Réponses Analyse des souris neurones sensoriels olfactifs Utilisation de l'enregistrement Electroolfactogram Air-phase

Une préparation d’épithélium olfactif est montée sur un plat et placée dans un courant d’air humidifié. Sous un microscope à dissection, une électrode de référence est connectée électriquement au tissu par le biais d’une solution tampon. Une électrode enregistreuse est placée à la surface de l’épithélium olfactif.

L’épithélium olfactif est stimulé par des bouffées d’odorisant contrôlées par ordinateur administrées dans un flux d’air humidifié, qui transporte les odorants vers l’épithélium olfactif. Les signaux EOG sont transmis à l’ordinateur d’enregistrement par l’intermédiaire d’un amplificateur et d’un numériseur. Bonjour, je suis Catherine Ciar du Laboratoire d’hygiène XO du Département de biologie de l’Université Johns Hopkins.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’enregistrement du gramme électro-olf facto de souris. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les réponses des neurones sensoriels olfactifs aux odeurs. Alors commençons.

L’appareil d’enregistrement se compose d’une électrode d’enregistrement, d’une électrode de référence, d’un tube de distribution d’air, d’une platine d’échantillon et d’un microscope de dissection, le tout ancré sur une table d’air à l’intérieur d’une cage de Faraday. Des manipulateurs Microm sont utilisés pour placer les électrodes dans le tube de distribution d’air. Un flux d’air continu est fait circuler dans de l’eau distillée pour ajouter de l’humidité avant de passer à travers le tube de distribution d’air et sur l’échantillon.

Une boîte de culture de 60 millimètres remplie de sard à adapter de six à huit millimètres est utilisée comme surface de montage pour l’échantillon. Un puits et un canal sont creusés dans la garde dans le plat de montage. Fournir un moyen de connecter électriquement l’électrode de référence à l’échantillon via une solution de sonnerie modifiée.

Les électrodes d’enregistrement et de référence sont connectées à un amplificateur. Les signaux de l’amplificateur sont envoyés à un numériseur, puis à un ordinateur. Le logiciel XI Graph est utilisé pour contrôler le protocole de stimulation, enregistrer le signal et analyser les réponses.

Un oscilloscope est connecté après l’amplificateur pour un suivi en temps réel du potentiel électrique tout en plaçant l’électrode d’enregistrement. Et lors des enregistrements EOG. La distribution des stimuli odorants est contrôlée par un pico spritzer, qui est connecté au même ordinateur que celui utilisé pour l’acquisition du signal juste avant de délivrer un stimulus odorant.

La sortie du pico spritzer est connectée à une bouteille d’odorisant contenant un odorisant liquide. La bouteille est ensuite connectée au tube de distribution d’air. Voyons maintenant comment préparer des électrodes pour l’enregistrement d’expériences.

L’électrode d’enregistrement est un fil de chlorure d’argent dans un capillaire en verre tiré rempli d’une solution de sonnerie modifiée. L’électrode de référence est un fil de chlorure d’argent. Commencez la préparation des deux électrodes en installant un fil d’argent dans le porte-électrode.

Pour l’électrode d’enregistrement, un à deux centimètres de fil doivent dépasser de l’extrémité du porte-électrode. Il est possible de laisser plus de fil pour l’électrode de référence. Pour ajouter le revêtement de chlorure d’argent, positionnez le fil dans du chlorure de sodium 0,1 molaire et connectez le porte-électrode à la borne positive d’une source d’alimentation CC de 1,5 à neuf volts.

La borne négative de la source d’alimentation doit être connectée électriquement à la solution de chlorure de sodium à 0,1 molaire. Laissez le chlorure en réaction agir pendant 10 minutes pour égaliser toute charge statique entre l’enregistrement et l’électrode de référence. Touchez brièvement les électrodes ensemble avant de les installer sur l’appareil d’enregistrement.

Ensuite, tirez un capillaire en verre à l’aide d’un extracteur de micro-pipette. L’ouverture à l’extrémité du capillaire doit avoir un diamètre d’environ cinq à 10 microns. Utilisez un crayon diamant pour marquer et casser l’extrémité émoussée du capillaire afin qu’elle soit environ deux centimètres plus longue que le fil d’argent.

Utilisez une torche au butane pour polir l’extrémité coupée, faites fondre maintenant 0,5 % d’agros dans une solution de sonnerie modifiée. À l’aide d’une pipette de transfert, tirez une petite quantité de solution agricole fondue dans l’extrémité de l’électrode à l’aide d’une seringue chauffée et tirée pour avoir une extrémité longue et mince. Remplissez le capillaire tiré à environ la moitié du chemin.

