Name: Récupération des ovocytes de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Apprenez à récupérer les ovocytes et embryons chez Peromyscus en injectant le média FHM dans l'infundibulum de l'oviducte. Cette méthode optimise l'isolement cellulaire pour les études d'expression génique et la recherche transgénique.

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Je tiens à remercier Mike Dewey partir du Centre de stock génétique Peromyscus pour son aide, de patience et de connaissances.

Embryon / ovocytes de récupération <ol><li> Au moins deux heures avant le prélèvement des ovocytes / embryons, KSOM est placé dans les 37 º C incubateur à CO 2 et FHM doivent être décongelés à partir de -20 °. Un plat en verre contenant trois concaves puits peu profonds sont utilisés à des gouttes maison de KSOM dans l&#39;incubateur. Pour prévenir la déshydratation, l&#39;KSOM et le plat sont placés dans un conteneur à couvercle qui a l&#39;eau au fond. Cet appareil empêche l&#39;évaporation sans l&#39;utilisation d&#39;huile minérale. </li><li> Les oviductes d&#39;une femelle ovulation sont placées dans les médias FHM. Pour assurer l&#39;orientation et une infindibulum intacte, une petite section de l&#39;ovaire est coupé avec la section oviducte et petits de l&#39;utérus. Une aiguille de calibre 30 émoussée est utilisée pour expulser ovocytes / embryons de l&#39;oviducte en insérant l&#39;aiguille émoussée dans le infindibulum. Le infindibulum doit être utilisée pour récupérer les embryons depuis le tube oviducte est trop petit pour une aiguille à passer. Dans le cas où l&#39;infindibulum est détruit, l&#39;oviducte doit être soit éventrés ou des embryons évincés. </li><li> Ovocytes / embryons sont trouvés dans les médias FHM en concentrant le microscope sur les gouttelettes de graisse qui ont coulé au fond de la boîte de Pétri. Embryon / ovocyte isolement peut être réalisé à 20x car cela offre une plus grande surface de visionnement que fort grossissement. Embryon / ovocytes ressemblent rondes gouttelettes de graisse qui ont un anneau clair autour de lui. Pipetage à la bouche, en utilisant un verre tiré capillaire, est utilisé pour déplacer ovocytes / embryons d&#39;KSOM d&#39;incubation et de manipulations ultérieures. </li></ol> Procédure de récupération d&#39;ovocytes Préparation <ol><li> Dégel FHM et préparer kSOM. </li><li> Quelques heures plus tôt, kSOM placer dans un récipient de récupération d&#39;œuf et placer dans la boîte de la pointe avec de l&#39;eau dans le fond, placer en incubateur à CO 2. </li><li> Apportez des cages au laboratoire et de tuer les femelles récolte. </li><li> Découpez l&#39;oviducte en prenant soin de couper une partie de l&#39;ovaire et certains de l&#39;utérus pour s&#39;assurer que vous ne coupez pas partie de l&#39;oviducte. </li><li> Placer dans les médias FHM en petite boîte de Petri. </li><li> Verser un couple plus FHM médias boîtes de Pétri à être utilisé pour le rinçage. </li></ol> Flushing <ol><li> Utiliser une aiguille de rinçage (30 émoussée jauge) connecté à une aiguille à bout 1ml spirale. </li><li> Prendre un oviducte à la fois et en utilisant l&#39;aiguille, insérez-le dans infundibulum trouvé près de la partie de l&#39;ovaire gauche ci-joint. Si l&#39;infundibulum est détruit et ne peut pas être utilisé, puis prendre deux pinces et maintenez une extrémité de l&#39;oviducte. Avec la pince autre, presser doucement, comme un tube de dentifrice, pour éjecter toute l&#39;embryon. Note: Ceci créera une grande quantité de désordre dans la boîte de Pétri, comme beaucoup de tissu viendra avec elle, de sorte que vous pouvez utiliser un plat différent de Pétri par la suite. </li><li> Pour voir les embryons, l&#39;accent sur les morceaux de gras de microscope et rechercher des rondes &quot;morceau gras&quot; avec cercle clair autour de lui. Remarque: Les embryons ont le même aspect que la graisse, donc il peut être difficile à trouver. Les embryons couler au fond, alors regardez là-bas. </li><li> Ne frottis vaginaux de femelles receveuses. A ce stade, ils devraient être pseudogravides. </li></ol>

