Name: Mammaires épithéliales procédure de greffe (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Découvrez la greffe d'épithélium mammaire chez la souris pour étudier le développement glandulaire. Cette méthode permet d'analyser la croissance des arbres épithéliaux ductaux et la biologie du cancer du sein.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Préparation de l'épithélium Transplant Tissu du donneur frais ou congelés épithéliales peuvent être transplantées dans le coussin effacé la graisse, mais une préparation préalable de l'épithélium des bailleurs de fonds gelés est plus pratique avec une diminution minimale de l'efficacité de la transplantation (efficacité&gt; 85%). Le protocole pour la préparation de l'épithélium des bailleurs de fonds gelés est comme suit: Avant de préparer l'épithélium greffe des donateurs, des médias congeler pour préparer l'épithélium et aliquot environ 1 ml dans des cryotubes. Cela peut être conservé à 4 ° C pour un maximum de 6 mois jusqu'à ce que nécessaire. Gel des médias contient DMEM/F12 médias tamponnée avec HEPES et NaHCO 3, 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO). Récolte épithélium mammaire d'une souris récemment euthanasiés femelle. <ol><li> Laver la souris avec de l'EtOH 70%. </li><li> Faites une coupe mi-sagittale à travers la paroi du corps s'étendant du pubis au sternum sans percer la membrane séreuse de la cavité ventrale du corps. Faire une coupe oblique de l'incision initiale au niveau du pubis vers chaque patte postérieure (Figure 1). </li><li> Peler la paroi du corps loin de la membranes séreuses pour exposer le 5 ème glandes mammaires inguinales attaché à la planche de bord sur le dessous de la paroi du corps. La meilleure façon d'y parvenir est en saisissant les membranes séreuses avec soin la partie incurvée d'une paire de pinces courbes, en faisant attention à ne pas percer la cavité ventrale du corps. Simultanément, saisissez le bord coupé du tégument avec une pince dentée droite et tirez la paroi du corps loin de la membranes séreuses. </li><li> Identifier les ganglions lymphatiques dans la glande mammaire. Le ganglion est situé à l'intersection de trois vaisseaux sanguins de premier plan dans la glande mammaire et peut être ressenti comme un nodule dense dans le coussinet adipeux (figure 2). Avec la pointe d'une paire de ciseaux des yeux, étouffer le tissu adipeux entourant le nœud. Avec un doigt avant sur le côté épidermique de la peau, appliquer une pression pour élever le noeud hors du coussinet adipeux et pincez avec une paire de pinces courbes. Jeter les ganglions lymphatiques. </li><li> Tout en maintenant les marges de la peau, saisir le pad mammaires graisse avec le bord incurvé d'une paire de pinces courbes et progressivement éplucher les coussinet adipeux loin de la paroi du corps. Suivre la direction du coussinet adipeux vers la surface dorsale de la souris comme vous enlever la glande mammaire de toute une pièce. </li><li> Mettez la glande mammaire sur un bloc de coupe en plastique stérile. Ajouter une petite quantité de médias, à environ 200 pi, à la surface de la glande pour le garder humide. Hacher la glande en morceaux 1mm avec une lame de rasoir propre. Divisez la glande hachée en quatre portions et distribuer entre quatre cryotubes des médias gel avec une pince. Mettez les cryotubes dans un Nalgene "congélateur M. cellules Frosty qui a 250ml d'alcool isopropylique dans le compartiment externe. Mettez au congélateur Nalgene dans un congélateur à -70 ° C pendant 24 heures. Conserver les flacons congelés de fragments mammaires dans l'azote liquide jusqu'à requis pour transplantation. Chaque cryovial va contenir des fragments de glande mammaire de suffisamment de transplanter dans les coussinets effacé la graisse de 4 à 8 souris hôte. </li></ol> 2. Préparation des cellules Transplant Notre laboratoire a transplanté différents types de cellules, y compris immortalisé lignées de cellules épithéliales mammaires, des lignées cellulaires tumorales mammaires ou des cellules primaires mammaires de