L'isolement et l'enrichissement des cellules de rat souches mésenchymateuses (CSM) et de séparation des mono-colonie Dérivé MSC

Les cellules souches mésenchymateuses, abrégées en MSCs, sont isolées à partir d'un rat femelle âgé de six à huit semaines et cultivées dans une boîte de Pétri de 10 centimètres jusqu'à ce qu'elles atteignent environ 80 % de confluence. Pour enrichir les MSCs, les cellules sont marquées par des anticorps primaires conjugués à la biotine, suivis de microbilles magnétiques conjuguées à la streptavidine. Les cellules marquées sont ensuite séparées en deux fractions, la fraction négative et la fraction positive, par tri cellulaire activé par magnétisme.

Ensuite, l'analyse par cytométrie en flux est utilisée pour confirmer l'expression des marqueurs de surface. Enfin, des cylindres de clonage sont utilisés pour obtenir des CSM dérivées de colonies uniques. Bonjour, je suis Lee du laboratoire de Christina Chang du Département de génie chimique et des sciences des matériaux de l'Université d'État du Michigan.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'isolement et d'enrichissement de cellules souches chy, ainsi que d'obtention de cellules issues d'une colonie unique. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les comportements de prolifération et de différenciation des cellules souches rouges. Commençons donc.

Des cellules souches mésenchymateuses, ou CSM, seront isolées à partir d'un rat femelle Sprague-Dawley âgé de six à huit semaines. Pour commencer cette procédure, sectionnez les fémurs et les tibias des membres postérieurs de l'animal euthanasié. Retirez la peau et les muscles, placez les fémurs et tibias disséqués dans de l'isopropanol à 70 % pendant quelques secondes, puis transférez-les dans un X-D-P-B-S.

Les étapes suivantes doivent être effectuées dans une hotte de sécurité biologique. Tout d'abord, transférez le fémur et le tibia dans une boîte de 10 centimètres contenant du DMEM. Ensuite, tout en tenant chaque os avec des pinces, coupez les deux extrémités avec des ciseaux.

Fixez une aiguille de calibre 22 à une seringue de trois millilitres et remplissez-la de DMEM. Insérez l'aiguille dans une extrémité ouverte de l'os et rincez la moelle dans un tube de 50 millilitres. Répétez deux à trois fois pour chaque os, une fois toute la moelle obtenue.

Resuspendre les cellules, puis faire passer la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire de 70 micromètres afin d’éliminer les débris osseux et les agrégats sanguins. Centrifuger les cellules à 200 ×g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir éliminé le surnageant par aspiration, resuspendre les cellules dans 25 millilitres de milieu de culture pour MSC.

10 millilitres de suspension cellulaire dans chacune de deux boîtes de culture de 10 centimètres. Incuber les boîtes de culture dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une à deux semaines. Une fois que les CSM de rat précédemment isolées atteignent une confluence d'environ 80 %, aspirer le milieu et ajouter quatre à cinq millilitres de trypsine-EDTA à chaque boîte.

Remettez les boîtes au thermostat et incubez pendant environ cinq minutes. Pour permettre le détachement des cellules, ajoutez une quantité égale de milieu de culture afin d'inactiver la trypsine. Récupérez les suspensions cellulaires dans un tube de 15 millilitres et centrifugez les cellules à 200 ×g, à 4 °C, pendant cinq minutes.

Nous allons maintenant démontrer l'enrichissement des CSM à l'aide de deux marqueurs d'expression membranaire, CD54 et CD90. En utilisant l'aimant de séparation cellulaire BD I de BD Biosciences, commencez par resuspendre le culot cellulaire dans un tampon de marquage des cellules à raison de 20 millions de cellules par millilitre.

Ensuite, ajoutez un anticorps biotinylé CD 54 et un anticorps biotinylé CD 90 à la suspension cellulaire et mélangez délicatement. Après une incubation sur glace pendant 15 minutes, lavez les cellules marquées avec un volume excédentaire de tampon BD IMAG 1X. Centrifugez les cellules marquées à 200 ×g à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes. Préparez les particules BD IMAG streptavidine en vortexant soigneusement, puis ajoutez 40 microlitres de particules pour chaque 10 millions de cellules.

Mélanger soigneusement les particules avec les cellules marquées et incuber les cellules à six à 12 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pendant cette période d'incubation, étiqueter un tube à essai conique pour recueillir la fraction positive. Une fois l'incubation terminée, ajuster le volume de marquage à 20 millions de cellules par millilitre.