Avec une solution de sonnerie modifiée, agitez doucement le capillaire pour déloger les bulles d’air. Conservez l’électrode remplie dans le bocal de stockage avec une petite quantité de solution de sonnerie modifiée dans le fond jusqu’au moment de l’utiliser. Une fois qu’un échantillon de tissu est préparé et prêt pour l’enregistrement, installez un capillaire rempli sur le fil de l’électrode d’enregistrement avec les électrodes prêtes.

Examinons une expérience d’enregistrement pour commencer à préparer les tissus pour l’enregistrement. Retirez la peau recouvrant le crâne d’une souris sacrifiée et coupez la tête en deux le long de la ligne médiane, montez la moitié de la tête, côté médian vers le haut sur le plat de montage. Retirez délicatement le septum pour exposer les cornets.

Placez le plat avec le mouchoir monté sur la platine d’enregistrement. Alignez la platine de manière à ce que l’emplacement d’enregistrement sur les cornets soit centré sous le microscope. Allumez maintenant le réservoir d’air pour fournir de l’air humidifié à environ 600 millilitres par minute à la surface du cornet.

Positionnez le tube de distribution d’air de manière à ce qu’il soit à environ 10 millimètres de l’emplacement d’enregistrement. Réglez l’amplificateur en mode DC car l’amplification AC induira des artefacts dans le signal EOG. Acquisition avec un filtre passe-bas d’un kilohertz et un gain de 100 x.

Montez maintenant les électrodes d’enregistrement et de référence sur les micromanipulateurs. Abaissez l’électrode de référence dans le puits de la parabole de montage et couvrez-la d’une solution de bague modifiée de sorte qu’elle soit connectée électriquement au tissu. Abaissez avec précaution l’électrode d’enregistrement sur la surface du cornet deux, B ou trois.

L’électrode doit à peine toucher la surface de l’épithélium olfactif. Lorsque l’électrode entre en contact avec l’épithélium, une ligne de base droite apparaît sur l’oscilloscope. Maintenant, fixez une bouteille d’odorisant à l’orifice latéral du tube de distribution d’air de l’ordinateur.

Initier un protocole de stimulation. La fréquence d’échantillonnage pour l’acquisition des données doit être de deux kilohertz ou plus. Le logiciel déclenchera une impulsion d’odeur et commencera l’enregistrement.

Un protocole de stimulation typique peut être une durée de 100 millisecondes, une impulsion unique appariée, des impulsions de 100 millisecondes séparées par un intervalle d’une seconde ou une impulsion soutenue de dix secondes. Pour minimiser l’adaptation, attendez de une à cinq minutes entre les protocoles après avoir délivré des concentrations d’odeurs élevées. L’odeur résiduelle peut rester dans le tube, laver le tube d’air avec de l’éthanol à 95 % et sécher avant de continuer avec des échantillons de tissus supplémentaires.

Le logiciel de greffe Axo fournit des outils pour mesurer les paramètres clés du signal EOG. Ces paramètres comprennent l’amplitude de la réponse, la latence, le temps jusqu’au pic et les constantes de temps de terminaison. Plusieurs paramètres de l’EOG sont particulièrement utiles pour la comparaison des réponses normalisées entre les souris, notamment l’amplitude de la réponse, le temps d’augmentation de la latence, le temps jusqu’au pic et la constante de temps de terminaison.

On voit ici les OG d’une souris en réponse à une stimulation avec des concentrations croissantes d’acétate d’amyle liquide. La ligne noire en haut indique le moment et la durée de la stimulation odorante. Ici, nous voyons une relation dose-réponse moyennée à partir de cinq souris : les barres d’erreur sont des intervalles de confiance de 95 %.

Une diminution de l’amplitude maximale est souvent observée à des concentrations d’odeurs très élevées. Un exemple d’EOG en réponse à une stimulation par impulsion appariée est montré : une seule impulsion courte d’odorant suscite une adaptation qui dure plusieurs secondes. Voici un EOG en réponse à 10 secondes de stimulation odorante soutenue.

L’EOG montre une désensibilisation lors de la présentation continue d’un odorant. Nous venons de vous montrer comment enregistrer le facteur d’électrode gramme de souris. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de placer l’électrode juste à la surface de l’épithélium et de ne pas pénétrer l’électrode sous la surface.

Enregistrez toujours du même côté de la tête et évitez de modifier la configuration pour minimiser les variations, gardez le tissu humide, mais sans collecter de gouttelettes de liquide, mettre le tissu sous l’air humidifié immédiatement après la dissection maintiendra le tissu dans le meilleur état pour l’enregistrement. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.