souris dans un coussinet adipeux effacé. Le protocole pour la préparation des virgules D cellules pour la transplantation est la suivante: <ol><li> Comma-D cellules sont cultivées dans les médias réguliers MECL contenant du DMEM: F12 supplémenté avec 2% de sérum bovin adulte (ABS), mEGF, insuline, antibiotique / antimycotique (AB / AM). </li><li> Récolte Comma-D cellules lorsque les cellules sont confluentes à 85% -90%. </li><li> Centrifuger la suspension cellulaire à 1200rpm pendant 5 minutes pour sédimenter les cellules. Resuspendre les cellules dans l'eau douce des médias MECL et ajuster la concentration de cellules de 5 x 10 6 / ml. </li></ol> Pour la transplantation de cellules primaires mammaires, les cellules épithéliales mammaires primaires sont isolés de souris 5 ème glandes mammaires par dissociation mécanique et enzymatique. Les cellules sont remises en suspension dans du DMEM: F12 et des médias ajusté à la concentration désirée, généralement de 5 x 10 6 / ml. 3. Procédure standard pour la compensation de la glande mammaire de souris Fat <ol><li> Anesthésier la souris trois semaines vieil hôte. Sélectionnez les souris qui sont &lt;12 g pour s'assurer que la croissance mammaires canalaires n'a pas été initié. Nous utilisons 200mg/kg de poids corporel de 2,2,2-tribromoéthanol. </li><li> Après la souris est anesthésiée, fermement empêcher la souris, la face ventrale avec des membres tendus, sur une scène chirurgicale afin que l'abdomen est narguer. Avant la chirurgie, d'administrer des analgésiques; soit bupivacaïne (1mg/kg &lt;) ou buprénorphine (0.05mg/kg), sous-cutanée. </li><li> Saisir la peau avec une pince de quelques millimètres au-dessus du bassin et le soulever de l'abdomen . Nip la peau avec des ciseaux et de faire une coupe mi-sagittale à travers la paroi du corps s'étendant du pubis au sternum. Ne pas percer les membranes séreuses de la cavité ventrale du corps. Ne faites pas votre incision initiale trop proche de l'urètre afin que les clips blessure ne sera pas interférer avec la capacité de la souris pour uriner. </li><li> De l'incision initiale, faire des coupes obliques à travers la peau de la mi-ligne à travers le bassin vers chaque patte postérieure. </li><li> Utilisez la zone incurvée de la pince incurvée pour saisir délicatement les membranes séreuses. Utilisez une pince pour saisir les tissus de la marge de coupe de la peau et tirez la paroi du corps loin de la membranes séreuses et d'exposer la 5 ème glandes mammaires inguinales situées sur la façade sur le dessous de la paroi du corps. </li><li> Cautériser le mamelon, noeud et deux artères menant au nœud (figure 2) </li><li> Séparer les glandes quatrième et cinquième. Cautériser la marge de la glande cinquième à éviter interposition de la glande 6 ème. </li><li> Divisez le coussinet adipeux de la glande mammaire par quatrième coupant le coussinet adipeux avec des ciseaux juste ventrale (côté vers mamelon) du noeud. Utilisez une pince incurvée de saisir fermement la partie ventrale du coussinet adipeux et il se détache de la paroi du corps en un seul morceau. Appuyez sur la partie ventrale du coussinet adipeux entre deux diapositives et mettre dans un plat en verre coloration histologique contenant fixateur de Carnoy. Ce tissu sera fixé et coloré plus tard avec solution d'alun de carmin pour vérifier les marges effacé (figure 3). Nettoyez le fascia autour de la région de la partie enlevée du coussinet adipeux pour éliminer toute trace de la glande mammaire avec la pince courbe. </li></ol> 4. Alternative "Procédure Sparing pour la compensation du coussinet adipeux Après une est devenue compétente avec la procédure standard pour la compensation du tapis de souris mammaires graisses, ils peuvent préférer tenter la procédure en épargnant moins invasif développé par Brill et al. (2008) 2. <ol><li> Préparer la souris comme pour la procédure standard. </li><li> Saisir le mamelon de la glande mammaire de quatrième inguinale et découpez un cercle 3-5 mm circonférence autour du mamelon avec la pointe de ciseaux. </li><li> Tirez