Expression de protéines recombinantes dans le levure méthylotrophe

Le protocole suivant décrit l'expression protéique à l'aide de la levure méthylotrophe opus. Nous détaillons la préparation de cellules de levure électrocompétentes et la transformation du vecteur contenant le gène d'intérêt dans les PPA, suivie d'une étape de purification de l'ADN de levure afin de vérifier l'intégration correcte du gène d'intérêt dans le génome de la levure. Enfin, nous procéderons à l'expression de la protéine recombinante.

Bonjour, je suis Maria du laboratoire de Steven Hallam au Département de microbiologie et d'immunologie de l'Université de la Colombie-Britannique. Je suis Marcus, également du laboratoire Helm. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d'exprimer des protéines recombinantes dans la levure TRO PQ.Past stories.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier des protéines provenant de micro-organismes non cédés, à partir desquels l'ADN environnemental a été extrait, archivé et utilisé pour construire des bibliothèques méta-atomiques. Commençons donc. L'expression de protéines recombinantes dans la levure méthylotrophe Pichia pastoris nécessite l'insertion de votre gène d'intérêt en phase dans un vecteur donneur PPA.

Dans notre expérience, nous utilisons le vecteur PPIC Z alpha A. Ce vecteur contient le promoteur AO X un pour une expression induite par le méthanol strictement régulée du gène d'intérêt, le signal de sécrétion du facteur alpha pour la sécrétion de la protéine recombinante, les gènes zaas et de résistance pour la sélection dans E. coli et Pichia, ainsi qu'un peptide C-terminal contenant un épitope acémique et une étiquette polyhistidine permettant la détection et la purification de la protéine recombinante. Avant la transformation, linéarisez le vecteur contenant votre gène d'intérêt par digestion de restriction. Nous utilisons l'enzyme PME un, mais d'autres sites de restriction sont possibles à condition que votre insert ne contienne pas ce site de restriction.

Pour obtenir une quantité suffisante d'ADN vectoriel linéarisé, préparez trois à quatre réactions de restriction de 50 microlitres chacune dans des tubes séparés ; après la digestion, réunissez toutes les solutions et concentrez votre construit. À l’aide d’un filtre centrifuge AmCon et d’un filtre centrifuge MicroCon, vous aurez besoin de cinq à vingt microgrammes d’ADN linéarisé dans cinq à dix microlitres d’eau stérile pour la transformation de PPA dous. Pour préparer des cellules électrocompétentes de PPA dous, étalez les cellules sur une plaque A-Y-P-D-S sans SN quatre jours avant la transformation prévue, puis incubez à 30 degrés Celsius pendant un à deux jours, ou jusqu’à formation de colonies isolées, deux jours avant la transformation.

Incuber cinq millilitres du PPA ou de la souche en milieu YPD dans un tube Falcon de 50 millilitres à 30 degrés Celsius pendant la nuit. Placer le tube Falcon dans un flacon pour le fixer sur l'agitateleur un jour avant la transformation. Utiliser 0,25 millilitre de la culture de nuit pour ensemencer 500 millilitres de milieu YPD frais dans un flacon de deux litres.

Faire croître à nouveau pendant la nuit dans un agitateur à 30 degrés Celsius jusqu'à une DO 600 de 1,3 à 1,5. Le jour de la transformation, prévoir de la glace, de l'eau stérile froide et du sorbitol à une molaire. Centrifuger les cellules à 1500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, nous suspendons le culot dans 500 millilitres d'eau stérile, froide et glacée. Selon la capacité des tubes de centrifugation, vous devrez peut-être diviser le volume en deux tubes distincts ou effectuer plusieurs centrifugations. Centrifuger à nouveau les cellules et resuspendre le culot dans 250 millilitres d'eau stérile, froide et glacée.

En fonction de la capacité des tubes de centrifugation, vous pouvez combiner les culots cellulaires séparés dans un seul tube. Lors de la reprise du culot par centrifugation, redisperser cette fois-ci le culot. Dans 20 millilitres de sorbitol glacé à une molaire, transférer les cellules remises en suspension dans un tube Falcon de 50 millilitres et centrifuger.

Après une dernière centrifugation, resuspendre le culot dans un millilitre de sorbitol à une molaire, glacé, pour un volume final d'environ 1,5 millilitre. Conserver les cellules resuspendues dans des tubes de microcentrifugeuse sur de la glace ou à quatre degrés Celsius jusqu'à leur utilisation pour la transformation. Avant la transformation du vecteur linéarisé concentré dans des cellules PPA stor, préparer les réactifs et dispositifs suivants.

Remplir un tube de microcentrifugeuse avec un millilitre de sorbitol un molaire et le placer sur de la glace. Placer une cuvette d'électroporation de 0,2 centimètre sur la glace.

Étiquetez un tube en verre stérile de 15 millilitres et tenez prêt un tube en verre stérile avec une pipette pasteur. Transférez 80 microlitres des cellules électrocompétentes préparées précédemment dans la cuvette d'électroporation de 0,2 centimètre, préalablement refroidie sur glace.

Ajouter la solution d'ADN plasmatique aux cellules et mélanger en déplaçant la pointe de la pipette de côté à côté. Dans le vete d'électroporation. Incuber le vete avec les cellules sur de la glace pendant cinq minutes.