Dans cet article, nous démontrons la récupération d&#39;ovocytes à partir de l&#39;ovulation induite (superovulation) Peromyscus. L&#39;utilisation de superovulation (par opposition à cycle œstral naturel) est commune en raison du nombre beaucoup plus important qui en résulte. Cependant, il faut être prudent dans l&#39;interprétation des résultats en utilisant des ovocytes de telles / embryons, à la fois comme les hormones utilisées pour induire l&#39;ovulation et la culture peuvent avoir des effets. Lorsque œstral a été confirmée, ...

<table><tbody><tr><td>Aiguille de rinçage</td><td>Outil</td><td>Zephyrtronics</td><td>ZT5-130-L</td><td>30 G émoussée</td></tr><tr><td>Pinces (2)</td><td>Outil</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5060</td><td></td></tr><tr><td>Peromyscus</td><td>Animal</td><td>Peromyscus Genetic Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Outil</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Milieu FHM tamponné au HEPES</td><td>Réactif</td><td>Specialty Media</td><td>MR-025-d</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de culture embryonnaire KSOM (5 x 10 mL)</td><td>Réactif</td><td>Specialty Media</td><td>MR-020P-5F</td><td></td></tr><tr><td>Pipette buccale</td><td>Outil</td><td></td><td></td><td>Obtenue à partir de capillaires en verre tirés et fixée à un tube en caoutchouc</td></tr><tr><td>Boîte de maintien des ovocytes</td><td>Outil</td><td></td><td></td><td>Récipient en verre avec des alvéoles concaves</td></tr></tbody></table>

récupération des ovocytes de souris

Retrieval of Mouse Oocytes

À ce jour, seules quelques études ont rapporté des manipulations de succès de l&#39;embryogenèse Peromyscus ou biologie reproductive. En collaboration avec le Centre de Peromyscus stock génétique (http://stkctr.biol.sc.edu), nous caractérisons les différences saillantes nécessaires pour développer ce système. Un premier objectif a été d&#39;optimiser ovocyte / récupération précoce de l&#39;embryon.

Ce protocole illustre la technique d&#39;extraction ou d&#39;ovocytes à un stade précoce des embryons fertilisés de l&#39;oviducte de la souris. La capacité à identifier les infindibulum et insérer une aiguille extrémité émoussée en elle est essentielle à l&#39;exécution correcte de la procédure.

Récupération des ovocytes de souris

À ce jour, seules quelques études ont fait état de manipulations réussies de l'embryogenèse ou de la biologie reproductive de Peromyscus. Avec le Peromyscus...

Je m'appelle Amanda dli. Je viens du laboratoire du Dr Paul Verana à l'Université de Californie à Irvine. Aujourd'hui, je vais vous montrer la procédure de prélèvement des ovocytes.Cela consiste à isoler le videx de la femelle. Une fois les ovex isolés, nous injecterons un milieu FHM à travers le videx, puis les cytes devraient sortir de l'utérus. Une fois cette étape terminée, nous isolerons les cytes dans le milieu et utiliserons ceux-ci pour des expériences futures.Ce que vous pourriez vouloir utiliser cette procédure pour, en plus de l'isolement des cytes, est l'isolement d'embryons à des points temporels spécifiques. Une raison pour laquelle vous souhaiteriez voir cette procédure en format vidéo est que les différentes parties de l'oviducte peuvent être très difficiles à reconnaître. Dans cette vidéo, je vais indiquer l'infundibulum, où vous allez injecter le milieu FHM.Les outils de dissection que vous utiliserez sont deux paires de pinces fines et une paire de ciseaux pointus. Les ovaires prélevés chez la femelle seront placés dans du milieu FHM, contenu dans une boîte de culture tissulaire de 35 millimètres. Les œufs seront récupérés à l’aide d’une aiguille de 30 millimètre

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Biologie

Les ovocytes sont sujettes à une aneuploïdie raison d'erreurs dans la ségrégation des chromosomes lors de la maturation méiotique. Oeufs aneuploïdes peut causer l'infertilité, fausses couches ou des troubles du développement tels que le syndrome de Down. Ici, nous décrivons les méthodes pour introduire des matériaux de choix dans des ovocytes et des méthodes pour étudier la maturation méiotique et évaluer ploïdie.