la tétine loin du corps pour détacher la partie découpée de la peau et tirer le quatrième glande mammaires inguinales par le trou. </li><li> Identifier le nœud. Utilisez la cautérisation cautériser le noeud et la glande mammaire de 6 ème à travers le trou. </li><li> Couper et détacher la partie la plus superficielle de la glande mammaire de 5 ème, juste avant le nœud. Le mamelon, zone circulaire de la peau et une partie de l'épithélium coussinet adipeux mammaires contenant sont retirés en une seule pièce. </li></ol> 5. Tissu / transplantation de cellules <ol><li> Pour les fragments épithélium transplantation, décongeler un cryovial de l'épithélium et le transfert des fragments épithéliaux d'une boîte de Petri contenant un milieu frais pour diluer le DMSO. Faire un petit trou ou une poche dans le pad effacé la graisse avec la pointe de ciseaux pour le nouvel épithélium. Mettre un morceau de 1 mm de l'épithélium des bailleurs de fonds dans la poche avec une pince aiguille. Tenir la poche fermée avec une pince le tissu que vous retirer l'aiguille de sorte pince le tissu reste en place. </li><li> Pour les cellules du repiquage, d'injecter 50 000 cellules dans 10 ul de médias dans chaque coussinet adipeux aide d'une seringue 50 pl Hamilton avec une aiguille de calibre 22s. </li></ol> 6. Fermeture / Relance de la souris <ol><li> Disposer de la peau pour la fermeture. Saisir opposés marges de la peau, les maintenir ensemble avec des pinces, les soulever loin de la membranes séreuses de la cavité ventrale du corps et fermer avec des clips plaie. Typiquement, il est nécessaire d'utiliser deux clips pour fermer l'incision sagittal et un clip pour chaque incision oblique pour la procédure standard. Evitez d'obstruer l'urètre. Il peut être nécessaire pour combler les lacunes dans la peau à l'intersection des incisions mi-sagittal et oblique, avec une suture. La procédure en épargnant ne nécessiteront un clip blessure pour chaque côté. </li><li> . Placez la souris dans sa cage et garder la cage sous une lampe chauffante jusqu'à ce que la souris a relancé. </li><li> Les clips plaie doit être retiré après 2 semaines. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Démonstration du modèle de l'incision. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Situation des ganglions lymphatiques, les vaisseaux sanguins, le mamelon et l'épithélium endogène. Cauterize aux endroits indiqués. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Montez la figure 3. Entier démontre que l'épithélium endogène est limité à la zone dans le cercle et donc les marges sont "clairs". 7. Les résultats représentatifs _r.jpg "alt =" Figure 4 "/&gt; Figure 4. Monter entiers de coussinet adipeux retirés de souris à 3 semaines anciennes montrant des marges effacés. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2_r.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Monture entier d'une souris 10 semaines anciennes montrant coussinet adipeux débarrassé de l'épithélium mammaire endogène. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3_r.jpg" alt="Figure 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 6"> Figure 6. Hématoxyline et l'éosine la section teinté d'un tampon effacé la graisse d'une souris 10 semaines vieux. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig4_r.jpg" alt="Figure 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 7"> Figure 7. Mont entier d'une souris 10 semaines anciennes montrant normale arbres mammaires canalaires développé à partir de l'épithélium transplanté. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig5_r.jpg" alt="Figure 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 8"> Figure 8. Hématoxyline et l'éosine la section des conduits mammaires teinté développé à partir de l'épithélium transplanté. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig6_r.jpg" alt="Figure 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 9"> La section Figure 9. Hématoxyline et l'éosine teinté d'une tumeur mammaire développé à partir de l'épithélium transplanté.

