chances que toutes les femelles ont deviennent enceintes. 2 mâles a été utilisé pour chaque 1 femelles superovulées ou une femelle connue pour être en oestrus. Les épididymes caudae de souris mâles matures ont été placés dans une suspension de lait de 9% et tranchées ouvertes avec 18 aiguilles de calibre. Le sperme a été autorisée à nager librement pendant quelques minutes puis les épididymes ont été prises à partir du mélange. La suspension a été évaluée avec un microscope pour confluence et les spermatozoïdes mobiles. Un émoussée de calibre 22 de 1 ½ pouce de long aiguille a été utilisée pour administrer le sperme. Un virage à 120 ° a été placé environ 3 / 4 ème de la descente de l&#39;aiguille. L&#39;aiguille a été insérée dans le vagin jusqu&#39;à la courbure et 0,025 - 0.05mls injecté. Si un assistant est utilisé pour maintenir les femmes dans la position appropriée, l&#39;utilisation d&#39;anesthésiques n&#39;est pas nécessaire. Préparation <ol><li> Utilisez 4 mâles pour 6 femelles </li><li> Euthanasier les mâles à le vivarium </li><li> Préparer environ 5 ml de lait de 9% par du lait en poudre </li><li> Mettez 1,5 ml en boîte de Petri petits </li><li> Découpez l&#39;épididyme et le canal déférent </li><li> Mettre en 1.5ml de lait 9% </li><li> L&#39;utilisation de deux aiguilles de calibre 18, et en utilisant de longues mouvement de coupe avec des aiguilles, tranche ouverte l&#39;épididyme et le canal déférent de libérer le sperme </li><li> Prenez à gauche en sortant sur un tissu et vérifier les spermatozoïdes sous le microscope </li></ol> Injection <ol><li> Utilisez une aiguille émoussée à 120 ° d&#39;angle </li><li> Maintenez la souris dans la main et injecter le mélange. Si à l&#39;aise avec une personne qui détient et l&#39;injection, deux personnes peuvent être utilisées. Pas d&#39;anesthésie devrait être utilisée, comme le sait comment cela pourrait influer sur la procédure. </li><li> Utiliser 0,05 ml de sperme / mélanger le lait par femelle </li></ol> Femelles receveuses <ol><li> Ne le frottis vaginal des femelles receveuses (à cette époque l&#39;femelles receveuses doivent être en proestrus / œstrus) </li><li> Les femelles qui n&#39;ont pas atteint l&#39;oestrus par Jour 5 ne devrait probablement pas utilisés </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Outil</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-30</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 18 G</td><td>Outil</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Lait en poudre</td><td>Réactif</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>Outil</td><td>National Scientific Company</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>Pinces</td><td>Outil</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5060</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Outil</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco&amp;rsquo;s</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille émoussée 22 G</td><td>Outil</td><td>Give to me</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

le sperme de récolte et l&#39;insémination artificielle des souris

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Les rongeurs de l&#39;Peromyscus genre (souris sylvestre) sont les plus répandus natif mammifères nord-américain. Peromyscus espèces sont utilisées dans un large éventail de recherche, y compris la toxicologie, l&#39;épidémiologie, l&#39;écologie, du comportement, et les études génétiques. Ici, ils fournissent un modèle utile pour les démonstrations de l&#39;insémination artificielle. Des méthodes similaires à celles affichées ici ont déjà été utilisées dans plusieurs études de souris sylvestres, mais aucun protocole détaillé a été publié. Ici nous démontrons la méthode de base de l&#39;insémination artificielle. Cette méthode consiste à extraire les testicules du rongeur, puis à isoler les spermatozoïdes de l&#39;épididyme et le canal déférent. Les spermatozoïdes matures, maintenant dans un mélange de lait, sont placés dans l&#39;appareil génital de la femelle au moment de l&#39;ovulation. La fertilisation est compté comme 0 jours pour la synchronisation du développement embryonnaire. Les embryons peuvent alors être récupérées au moment du point désiré et manipulés. L&#39;insémination artificielle peut être utilisé dans une variété d&#39;espèces de rongeurs, où le calendrier exact est cruciale embryon ou difficiles à obtenir. Cette technique est vitale pour les espèces ou souches (y compris les plus Peromyscus) qui ne peut s&#39;accouplent immédiatement et / ou lorsque l&#39;accouplement est difficile à évaluer. En outre, l&#39;insémination artificielle permet timing exact pour le développement de l&#39;embryon, soit dans la cartographie des progrès de développement et / ou travaux transgéniques. Réduction du nombre d&#39;animaux peut être utilisé depuis la fécondation est garanti. Cette méthode a été essentielle à la poursuite du système Peromyscus, et nous espérons bénéficier d&#39;autres aussi.

Ce protocole illustre des méthodes pour extraire le sperme des testicules des mâles et ensuite inséminer les souris femelles. Cette procédure est utile lorsque l&#39;heure précise est nécessaire dans les études de développement ainsi que les travaux transgéniques.

Le sperme de récolte et l&#39;insémination artificielle des souris

Les rongeurs du genre Peromyscus (souris sylvestres) sont les mammifères indigènes les plus répandus en Amérique du Nord. Les espèces de Peromyscus sont utilisées dans un large éventail de recherches...