Avec un tampon Expedia I mag. Transférez les cellules marquées dans le tube de collecte de la fraction positive. Placez le tube de la fraction positive sur l'aimant BDI et laissez-le reposer pendant six minutes.

Ensuite, avec le tube de la fraction positive toujours sur l'aimant BDI, retirez le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre. Ensuite, retirez le tube de la fraction positive de l’aimant BDI et placez-le sur de la glace. Ajoutez un millilitre de tampon XBDI mag glacé (1X) et remettez les cellules en suspension par un mélange doux.

Replacer le tube sur l'aimant BDI et laisser agir pendant deux à quatre minutes. Éliminer le surnageant à l’aide d’une nouvelle pipette Pasteur en verre. Répéter le lavage comme décrit précédemment.

Encore une fois. Enfin, retirez le surnageant à l’aide d’une nouvelle pipette Pasteur en verre. Puis retirez le tube de l’aimant BDI reus.

Suspendre les cellules dans un millilitre de milieu de culture et transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres contenant 25 millilitres de milieu de préculture. 1 flacon de 75 centimètres carrés pour le maintien des cellules. Et une boîte de 10 centimètres pour la cytométrie en flux.

Pour commencer la procédure de séparation des MSCs issues de colonies uniques, ensemencer les cellules à raison d'environ 50 à 100 cellules par boîte de 10 centimètres et incuber dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une à deux semaines. Pendant cette période d'une à deux semaines, examiner les colonies bien isolées à l'aide d'un microscope inversé. Une fois que les colonies ont atteint une taille suffisante, soit plus de 100 cellules par colonie, marquer les colonies à l'aide d'un feutre indélébile sur le fond de la boîte.

Lors du choix d'une colonie à marquer, veillez à ce qu'il n'y ait aucune colonie avoisinante à proximité. Aspirez le milieu et rincez la boîte une fois avec un X-D-P-B-S à l'aide de pinces. Prenez un cylindre de clonage stérile et placez-le délicatement autour de la colonie marquée.

Répétez cette étape jusqu’à ce que chaque colonie marquée soit recouverte par un cylindre de clonage. Ajoutez 100 microlitres de tripsine EDTA dans chaque cylindre de clonage et replacez la boîte dans l’incubateur. Au bout de cinq minutes, examinez les cellules au microscope pour vérifier si elles s’arrondissent.

Lorsque les cellules se sont détachées, ajouter une quantité égale de milieu de culture pour inactiver la trypsine. Mélanger la suspension cellulaire à l’aide d’une micropipette de 200 microlitres et transférer la suspension cellulaire dans une boîte de 60 millimètres contenant trois millilitres de milieu de culture préchauffé. Étiqueter les boîtes et les remettre dans l’incubateur Bader, après leur isolement sur plastique adhérent.

Les CSM doivent être visibles le lendemain de leur mise en culture. Au fur et à mesure que les cellules continuent de proliférer, les cellules confluentes doivent présenter l'aspect des cellules montrées sur cette image en contraste de phase, où la majorité ont une morphologie en fuseau ou en étoile. La culture est appropriée lorsque les cellules atteignent environ 80 % de confluence.

Après la trypsination, les cellules détachées doivent apparaître rondes et flottantes dans le milieu. Une fois les CMM enrichies par tri cellulaire magnétique, la cytométrie en flux est réalisée afin de vérifier l'expression des marqueurs de surface. Si l'enrichissement est bon, les cellules doivent présenter une coloration positive pour les marqueurs des CMM, CD 54 et CD 90, mais négative pour le marqueur des CSH, CD 45 ; les contrôles d'isotype IgG deux A et IgG un sont utilisés comme contrôles négatifs.

Lorsque les cellules sont ensemencées à une densité clonale appropriée, des colonies doivent se former à partir de cellules individuelles, comme illustré dans cet exemple. Des cylindres de clonage peuvent alors être utilisés pour séparer les colonies, et les cellules issues de ces colonies peuvent être cultivées séparément. Dans ces deux exemples, les cellules provenant d'une colonie sont allongées, tandis que les cellules provenant d'une autre colonie sont rondes.

Ainsi, nous vous avons montré comment isoler et enrichir des cellules souches aléatoires et communes, ainsi que comment obtenir des cellules issues de colonies uniques. Lors de cette procédure, il est important de veiller à éliminer les caillots sanguins et les débris osseux durant l'isolement. Utilisez la quantité optimale d'anticorps lors de l'enrichissement et marquez soigneusement les colonies bien isolées durant la séparation des colonies.

Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.