<ol><li>DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li>
<li>Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sparing+procedure+to+clear+the+mouse+mammary+fat+pad+of+epithelial+components+for+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis.</a> Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).</li>
<li>Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammary-specific+model+demonstrates+the+role+of+the+p53+tumor+suppressor+gene+in+tumor+development%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development.</a> Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).</li>
<li>Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li>
<li>Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439, 993-997 (2006).</li>
<li>Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preneoplastic+Lesions+in+Murine+Mammary+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer.</a> Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).</li>
<li>Wagner, K. -U., Boulanger, C. A., Henry, S. gagias, Hennighausen, M., Smith, G. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adjunct+mammary+epithelial+cell+population+in+parous+females%3A+its+role+in+functional+adaptation+and+tissue+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal.</a> Development. 129, 1377-1386 (2002).</li>
<li>Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+and+progesterone+induce+persistent+increases+in+p53-dependent+apoptosis+and+suppress+mammary+tumors+in+BALB%2Fc-Trp53%2B%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).</li>
</ol>

Dans ce rapport, nous présentons deux méthodes alternatives pour dégager le tapis de souris mammaires de graisse dans la préparation de greffes mammaires épithéliales. La procédure standard a été en usage depuis son élaboration en 1959 par RomanDing et al. 1 Bien plus invasives, la méthode standard est la méthode préférée pour la formation des novices, car la structure et l&#39;orientation de la glande mammaire sont facilement visualisés. Toutefois, la procédure en épargnant peut être préférée par le...

