La fertilisation des Ovocytes de Xenopus En utilisant la méthode de transfert d'hôte

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des embryons en développement issus de sites OO ayant été manipulés en culture. Cela est réalisé en isolant d'abord les sites donneurs OO d'une femelle, puis en les manipulant selon les besoins en culture. La deuxième étape de la procédure consiste à stimuler la maturation de ces cytes à l'aide de progestérone et à injecter des femelles hôtes potentielles avec une gonadotrophine afin de stimuler la ponte d'œufs.

La troisième étape de la procédure consiste à colorer les cytes donneurs avec des colorants vitaux et à préparer une femelle afin qu'elle serve d'hôte. La dernière étape de la procédure consiste à transférer chirurgicalement les cytes donneurs dans la cavité corporelle de l'hôte, puis à récupérer plusieurs heures plus tard les œufs transférés et à les féconder. En fin de compte, des embryons se divisant normalement proviennent des cytes donneurs ayant subi une manipulation expérimentale.

Les cytes peuvent être obtenus et analysés comme des embryons normaux. Bonjour, je suis Doug Houston, de l'Université de l'Iowa. Aujourd'hui, nous sommes au cours Xap de Cold Spring Harbor pour vous montrer comment réaliser la procédure de transfert d'hôte.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les rôles des produits génétiques maternels et déterminer leurs fonctions dans le développement précoce de l'embryon. Commençons donc. Avant de commencer la chirurgie, assurez-vous que la zone opératoire est désinfectée et que les milieux frais et les outils stériles sont prêts.

Saisir une aiguille de suture avec le porte-aiguille dans l'orientation souhaitée. Placer une grenouille femelle anesthésiée sur le dos sur une compresse chirurgicale humide. À l’aide de petits ciseaux à iris, pratiquer une incision d’un centimètre dans la peau de la partie inférieure de l’abdomen, latéralement par rapport à la ligne médiane.

Ne coupez pas dans le muscle abdominal. Utilisez une pince pour soulever la couche musculaire et la fascia de couleur blanche qui l'entoure. Utilisez des ciseaux à iridectomie pour effectuer une seule incision rapide et droite à travers le muscle.

Étendre l'incision sur un centimètre afin d'exposer l'ovaire. Utiliser une pince pour saisir l'ovaire et extraire un lobe. Utiliser des ciseaux pour couper le lobe au niveau de la paroi corporelle.

Placer le tissu dans une boîte de 90 millimètres contenant du milieu de culture d'ovocytes ou OCM, puis évaluer immédiatement la qualité de l'ovaire au microscope stéréoscopique. Quelques cytes peuvent être défoliés à l’aide de pinces. Si les cytes sont fermes et de taille et de couleur uniformes, prélever la quantité souhaitée de tissu ovarien de la grenouille et la placer dans une boîte de Petri de 90 millimètres contenant de l’OCM.

Fermer l'incision. Insérer l'aiguille à quelques millimètres sur le côté de l'incision, en veillant à traverser à la fois le muscle et l'aponévrose. Utiliser une pince pour manipuler l'aiguille, en prenant soin de ne pas tirer complètement le brin de suture à travers.

Fermer la plaie à l’aide d’un point simple interrompu et de nœuds carrés de chirurgien. La technique est décrite en détail dans le texte accompagnant. Répéter la suture sur la couche cutanée.

Rincez la femelle avec de l'eau déionisée et placez-la dans un seau de récupération rempli d'eau fraîche. Immédiatement après la fin de la chirurgie, utilisez des ciseaux pour subdiviser l'ovaire. Ouvrez les lobes individuels, aplatissez-les et découpez-les en morceaux carrés de deux centimètres de côté.

Rincez avec du milieu propre et utilisez une pince. Transférez cinq à six morceaux dans une nouvelle boîte de 90 millimètres contenant du milieu OCM afin d'isoler des cytes individuels. Commencez par transférer un des morceaux dans une petite boîte contenant du milieu et placez-la sous microscope stéréoscopique.

Utilisez une pince de bijoutier pour prélever manuellement entre trois et 500 ovocytes. Saisissez la couche de tissu conjonctif entourant un ovocyte au stade six pleinement développé près du stock avec une deuxième paire de pinces. Saisissez l'ovaire adjacent à l'ovocyte avec la première paire de pinces.

Tirez délicatement sur l'oocyte pour déchirer la couche folliculaire. Extrayez doucement l'ocyte du tissu avec succès. Les oocytes défolliculés n'ont pas de vaisseaux sanguins visibles et sont plus mous que les oocytes dotés de follicules intacts.

Utilisez une pipette munie d’un coton et polie à la flamme pour transférer des groupes de 100 à 150 cytes dans des boîtes de culture de 60 millimètres contenant huit millilitres de milieu COO. Conservez les ovocytes dans leurs boîtes à 18 degrés Celsius. Les ovocytes peuvent désormais être micro-injectés selon les besoins avec des oligonucléotides antisens ou des ARNm selon divers protocoles, puis cultivés dans le milieu COO dans un incubateur à 18 degrés Celsius.