Ensuite, essuyez l'extérieur du tube avec le tissu et électropulsez les cellules selon les paramètres recommandés pour la levure bourgeonnante par le fabricant de votre dispositif spécifique d'électroporation. Un BioRad Gene Pulser est utilisé lors de cette démonstration avec les conditions suivantes : une tension de charge de 1500 volts, une capacité de 25 microfarads et une résistance de 200 ohms immédiatement après l'impulsion.

Ajoutez un millilitre de sorbitol glacé à une molarité de un molaire au vét. Transférez le contenu du vét dans un tube stérile de 15 millilitres à l’aide d’une pipette en verre stérile. Incubez le tube à 30 degrés Celsius sans agitation pendant 1,5 heure.

Après 1,5 heure, les cellules électroporées sont prêtes à être ensemencées. Ajoutez cinq à dix billes de verre stérilisées à chacune des quatre plaques YPTS étiquetées contenant 100 microgrammes par millilitre de Zain. Étalez 250 microlitres de l'électroporation.

Mélanger sur chaque plaque et agiter la plaque horizontalement pour répartir uniformément les cellules. Laisser sécher les plaques pendant 15 minutes, puis retirer les billes de l'agro en retournant les plaques. Envelopper les plaques dans un plastique noir afin d'éviter la dégradation du Zain sensible à la lumière et incuber les plaques retournées pendant deux à trois jours à 30 degrés Celsius jusqu'à formation des colonies, une fois les colonies formées.

Prélevez 12 colonies. Purifiez-les en étalant les clones sur des géloses YPDS fraîches contenant 100 microgrammes par millilitre de zéine. Pour préparer les cellules PPA en vue de l'expression protéique, prélèvez une colonie unique parmi les colonies de Pichia purifiées et inoculez-les dans 25 millilitres de milieu VMGY contenu dans un flacon stérile de 250 millilitres ; faites croître la culture à 30 degrés Celsius dans un incubateur agité jusqu'à ce que la culture atteigne une DO 600 comprise entre deux et six.

Lorsque les cellules ont atteint la DO 600 appropriée, préparez un stock de glycérol des cellules pour stockage. Transférez 800 microlitres de la culture cellulaire dans un flacon cryogénique de deux millilitres et ajoutez 200 microlitres de glycérol stérilisé. Conservez le stock de glycérol à moins 80 degrés Celsius.

En outre, transférez 1,5 millilitre de la culture cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse. Récupérez les cellules par centrifugation à 1300 ×g pendant une minute à température ambiante. Conservez le culot à quatre degrés Celsius.

Ces cellules seront utilisées pour la purification de l'ADN de levure afin d'analyser les pichias après PCR avec des amorces spécifiques de l'insert sur un gel agarose afin de confirmer que le gène d'intérêt s'est intégré dans le génome de pichia. Transférez le reste de la culture de 25 millilitres dans un tube Falcon de 50 millilitres et récoltez les cellules par centrifugation à 3000 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Décanter le surnageant et placer le tube à l'envers sur un morceau de papier absorbant pour éliminer tout milieu résiduel, puis laver le culot cellulaire. Suspendre le culot par vortexage ou en pipetant de haut en bas dans 20 millilitres de milieu BMMY et centrifuger.

Ressuspendre à nouveau la suspension cellulaire après décantation, le surnageant, en vortexant ou en pipetant plusieurs fois, jusqu'à une DO 600 de 1,0 dans du BMMY. Milieu destiné à induire l'expression. Transférer la culture dans un flacon de un litre muni de voiles et couvrir le flacon avec un embout de 200 millilitres.

Nous recommandons vivement l'utilisation de flacons à chicanes, car ils introduisent plus d'oxygène dans la culture. Pour une expression protéique efficace durant l'induction par le méthanol, incubez le flacon dans l'incubateur afin de poursuivre la croissance à 30 degrés Celsius. Il est important que la température n'excède pas 30 degrés Celsius si la température de votre incubateur varie.

Régler la température à 28 degrés Celsius. Ajouter du méthanol pur stérilisé à une concentration finale de 0,5 % de méthanol toutes les 24 heures afin de maintenir l'induction. À certains moments précis après le début de l'expression, prélever un millilitre de la culture et le transférer dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre, puis centrifuger à 1300 Gs pendant 2,5 minutes. À température ambiante, transférer le surnageant dans un autre tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Conserver le surnageant et les culots cellulaires à moins 80 degrés Celsius jusqu'à une analyse ultérieure. Les échantillons provenant de différents points temporels seront analysés afin de déterminer la période optimale d'expression protéique après induction. Nous présentons maintenant quelques résultats représentatifs d'une expression réussie de protéines recombinantes en utilisant PIA Pastis comme système hôte.

Cette image de western blot montre quatre protéines exprimées après 24 heures d'expression. L'anticorps utilisé pour le immunoblotting était un anticorps HRP acémique. La deuxième voie est un témoin négatif et contient le surnageant provenant de cellules n'exprimant pas de protéine recombinante car elles ont été transformées avec le vecteur parent.

Nous venons de vous montrer comment exprimer des protéines recombinantes à l’aide de l’hôte eucaryote PQ.Plus. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de faire séquencer votre construction afin de confirmer que votre gène d’intérêt est cloné et en phase, et de disposer de toutes vos plaques et réactifs prêts avant de commencer. Il est également essentiel de préparer une quantité suffisante de plasmide linéarisé pour obtenir un grand nombre de transformants avant l’expression protéique par induction au méthanol. Veillez à bien laver vos cellules pour éliminer toute trace de glycérol susceptible d’inhiber l’expression de votre protéine.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec les expériences.