mammaires épithéliales procédure de greffe

Mammary Epithelial Transplant Procedure

Cet article décrit et compare la procédure de dédouanement coussinet adipeux développé par RomanDing Ko et al. 1 et la procédure en épargnant développé par Brill B et al. 2, suivie par la procédure de greffe épithéliales mammaires. La procédure de greffe mammaire est largement utilisée par les biologistes mammaires car il faut profiter du fait que le développement significatif de l&#39;épithélium mammaire ne se produisent qu&#39;après la puberté. A 3 semaines d&#39;âge, la croissance de l&#39;arbre épithéliales mammaires est confinée à la proximité de la tétine et le coussinet adipeux est largement dépourvue d&#39;épithélium mammaire, mais par sept semaines d&#39;âge de l&#39;arbre canalaire s&#39;étend à travers l&#39;épithélium du pavé toute la graisse. Par conséquent, si cette petite portion du coussinet adipeux contenant l&#39;épithélium, la région entre le mamelon et le ganglion lymphatique, est enlevé à 3 semaines d&#39;âge, l&#39;épithélium endogènes ne sera jamais remplir le pad mammaires graisse et le coussinet adipeux est décrit comme «effacé ». A cette époque, l&#39;épithélium mammaire d&#39;une autre source peut être transplantées dans le coussin effacé graisse où il a le potentiel pour étendre mammaires canalaires arbres à travers le coussinet adipeux. Cette procédure a été utilisée dans de nombreux modèles expérimentaux, y compris l&#39;examen de phénotype tumoral dans le tissu épithélial mammaire transgéniques sans effets confondants du génotype sur l&#39;animal entier 3, dans l&#39;identification des cellules souches mammaires en transplantant des cellules à une dilution limitée de 4,5, la détermination Si nodules hyperplasiques procéder à des tumeurs mammaires 6, et d&#39;évaluer l&#39;effet de l&#39;exposition aux hormones sur le comportement antérieur de l&#39;épithélium mammaire 7,8. Trois souris semaine ancien hôte sont anesthésiés, nettoyés et sobre sur un stade chirurgical. Une incision médiane sagittale est faite à travers la peau, mais pas le péritoine, qui s&#39;étend du pubis au sternum. Coupes obliques sont faites à travers la peau de l&#39;incision médiane sagittale à travers le bassin vers chaque jambe. La peau est arrachée de le péritoine pour exposer la 4e glandes mammaires inguinales. Le coussinet adipeux est effacé en supprimant la partie antérieure du coussinet adipeux du tissu à l&#39;envahissement ganglionnaire. Fragments épithélium ou des cellules épithéliales sont transplantées dans le coussin reste graisses effacé et la souris est fermé.

Cet article montre la procédure développée par RomanDing KB<em&gt; Et al.</em&gt; (1959) et la procédure en épargnant développé par Brill B<em&gt; Et al.</em&gt; (2008) pour la compensation du 4e inguinale pad mammaires graisse de souris pubère en préparation pour la greffe de fragments de glande mammaire, les cellules épithéliales mammaires ou les cellules tumorales mammaires.