Évaluation microinjection des ovocytes de souris, la maturation et de ploïdie

Cette vidéo décrit l’isolement d’ovocytes antraux à partir d’ovaires de souris fraîchement récoltés. Ces ovocytes antraux peuvent être utilisés pour d’autres études de caractérisation et de développement.

Isolement d’ovocytes antraux de souris : une méthode pour isoler des ovocytes antraux à partir d’ovaires de souris fraîchement récoltés

Ici, nous présentons un protocole de l'épuisement de l'ARNm de siRNA médiation spécifique suivie d'une analyse d'immunofluorescence pour évaluer l'assemblage du fuseau méiotique et de l'organisation dans des ovocytes de souris. Ce protocole est approprié pour l'appauvrissement de produits de transcription in vitro et l'évaluation fonctionnelle de broche différents et / ou des facteurs de MTOC associée dans les ovocytes.

Meiotic évaluation de la broche dans la souris ovocytes par silençage siRNA médiation

Nous présentons ici un protocole pour la caractérisation des ovocytes de souris antraux basés sur une organisation nucléolaire.

Isolement et caractérisation de souris Antral ovocytes Basé sur Nucleolar Organisation chromatine

L’ovogenèse chez les mammifères est connu pour être source d’erreurs, notamment en raison de missegregation de chromosome. Ce manuscrit décrit des méthodes de préparation de la chromatine se propager de la prophase de la souris, métaphase I et II-mise en scène des ovocytes. Ces techniques fondamentales permettent l’étude des protéines liées à la chromatine et la morphologie des chromosomes tout au long de l’ovogenèse chez les mammifères.

La chromatine propager des préparations pour l’analyse de Progression d’ovocyte de souris de la Prophase à la métaphase II

Un protocole optimisé est présenté qui permet l’épuisement des centres d’organisation des microtubules cytoplasmiques dans les ovocytes de souris au cours de la métaphase I à l’aide d’un laser femtoseconde proche infrarouge.

Ablation laser multiphotonique de centres organisateurs de microtubules cytoplasmiques dans les ovocytes de souris

L’erreur dans la ségrégation chromosomique est une caractéristique commune dans les ovocytes. Par conséquent, l’étude du point de contrôle de l’assemblage de la broche donne des indices importants sur les mécanismes nécessaires pour produire des œufs sains. Le présent protocole décrit trois essais complémentaires pour évaluer l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris.

Évaluation de l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris

Ce protocole fournit un cadre expérimental pour documenter l’impact physique du cytosquelette sur la forme nucléaire et les organites internes sans membrane dans le système ovocytaire de la souris. Le cadre peut être adapté pour être utilisé dans d’autres types de cellules et contextes.

Capture de l’agitation basée sur le cytosquelette du noyau de l’ovocyte de souris à travers les échelles spatiales

Ce protocole décrit les procédures de maturation in vitro des ovocytes de souris, la fécondation in vitro et la culture embryonnaire subséquente jusqu’au stade de blastocyste.

Maturation in vitro des ovocytes de souris, fécondation et culture des embryons préimplantatoires

Le rôle principal de l’ovaire est de générer des ovules viables, qui peuvent être évalués selon leur capacité à subir la fécondation et à soutenir le développement embryonnaire avant l’implantation.

Récupération des embryons de souris préimplantés à partir de l’oviduc et de l’utérus

Apprenez à récupérer les ovocytes et embryons chez Peromyscus en injectant le média FHM dans l'infundibulum de l'oviducte. Cette méthode optimise l'isolement cellulaire pour les études d'expression génique et la recherche transgénique.

Récupération des ovocytes de souris

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