Utiliser le système de fractionnement GELFREE 8100 pour les Poids Moléculaire à base de fractionnement avec récupération de la phase liquide

Bonjour, je m'appelle Jay Harkins. Je suis scientifique chercheur chez Protein Discovery. Aujourd'hui, je vais montrer à quel point il est facile d'utiliser le nouveau système de fractionnement sans gel 8, 100 pour obtenir un fractionnement basé sur la masse moléculaire avec un rendement élevé.

À l'aide du système sans gel, vous pouvez charger jusqu'à un milligramme de protéines totales par canal et fractionner de manière reproductible jusqu'à huit échantillons en environ 90 minutes. Le système comprend donc un instrument, une cartouche jetable et tous les tampons nécessaires pour réaliser l'expérience. Commençons donc.

Commencez cette procédure en préparant et en étiquetant jusqu'à huit tubes de 500 microlitres chacun. Ajoutez jusqu'à un milligramme de l'échantillon de protéine dans un volume allant jusqu'à 112 microlitres. La quantité de protéine dans l'échantillon dépend de la complexité de celui-ci.

Pour des échantillons plus complexes, tels que l'homogénat tissulaire utilisé dans cette démonstration, 150 à 200 microgrammes par canal produiront les meilleurs résultats. Ensuite, ajouter 30 microlitres de tampon d'échantillonnage 5 x, fourni dans le kit de cartouche sans gel. À chaque échantillon protéique, ajouter huit microlitres de DTT à une molaire.

Ensuite, ajustez chaque échantillon avec de l'eau jusqu'à un volume final de 150 microlitres. Puis chauffez les vials pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius afin de dénaturer l'échantillon. Laissez refroidir les échantillons chauffés à la température ambiante pendant que les échantillons refroidissent.

Retirez la cartouche libre de gel 8, 100 de son sachet en aluminium. Retirez et jetez le scellant de plaque. Éliminez le tampon de stockage des compartiments de la cartouche à l’aide d’une pipette.

Si les huit chambres de la cartouche doivent être utilisées, retournez la cartouche afin d'évacuer le tampon de stockage des compartiments. Ensuite, ajoutez huit millilitres de tampon de migration sans gel dans chacun des réservoirs anodiques. Ajoutez six millilitres dans chacun des réservoirs cathodiques, et pipetez 100 microlitres dans chacune des chambres de collecte.

À l’aide d’une pipette multipuits de 100 à 200 microlitres, retirez et jetez tout tampon ayant migré du réservoir tampon cathodique vers la chambre de chargement des échantillons, puis chargez immédiatement les échantillons dans les chambres de chargement. Une fois les échantillons chargés, insérez la cartouche dans la station de fractionnement gel free 8, 100. Abaissez ensuite les électrodes et fermez le couvercle à l’aide de l’interface graphique facile à programmer affichée sur l’écran tactile de l’appareil, puis accédez à la liste des méthodes préprogrammées disponibles.

Sélectionnez la méthode appropriée en appuyant sur le bouton méthode. Appuyez sur le bouton de récupération et saisissez le numéro de la méthode préprogrammée souhaitée à l’aide du clavier à l’écran, puis appuyez sur OK. Ensuite, appuyez sur le bouton appliquer.

La méthode qui a été appliquée apparaîtra au bas de l'écran principal. Chacune des méthodes préprogrammées comprend des tensions prédéfinies et des pauses temporelles conçues pour séparer des protéines dans une plage spécifique de masses moléculaires. Une fois la méthode appropriée sélectionnée, appuyez sur le bouton de canal à l'écran principal.

Ensuite, sélectionnez les canaux qui seront utilisés lors de l'exécution. Pour sélectionner les huit canaux, appuyez sur « sélectionner tout ». Puis appuyez sur « terminé ».

Pour revenir à l'écran principal, assurez-vous que le couvercle de sécurité est fermé et que le témoin lumineux est vert au bas de l'écran. Appuyez maintenant sur démarrer pour commencer l'expérience. Pendant que le système est en marche, les cercles affichés dans la boîte située à gauche de l'écran indiquent l'état de chaque canal. Un cercle vert indique que le canal est actif.