Mammaires épithéliales procédure de greffe

Cet article décrit et compare la procédure de retrait du coussinet adipeux développée par DeOme KB et al.1 et la procédure d'épargne développée par Brill B et al.2, ...

Ce vidéo montre les procédures permettant de prélever des mémoires. Épithélium, éliminer la couche grasse de la mémoire et transplanter un épithélium exogène afin d'étudier le développement de la mémoire chez des souris âgées de trois semaines. La croissance de l'arbre épithélial de la mémoire est alors limitée à la région du mamelon, et la couche grasse est presque dépourvue d'épithélium mammaire. À mesure que la souris grandit, l'arbre épithélial s'étend à travers la couche grasse.Vers l'âge de sept semaines, l'arbre canalaire épithélial s'étend dans tout le bourrelet adipeux. Si la petite portion du bourrelet adipeux contenant l'épithélium est retirée à l'âge de trois semaines, l'épithélium endogène n'envahira jamais le bourrelet adipeux greffé et le bourrelet est alors considéré comme débarrassé, et le restera à l'âge adulte. Les greffons épithéliaux, toutefois, possèdent la capacité de développer des arbres canaliculaires épithéliaux dans tout le bourrelet hôte débarrassé.Glande adipeuse. L'histologie peut ensuite être utilisée pour surveiller la progression du développement de la mémoire dans les tissus transplantés provenant d'animaux transgéniques ou d'animaux de test. Bonjour, je m'appelle Joseph Jerry, et je travaille au Département des sciences vétérinaires et animales de l'Université du Massachusetts.Bonjour, je m'appelle Karen Dunphy. Je travaille au laboratoire de Jerry. Aujourd'hui, nous allons effectuer une greffe d'épithélium mammaire.Nous utilisons cette procédure pour étudier la base moléculaire et cellulaire de la genèse des tumeurs mémoire et pour modéliser le cancer du sein. Commençons donc. La première étape de la procédure de transplantation consiste à prélever un tissu épithélial mémoire de la souris donneur.Commencez par laver une souris femelle récemment euthanasiée avec de l'éthanol à 70 % sans percer les membranes des SRU de la cavité abdominale. Effectuez une incision médiane sagittale à travers la peau, de la symphyse pubienne jusqu'au sternum. Ensuite, pratiquez une incision oblique à partir de l'incision initiale au niveau du pubis vers chaque membre postérieur.À l’aide de pinces courbes, saisir les membranes des SRU. Puis, à l’aide de pinces droites cannelées, saisir le bord coupé de la peau et détacher soigneusement la paroi corporelle des membranes des S cs.Pour exposer la quatrième glande inguinale associée à la face inférieure de la paroi corporelle, localisez le ganglion lymphatique situé dans la glande mammaire à l'intersection de trois vaisseaux sanguins proéminents ; il peut être perçu au toucher comme un nodule dense au sein du bourrelet adipeux. À l’aide de la pointe d’une paire de ciseaux oculaires, sectionnez délicatement le tissu adipeux entourant le ganglion lymphatique. Ensuite, en appliquant une pression avec l’index sur la face épidermique de la peau, faites émerger le ganglion du bourrelet adipeux et pincez-le pour le détacher.Avec une paire de forceps courbes, éliminer le ganglion lymphatique. Maintenant, tout en tenant les bords de la peau, saisir le bourrelet adipeux avec le bord courbe d'une paire de forceps courbes et détacher progressivement le bourrelet de la paroi abdominale. En suivant la direction du bourrelet vers la surface dorsale de la souris, retirer complètement la glande mammaire en un seul morceau.Placer la glande mammaire sur un bloc de découpe en plastique stérile avec une petite quantité de milieu, environ 200 microlitres appliqués à la surface de la glande pour la maintenir humide. Ensuite, hacher finement la glande en morceaux d'un millimètre à l'aide d'un nouveau scalpel. Répartir la glande hachée en quatre portions.Ensuite, à l’aide de pinces, répartir dans quatre cryotubes contenant le milieu de congélation. Placer les cryotubes dans un congélateur cellulaire Nalgene contenant 250 millilitres d’alcool isopropylique dans le compartiment extérieur. Puis placer le congélateur cellulaire à moins 70 degrés Celsius pendant 24 heures.Après 24 heures, transférez les cryotubes contenant les fragments de mémoire dans l'azote liquide jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires pour la transplantation. Chaque cryotube contient suffisamment de fragments de glandes de mémoire pour être transplantés dans les bourrelets graisseux vidés de quatre à huit souris hôtes. Après avoir vérifié la profondeur de l'anesthésie d'une souris hôte âgée de trois semaines par une pincée ferme du orteil, immobilisez fermement la souris en position dorsale, les membres étendus sur un plateau chirurgical, de manière à ce que son abdomen soit tendu.Un analgésique préopératoire, la bupivacaïne ou la buprénorphine, doit être administré par voie sous-cutanée. Désinfecter la zone chirurgicale à l’aide d’alcool et d’un antiseptique à base d’iode en utilisant une pince. Saisir la peau à quelques millimètres au-dessus du pelvis et la soulever depuis l’abdomen.Incisez soigneusement la peau, en veillant à ce que l'incision initiale ne soit pas trop proche de l'urètre, car la pose de clips de plaie pourrait alors gêner la miction de la souris. Ensuite, en prenant soin de ne pas percer les membranes des SRU, effectuez une incision midsagittale à travers la peau, de la symphyse pubienne jusqu'au sternum.