Utilisez les ovocytes pour le transfert dans les 96 heures suivant leur isolement, le soir précédant la réalisation du transfert. Incubez les cytes nécessaires avec de la progestérone afin de les faire mûrir, en ajoutant 16 microlitres d'une solution de progestérone à un millimolaire au milieu contenant les cytes, pour obtenir une concentration finale de deux micromoles. Incubez pendant 10 à 12 heures à 18 degrés Celsius le même soir, et injectez à trois à cinq femelles 1000 unités de gonadotrophine chorionique humaine par grenouille pour induire la ponte.

Laisser les femelles à température ambiante ou à 18 degrés Celsius pendant la nuit, le matin du transfert. Vérifier au microscope stéréoscopique que les cytes cultivés ont subi la maturation. Ajouter les colorants vitaux et centrifuger à plus de 10 000 G pendant cinq minutes.

Pour réduire le fond provenant des débris, ajoutez 80 microlitres du colorant vital approprié à chaque groupe expérimental d'ovocytes. Incubez à température ambiante pendant 15 minutes sur un agitateur. Transférez les œufs colorés dans une boîte de 90 millimètres contenant du milieu frais et agitez brièvement pour les rincer.

Préparez une pipette pour le transfert des cellules. Utilisez un crayon diamanté pour marquer une ligne sur votre pipette à environ deux centimètres sous la partie effilée, puis cassez-la nettement. Cela doit produire une pipette d’un diamètre intérieur de 1,5 millimètre, suffisamment large pour accueillir un ovocyte feu.

Polissez la pointe jusqu'à ce que les bords soient lisses sans fermer l'extrémité. Transplantation d'ovocyte. La chirurgie doit être effectuée aussi rapidement que possible.

Réalisez une incision comme précédemment chez une femelle anesthésiée pondant des œufs de bonne qualité. Cette incision doit être de longueur minimale, juste suffisante pour accueillir le diamètre interne du transfert. Utilisez une pipette de moins d’un centimètre.

Faire tourner doucement la boîte contenant les ovocytes expérimentaux afin de les regrouper au centre. Utiliser la pipette préparée pour aspirer le plus grand nombre possible d'ovocytes. Laisser les ovocytes sédimenter au fond de la pipette afin de minimiser le volume de liquide transféré à la grenouille.

Utilisez une pince pour saisir et soulever un lambeau de muscle et de fascia. Insérez la pointe de la pipette dans l'incision et laissez lentement les cytes s'écouler dans la cavité corporelle. Répétez le processus jusqu'à ce que tous les ovocytes aient été transférés.

Ne pas relâcher la couche musculaire afin d'éviter que les ovocytes ne s'échappent par l'incision. Utiliser une pince pour saisir les deux côtés de l'incision et les rapprocher, permettant ainsi aux cytes de regagner la cavité corporelle. Commencer à suturer la couche musculaire et la fascia comme précédemment, en veillant à maintenir une tension vers le haut jusqu'à ce que le premier nœud soit fait.

Fermer la peau par points de suture. Rincer la grenouille avec de l'eau déionisée et laisser la reprendre connaissance comme précédemment. La grenouille devrait commencer à pondre des œufs normalement après l'opération, deux à trois heures après la chirurgie.

Récupérez les œufs en effectuant un pressage normal toutes les demi-heures jusqu'à ce que la femelle cesse la ponte, dans une boîte contenant les œufs collectés. Ajoutez quatre millilitres d'une suspension de spermatozoïdes fraîchement collectés dans un XMMR et incubez à température ambiante pendant quatre minutes. Inondez et rincez abondamment les œufs avec de l'eau à température ambiante.

Placer un XMMR pendant une heure à température ambiante pour permettre l'activation et le clivage. Utiliser de la cystéine à tout moment pour éliminer les codes gélatineux. Les embryons transférés peuvent ensuite être triés dans des boîtes distinctes selon leur couleur et cultivés comme des embryons normaux.

Typiquement, plus des deux tiers des œufs transférés s'activent en quelques minutes après la fécondation, montrant une contraction corticale robuste au pôle animal. Dans la plupart des expériences, plus de la moitié des œufs transférés subissent une première division normale. Parfois, la division est retardée d'environ 20 minutes par rapport aux œufs hôtes dans nos conditions expérimentales.

De 30 à 60 % des embryons transférés poursuivent normalement leur gastrulation et survivront au-delà du stade neural. Les embryons transférés conserveront leur couleur de colorant vital pendant plusieurs jours de développement. Les embryons provenant de cellules contrôles non injectées apparaîtront normaux, comme attendu.

En revanche, les embryons issus d'ovocytes injectés avec de la bêta-caténine et des oligonucléotides antisens, par exemple, présenteront un aspect centralisé. Nous venons de vous montrer comment obtenir des embryons à partir de cytes manipulés en culture.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de commencer avec des ovocytes donneurs sains et pleinement développés et d'utiliser des femelles hôtes possédant des ovules de haute qualité. De plus, le succès de la méthode tend à être corrélé à la rapidité avec laquelle vous isolez les ovocytes et effectuez les interventions chirurgicales. Ainsi, il peut être nécessaire de s'entraîner un certain temps avant d'obtenir des résultats reproductibles.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.