Utiliser le système de fractionnement GELFREE 8100 pour les Poids Moléculaire à base de fractionnement avec récupération de la phase liquide

Bonjour, je m’appelle Jay Harkins. Je suis chercheur scientifique chez Protein Discovery. Aujourd’hui, je vais démontrer à quel point il est facile d’utiliser le nouveau système de fractionnement sans gel 8, 100 pour obtenir un fractionnement basé sur le poids moléculaire à récupération élevée.

En utilisant sans gel, vous pouvez charger jusqu’à un milligramme de protéines totales par canal et fractionner de manière reproductible jusqu’à huit échantillons en 90 minutes environ. Le système comprend donc un instrument, une cartouche jetable et tous les tampons dont vous avez besoin pour réaliser l’expérience. Alors commençons.

Commencez cette procédure en installant et en étiquetant jusqu’à huit tubes de 500 microlitres sur chaque tube. Ajoutez jusqu’à un milligramme de l’échantillon de protéines dans un volume allant jusqu’à 112 microlitres. La quantité de protéines dans l’échantillon dépend de la complexité de l’échantillon.

Pour des échantillons plus complexes, comme l’homogénat de tissu utilisé pour cette démonstration, 150 à 200 microgrammes par canal généreront les meilleurs résultats. Ensuite, ajoutez 30 microlitres de tampon de cinq x échantillons, qui est fourni dans le kit de cartouche sans gel. À chaque échantillon de protéines, ajoutez huit microlitres d’une molaire de DTT.

Ajustez ensuite chaque échantillon avec de l’eau jusqu’à un volume final de 150 microlitres. Ensuite, chauffez les flacons pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius pour dénaturer l’échantillon. Laissez les échantillons chauffés refroidir à température ambiante pendant que l’échantillon refroidit.

Retirez la cartouche sans gel 8, 100 de la pochette en aluminium. Retirez et jetez la scelleuse de plaques. Retirez la mémoire tampon de stockage des compartiments des cartouches à l’aide d’une pipette.

Si les huit chambres de la cartouche doivent être utilisées, retournez la cartouche pour vider la mémoire tampon de stockage des compartiments. Ensuite, huit millilitres de tampon sans gel sont ajoutés à chacun des réservoirs de tampon d’anode. Six millilitres sont ajoutés à chacun des réservoirs tampons cathodiques, et 100 microlitres sont piptés dans chacune des chambres de collecte.

À l’aide d’une pipette à huit canaux de 100 à 200 microlitres, retirez et jetez tout tampon qui s’est écoulé du réservoir de tampon cathodique dans la chambre de chargement des échantillons et chargez immédiatement les échantillons dans les chambres de chargement. Une fois les échantillons chargés, placez la cartouche dans la station de fractionnement sans gel 8, 100. Abaissez ensuite les réseaux d’électrodes et fermez le couvercle à l’aide de l’interface utilisateur graphique facile à programmer sur l’écran tactile de l’instrument, accédez à la liste des méthodes préprogrammées disponibles.

Sélectionnez la méthode appropriée en appuyant sur le bouton de méthode. Appuyez sur le bouton de récupération et entrez le numéro de la méthode préprogrammée souhaitée À l’aide du clavier à l’écran, appuyez sur OK. Appuyez ensuite sur le bouton d’application.

La méthode qui a été appliquée apparaîtra en bas de l’écran principal. Chacune des méthodes préprogrammées se compose de tensions réglées et de pauses temporelles conçues pour résoudre les protéines dans une plage spécifique de poids moléculaires. Une fois la méthode appropriée sélectionnée, appuyez sur le bouton de chaîne sur l’écran principal.

Sélectionnez ensuite les canaux qui seront utilisés dans l’exécution. Pour sélectionner les huit canaux, appuyez sur Sélectionner tout. Appuyez ensuite sur OK.

Pour revenir à l’écran principal, assurez-vous que le couvercle de sécurité est fermé et que le voyant est vert en bas de l’écran. Appuyez maintenant sur start pour commencer l’expérience pendant que le système est en cours d’exécution, les cercles affichés dans la case sur le côté gauche de l’écran représentent l’état de chaque canal. Un cercle vert indique que le canal est actif.