À partir de l'incision initiale, pratiquez maintenant des coupes obliques à travers la peau depuis la ligne médiane en traversant le pelvis vers chaque membre postérieur. À l’aide de pinces courbes, saisissez délicatement les membranes séreuses de la paroi ventrale du corps. Puis, utilisez des pinces à tissus pour saisir la marge découpée de la peau et détacher la paroi corporelle des membranes séreuses.Pour exposer la quatrième glande inguinale mammaire, identifier la quatrième glande mammaire. Identifier la cinquième glande mammaire, cautériser le nœud du mamelon et les deux artères menant au nœud. Séparer la quatrième et la cinquième glande, puis cautériser la marge de la cinquième glande.Ensuite, à l’aide de ciseaux, couper transversalement le bourrelet adipeux juste au-dessous du ganglion pour diviser le bourrelet adipeux de la quatrième glande mammaire. À l’aide de pinces courbes, saisir fermement la portion ventrale du bourrelet adipeux et l’écarter de la paroi abdominale. Il est conseillé de comprimer le tissu excisé entre deux lames portant une étiquette et de le fixer dans un fixateur au carnoy.Ensuite, le tissu peut être coloré, monté et examiné afin de vérifier l'absence de marges tumorales. À l'aide de pinces, éliminer toutes les traces de la glande mnésique autour de la région où la portion de la couche adipeuse a été retirée. L'animal est désormais prêt pour une transplantation tissulaire ou cellulaire.On peut transplanter du tissu épithélial de donneur frais ou congelé instantanément dans le bourrelet adipeux vidé. Alternativement, on peut transplanter des lignées cellulaires épithéliales immortalisées, des tumeurs mémoire, des lignées cellulaires ou des cellules primaires. Pour plus de détails sur la préparation des cellules, veuillez consulter le protocole écrit accompagnant la transplantation des fragments d'épithélium. Préparé.Ce vidéo commence par la décongélation d'un flacon cryogénique d'épithélium et le transfert des fragments dans une boîte de Pétri contenant un milieu frais. Pour diluer le DMSO à l'aide de ciseaux, réalisez une poche dans l'épithélium du bourrelet adipeux dégagé de la souris receveuse. Puis, à l'aide de pinces à aiguille, insérez un fragment d'épithélium donneur d'un millimètre de long dans la poche.S'il est nécessaire, maintenir la poche fermée avec une pince à tissus et retirer la pince à aiguille afin que le tissu reste en place. Saisir les bords opposés de la peau. Les maintenir ensemble avec la pince. Les soulever loin des membranes c&eacute;reuses de la cavit&eacute; corporelle ventrale et refermer avec des agrafes chirurgicales. Utiliser deux agrafes pour fermer l'incision midsagittale et une agrafe pour chaque incision oblique. &Eacute;viter d'obstruer l'ur&egrave;tre si n&eacute;cessaire.Fermer les éventuels espaces cutanés au niveau de l'intersection des incisions midsagittale et obliques à l’aide d’un point de suture. Placer la souris dans sa cage et maintenir la cage sous une lampe chauffante jusqu’à ce que la souris ait repris connaissance. Les agrafes de fermeture doivent être retirées après deux semaines.Les diapositives suivantes montrent des images représentatives de ce que l'on peut s'attendre à trouver dans la glande mammaire de l'hôte après le dégagement du bourgeon nourricier et la greffe d'épithélium ; cette image montre l'épithélium mammaire endogène prélevé d'une souris âgée de trois semaines. Lors de la procédure de dégagement de la glande, observez les marges nettes au niveau du bord de section. Un montage complet comme celui-ci doit être préparé après chaque procédure afin d'évaluer la présence de marges dégagées.Cette image montre le bourrelet adipeux éliminé de la souris sept semaines après la procédure d'élimination. Notez que l'ensemble du bourrelet adipeux est dépourvu de mémoire, d'épithélium, d'hématine et d'asin. La coloration d'un bourrelet adipeux éliminé sept semaines après la procédure d'élimination démontre également que la glande est dépourvue d'épithélium de mémoire.Un exemple de montage complet d'un bourrelet adipeux clarifié transplanté avec un épithélium mémoire donneur provenant d'une souris âgée de 10 semaines est présenté. Remarquez que l'épithélium transplanté a produit des arbres ductaux épithéliaux normaux, de l'hématine et de l'asin. Coloration d'un bourrelet adipeux clarifié et de l'épithélium mémoire.La greffe d'épithélium au même âge révèle la production normale de canaux épithéliaux à partir de l'épithélium exogène. Ici, l'hématine et l'asin, coloration d'un bourrelet adipeux éclairci, montrent une greffe épithéliale ayant donné lieu à une tumeur de mémoire. Nous venons de vous montrer comment prélever l'épithélium mammaire et réaliser une greffe d'épithélium mammaire.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de sectionner les connexions entre la quatrième et la cinquième glande afin de cautériser le nœud et le mamelon, et d'éliminer toute trace d'épithélium endogène. Vous devez vous assurer qu'il n'existe aucune possibilité que l'épithélium endogène puisse envahir le bourrelet adipeux évidé. En outre, il est conseillé de conserver intacte la totalité de la portion de glande mammaire prélevée afin de vérifier l'absence de marges résiduelles.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dans ce rapport, nous démontrons un système pour isoler les cellules du donneur et de la culture de la glande mammaire de la souris, et la transplantation orthotopique ces cellules dans des souris bénéficiaires d'analyser stromales: interactions épithéliales pendant le développement de tumeurs mammaires.