Je m'appelle Amanda Dli du laboratoire du Dr Paul Verana à l'Université de Californie à Irvine. Aujourd'hui, je vais démontrer la procédure d'insémination artificielle. Cela consiste à extraire le sperme du mâle, puis à introduire ce sperme dans une femelle en cours d'ovulation.La raison pour laquelle vous souhaiteriez faire cela est que le mâle et la femelle peuvent ne pas s'accoupler au moment où vous en avez besoin, ou ils peuvent ne pas s'accoupler du tout. Là encore, cela peut également être utilisé avec du sperme congelé si une lignée de souris est très importante. Cette procédure est très importante à voir démontrée, car de nombreux manuels et revues ne montrent pas la méthode appropriée pour manipuler la souris.La souris peut être manipulée et injectée par une seule personne sans utiliser d'anesthésique sur la femelle. Cela implique que la femelle n'est en aucune façon blessée et garantit que la fécondation puisse suivre le meilleur chemin possible. Les instruments de dissection que nous utiliserons sont deux paires de pinces fines et une paire de ciseaux pointus.Ceux-ci seront utilisés pour isoler les meilleurs spermatozoïdes provenant des testicules et du tissu adipeux. U

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Biologie

Ici nous démontrons l'nouvellement développé, je • Cryo Kit pour la cryoconservation du sperme de souris. Deux cellules du développement embryonnaire scène avec des spermatozoïdes congelés-décongelés a été améliorée de manière cohérente dans cinq souches de souris à l'utilisation de ce kit. Sur une période de 1,5 années, 49 lignées de souris génétiquement modifiées ont été archivées par la cryoconservation du sperme avec le kit I • Cryo et plus tard avec succès récupéré par FIV.

Cryoconservation du sperme de souris et de récupération utilisant les I · Cryo Kit

La micro-injection d'ovocytes de souris est couramment utilisée à la fois pour la transgénèse classique ( c.-à-d. L'intégration aléatoire des transgènes) et le ciblage des gènes médié par CRISPR. Ce protocole examine les derniers développements en micro-injection, avec un accent particulier sur le contrôle de la qualité et les stratégies de génotypage.

Production de souris génétiquement modifiées par micro-injection d&#39;ovocytes

Liquéfaction du sperme est nécessaire pour les spermatozoïdes de se libérer du gel séminal. Cette étude fournit les procédures de collecte de sperme du coït postérieure de l’appareil reproducteur féminin et mesurer le temps de liquéfaction de sperme.

Collecte de sperme provenant de l’appareil reproducteur féminin et la mesure de la liquéfaction du sperme chez les souris après l’accouplement

Nous présentons ici un protocole visant à promouvoir l’intégration du transgène et la production de souris transgéniques fondateur avec grande efficacité par une simple injection d’un vecteur lentiviral dans l’espace périvitellin d’un ovocyte fécondé.

Production de souris transgéniques par des gènes : une méthode Simple et très efficace pour l’étude directe des fondateurs

Ici, nous présentons une méthode modifiée pour la cryoconservation des embryons à une cellule ainsi qu’un protocole qui couple l’utilisation d’embryons dégelés et l’électroporation pour la génération efficace de souris génétiquement modifiées.

Utilisation d’embryons décongelés par le gel pour la production à haut rendement de souris génétiquement modifiées

De nombreux modèles de rongeurs de l’endométriose sont limités par la complexité technique, la reproductibilité et/ou le besoin d’animaux immunodéprimés ou de souris rapporteures spéciales. Nous présentons un système simplifié d’induction des lésions en utilisant n’importe quelle souris expérimentale avec un système de notation objectif vérifiable indépendamment et sans exigence d’ovariectomie ou de chirurgie de survie.

Un modèle murin syngénique de l’endométriose utilisant des souris à cycle naturel

Ici, nous décrivons une technique simple destinée à la génération efficace de souris génétiquement modifiées appelée CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Cette méthode délivre des réactifs d’édition par électroporation dans des embryons avec une efficacité proche de 100%. Ce protocole est efficace pour les mutations ponctuelles, les petites insertions génomiques et les délétions dans les embryons de mammifères.

Édition efficace du génome de souris par électroporation CRISPR de zygotes

La méthode de manipulation cervicale présentée peut induire une pseudogrossesse chez la souris sans avoir besoin de reproduire des femelles avec des mâles vasectomisés. L’induction de la pseudogrossesse est nécessaire pour le succès du transfert d’embryons non chirurgical et de l’insémination artificielle non chirurgicale, qui sont également présentés.

Induction d’une pseudogrossesse chez les souris femelles sans avoir besoin de mâles vasectomisés avant le transfert d’embryons non chirurgical ou l’insémination artificielle

Ici, nous présentons une méthode d’injection de spermatides rondes (ROSI) chez la souris, une technique aux applications cliniques prometteuses et utile pour étudier les mécanismes sous-jacents au développement embryonnaire.

Injection ronde de spermatide de souris

Ici, nous présentons un protocole pour établir un modèle murin d’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI)-transfert d’embryon (ET), nous permettant d’observer les changements liés à l’âge dans le métabolisme du glucose qui peuvent être attribués à l’ICSI, donnant ainsi un aperçu de ses impacts potentiels à long terme sur le développement humain.

Surveillance de la glycémie chez la progéniture de souris après une injection intracytoplasmique de spermatozoïdes

Apprenez l'insémination artificielle chez la souris en extrayant le sperme des mâles pour féconder les femelles ovulantes. Cette méthode permet un contrôle précis du timing dans les études de développement et la recherche transgénique.

Le sperme de récolte et l'insémination artificielle des souris

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