Les tensions et les courants appliqués sont affichés à droite des cercles d’état des canaux. Le 8, 100 sans gel s’arrêtera automatiquement pour la collecte des fractions à l’intervalle spécifié dans la méthode. Lorsque l’instrument est mis en pause pour collecter des fractions, une boîte de texte apparaît pour vous informer qu’une pause s’est produite et que les cercles d’état deviennent jaunes.

À l’intérieur de la cartouche, une tension constante est appliquée entre l’anode et les réservoirs de la cathode. Sous ce potentiel, le mélange de protéines est entraîné par électrophorèse de la chambre de chargement et dans la coulée de précision spécialement conçue. Les protéines du gel s’empilent d’abord à l’intérieur d’une bande pointue dans le gel d’empilement, puis se résolvent en fonction de leur poids moléculaire respectif dans le gel de résolution.

Au fur et à mesure que les protéines éluent du gel, elles sont piégées et concentrées en phase liquide. Dans la chambre de collecte sans gel. L’instrument est ensuite mis en pause.

Sur la base d’intervalles de temps présélectionnés, les fractions sont collectées à l’aide d’une pipette. Ensuite, le potentiel est appliqué à nouveau pour faire allusion à la fin de piéger la deuxième fraction de poids moléculaire d’intérêt. Ce processus est ensuite répété jusqu’à ce que toutes les fractions souhaitées aient été collectées.

Chaque cartouche contient huit canaux électrophorétiques indépendants, de sorte que l’utilisateur peut exécuter autant de canaux qu’il le souhaite et enregistrer les canaux inutilisés pour une utilisation ultérieure. Pour retirer les fractions, ouvrez le couvercle de l’instrument, puis utilisez la pipette à canal inné. Transférez les 150 microlitres de liquide dans chacune des chambres de collecte dans des tubes de collecte ou une plaque multi-puits.

Une fois les fractions éliminées, lavez deux fois la chambre de collecte avec un tampon sans gel en ajoutant 100 microlitres par canal et en pipetant deux fois vers le haut et vers le bas. Après le lavage, ajoutez 100 microlitres de tampon sans gel dans les chambres de collecte. Fermez le couvercle et appuyez sur le bouton de reprise.

Le 8, 100 sans gel fonctionnera jusqu’au prochain intervalle de temps. Le temps total restant dans l’expérience est indiqué sur le côté droit de l’écran. Appuyez sur le bouton situé au-dessus de la case d’affichage du temps pour basculer entre le temps restant, le temps écoulé et le temps de pause.

Une fois que toutes les fractions ont été collectées, elles peuvent immédiatement être utilisées pour une préparation ultérieure en aval, telle que la focalisation isoélectrique ou l’électrophorèse sur gel, ou pour l’analyse par chromatographie liquide, spectrométrie de masse ou immuno-affinité. Dans cette démonstration, huit échantillons de protéines de 200 microgrammes chacun ont été divisés en 12 fractions chacun, pour un total de 96 fractions. Pour visualiser les résultats du fractionnement et de l’aliquote de chacune des 12 fractions de l’homogénat de foie bovin, un échantillon a ensuite été analysé sur un gel 1D standard et coloré à l’argent.

Comme le montre cette figure, l’échantillon de protéines a été fractionné en 12 fractions distinctes couvrant la gamme de poids moléculaire de 3,5 kilodaltons à 150 kilodaltons. Le gel présenté ici met en évidence la capacité du système sans gel 8, 100 à fractionner une grande quantité de protéines en fractions de poids moléculaire distinctes. Il s’agit d’un outil incroyablement puissant pour la protéomique descendante et ascendante utilisant la spectrométrie de masse ainsi que des expériences d’immuno-affinité où une seule fraction de poids moléculaire de protéine intacte purifiée est requise.

Ce fut un plaisir de vous montrer à quel point il est facile d’utiliser le système de fractionnement sans gel 8, 100 pour partitionner de manière reproductible votre échantillon en fractions de poids moléculaire discrètes et obtenir une récupération de phase liquide élevée. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.