Les tensions et courants appliqués sont affichés à droite des cercles indiquant l'état des canaux. Le système Gel Free 8, 100 s'arrêtera automatiquement pour la collecte des fractions à l'intervalle spécifié dans la méthode. Lorsque l'appareil est en pause pour la collecte des fractions, une boîte de texte apparaîtra pour vous informer qu'une pause a eu lieu, et les cercles d'état deviendront jaunes.

À l'intérieur de la cartouche, une tension constante est appliquée entre les réservoirs de l'anode et de la cathode. Sous cet effet de potentiel, une force électrophorétique pousse le mélange de protéines depuis la chambre de chargement vers le gel de précision spécialement conçu. Les protéines du gel s'accumulent d'abord en une bande étroite dans le gel de concentration, puis sont séparées selon leurs masses moléculaires respectives dans le gel de séparation.

Alors que les protéines sortent du gel, elles sont piégées et concentrées en phase liquide. Dans la chambre de collecte, le gel est absent. L'instrument est ensuite mis en pause.

Des fractions sont collectées selon des intervalles de temps prédéfinis à l’aide d’une pipette. Ensuite, un potentiel est à nouveau appliqué afin d’entraîner la fin du piégeage de la seconde fraction de poids moléculaire d’intérêt. Ce processus est ensuite répété jusqu’à ce que toutes les fractions souhaitées aient été collectées.

Chaque cartouche contient huit canaux électrophorétiques indépendants, ce qui permet à l'utilisateur d'utiliser autant de canaux que nécessaire et de conserver les canaux inutilisés pour une utilisation ultérieure. Pour récupérer les fractions, ouvrez le couvercle de l'appareil, puis utilisez la pipette intégrée au canal. Transférez les 150 microlitres de liquide contenus dans chacune des chambres de collecte vers des tubes de collecte ou une plaque multipuits.

Une fois les fractions retirées, laver deux fois la chambre de collecte avec du tampon de migration sans gel en ajoutant 100 microlitres par canal et en aspirant et expulsant deux fois à l’aide d’une pipette. Après le lavage, ajouter à nouveau 100 microlitres de tampon de migration sans gel dans les chambres de collecte. Fermer le couvercle et appuyer sur le bouton de reprise.

Le gel libre 8, 100 fonctionnera jusqu'au prochain intervalle de temps. Le temps total restant dans l'expérience est indiqué du côté droit de l'écran. Appuyez sur le bouton situé au-dessus de la case affichant le temps pour basculer entre le temps restant, le temps écoulé et le temps de pause.

Une fois toutes les fractions collectées, elles peuvent être utilisées immédiatement pour des préparations ultérieures, telles que la focalisation isoélectrique ou l'électrophorèse sur gel, ou pour des analyses par chromatographie liquide, spectrométrie de masse ou affinité immunologique. Dans cette démonstration, huit échantillons protéiques de 200 microgrammes chacun ont été répartis en 12 fractions chacun, soit un total de 96 fractions. Pour visualiser les résultats de la fractionation, un aliquot de chacune des 12 fractions provenant de l'échantillon d'homogénat de foie de bovin a ensuite été analysé sur un gel standard en 1D et coloré à l'argent.

Comme le montre cette figure, l'échantillon protéique a été fractionné en 12 fractions distinctes couvrant une gamme de masses moléculaires allant de 3,5 à 150 kilodaltons. Le gel présenté ici met en évidence la capacité du système sans gel 8, 100 à fractionner une grande quantité de protéines en fractions distinctes selon leur masse moléculaire. Cet outil extrêmement puissant est utile pour les approches protéomiques « haut vers bas » et « bas vers haut » par spectrométrie de masse, ainsi que pour les expériences d'affinité immunitaire nécessitant une fraction unique de protéine intacte purifiée selon sa masse moléculaire.

Il a été un plaisir de vous montrer à quel point il est facile d'utiliser le système de fractionnement sans gel 8, 100 pour partitionner de manière reproductible votre échantillon en fractions distinctes selon leur masse moléculaire, et d'obtenir une forte récupération en phase liquide. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.