Transplantation mammaires de cellules stromales et les cellules de carcinome chez les souris C57BL/6J

Imagerie time-lapse est utilisé pour évaluer le comportement des principaux pré-néoplasiques des cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de risque de cancer du sein afin de déterminer s'il existe des corrélations entre certains paramètres comportementaux et génétiques distinctes des lésions.

Imagerie time-lapse de primaires prénéoplasiques cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de cancer du sein

Les modèles précliniques évaluant la thérapie adjuvante ciblant les métastases du cancer du sein sont insuffisants. Pour remédier à cela, nous avons développé un modèle murin de métastases de l'adénocarcinome mammaire pulmonaire de novo , dans lequel les thérapies administrées dans le milieu adjuvant (résection post-chirurgicale des tumeurs primaires) peuvent être évaluées en fonction de l'impact sur les métastases pulmonaires préalablement ensemencées.

Procédures chirurgicales et méthodologie pour un modèle murin préclinique de De Novo Métastase du cancer mammaire

Ce protocole décrit des méthodes pour purifier, quantifier et caractériser les vésicules extracellulaires (EV) / les exosomes provenant de cellules épithéliales mammaires non adhérentes / mésenchymateuses et pour les utiliser pour transférer la capacité de formation de glandes mammaires aux cellules épithéliales mammaires luminescentes. Les EV / exosomes dérivés de cellules épithéliales mammaires de type tige peuvent transférer cette propriété cellulaire vers des cellules qui ingerent les EV /...

Transfert de la capacité de formation des glandes mammaires entre les cellules épithéliales basales mammaires et les cellules luminesnelles mammaires par des vésicules extracellulaires / des exosomes

Ce travail démontre une approche novatrice pour évaluer la prolifération, la différenciation et le potentiel de formation des vaisseaux des cellules souches endothéliales vasculaires (VESC) par une transplantation de graisse mammaire, suivie d'une préparation tissulaire complète pour l'observation microscopique. Une stratégie de traçage de lignage pour étudier le comportement des VESC in vivo est également présentée.

Une nouvelle technique de transplantation de graisse mammaire mammaire pour visualiser la génération de vaisseaux de cellules souches endothéliales vasculaires

Le but de ce protocole est de décrire une nouvelle approche de modélisation de cancer du sein basée sur l'injection intraductale de l'adénovirus Cre-exprimant dans les glandes mammaires de souris. Cette approche permet à la fois la manipulation de type cellulaire et d'organe d'événements oncogènes d'une manière contrôlée temporellement.

Modélisation du cancer du sein par injection intraductale d'adénovirus exprimant la cre dans la glande mammaire de souris

Cet article décrit une méthode de transplantation pour greffer les cellules épithéliales mammaires de rat de distributeur dans le tampon blanc interscapular de graisse des animaux destinataires. Cette méthode peut être utilisée pour examiner les effets de l’hôte et/ou du donneur sur le développement de l’épithélium mammaire et élimine le besoin de pré-compensation, étendant ainsi l’utilité de cette technique.

Transplantation de cellules épithéliales mammaires de rat dans le tampon blanc interscapulaire de graisse

Les modèles de xénogreffes dérivées de patients (PDX) et les modèles murins génétiquement modifiés transplantables récapitulent fidèlement les maladies humaines et sont des modèles préférés pour la recherche fondamentale et translationnelle sur le cancer du sein. Ici, une méthode est décrite pour transplanter orthotopiquement des fragments de tumeur mammaire dans le coussinet adipeux mammaire afin d’étudier la biologie tumorale et d’évaluer la réponse médicamenteuse.

Transplantation orthotopique de tumeurs mammaires comme modèles précliniques pour le cancer du sein

La méthode d’imagerie intravitale décrite ici utilise la deuxième génération harmonique de collagène et la fluorescence endogène du cofacteur métabolique NAD(P)H pour segmenter de manière non invasive un microenvironnement tumoral non marqué en compartiments tumoral, stromal et vasculaire pour une analyse approfondie des images intravitales 4D.

Une approche de segmentation sans étiquette pour l’imagerie intravitale du microenvironnement tumoral mammaire

Nous présentons ici des procédures chirurgicales détaillées pour la mastectomie endoscopique bilatérale avec conservation du mamelon via une seule incision axillaire avec reconstruction mammaire pré-pectorale immédiate par implant prépectoral. Cette procédure est une méthode sûre et viable pour les patientes atteintes d’un cancer du sein.

Mastectomie endoscopique bilatérale épargnant les mamelons par une seule incision axillaire avec reconstruction mammaire prépectorale immédiate par implant prépectoral

La présente étude fait état d’un protocole plus facile, rapide et économique permettant d’isoler et de cultiver efficacement des cellules épithéliales mammaires primaires (HMEC) humaines à partir de petites quantités de tissu mammaire. Ce protocole est adapté à la production rapide de HMEC primaires pour des applications de laboratoire et cliniques.

Isolement et culture de cellules épithéliales mammaires humaines primaires

Découvrez la greffe d'épithélium mammaire chez la souris pour étudier le développement glandulaire. Cette méthode permet d'analyser la croissance des arbres épithéliaux ductaux et la biologie du cancer du sein.

Mammaires épithéliales procédure de greffe

Explorer plus de vidéos