Name: Dissection de lorganisateur et explants pôle animal à partir dembryons de Xenopus laevis et de lAssemblée dun test dadhésion cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Découvrez la dissection d'explants de l'organisateur et du pôle animal chez Xenopus laevis et l'assemblage d'un test d'adhésion cellulaire. Cette méthode permet d'étudier le comportement cellulaire en biologie du développement.

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Préparation Chambres d&#39;adhésion (le jour avant l&#39;injection / dissection) Chambres Assay adhésion Si vous avez un microscope composé classique (localise optiques dessus de la scène), il est ncecessary de faire un peu de hauteur de chambre d&#39;adhérence comme suit. Si vous utilisez le microscope inversé-optique, puis &quot;NUNC Lab-Tek lamelle couvre-objet Chambered&quot; peut seulement être utilisée, et de sauter les étapes # 1 - 2. <ol><li> Fixez l&#39;un des «press-to-joint isolant silicone&quot; sur un feuillet de 40 x 24mm couvercle. Pressez fermement l&#39;isolant de la lamelle sur la paillasse propre et regarder de l&#39;autre côté pour s&#39;assurer que l&#39;isolant est totalement attachée sans bulles d&#39;air. </li><li> Optionnel: Mettez les chambres d&#39;adhérence dans un plat en verre de Pétri avec papier filtre Whatman et autoclaver à sec sur le cycle de stérilisation. Les refroidir à température ambiante. </li></ol> Revêtement de la Chambre <ol><li> Mettez une goutte de 200ml Solution de travail de la cadhérine (10mg/ml) ou de la fibronectine (20mg/ml) au centre d&#39;une chambre d&#39;adhérence autoclave, en utilisant sigmacoated pointes jaunes. Incuber à température ambiante pendant 4 heures. </li><li> Sortez la solution cadhérine ou la fibronectine et transférer dans un tube de 1.5ml. Cette solution peut être réutilisée pour les deux prochaines semaines. </li><li> Distribuer 500ml de BSA 4% en 1x MBS-H pour bloquer la chambre. Incuber à température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Aspirer la solution de BSA. Laver la chambre avec 500ml de 1x MBS-H à deux reprises. Après le second lavage, aspirer la plupart des MBS-H (pas complètement), et stocker dans un conteneur scellé à 4 º C. Cette chambre d&#39;adhérence est bonne pour les 2 prochains - 3 jours. </li></ol> Dissection et dissociation des explants Cap animaux <ol><li> Incuber les embryons injectés dans 0,1 x MBS-H, dilués à partir du 1x autoclavé MBS-H, comme non autoclavé moyennes effectue parfois des germes peu qui peuvent perturber les cellules dissociées bouchon d&#39;origine animale. </li><li> Faire 1x Barth agarose plaques et CMF-MBS plaques d&#39;agarose avec des plats de 60mm, au moins autant que le nombre de vos échantillons. Verser autoclavé 1x MBS-H pour les plaques 1x Barth. Pour CMF-MBS assiettes, versez 10 ml de FMC-MBS. </li><li> Lorsque les embryons deviennent étape 8.5, commencez disséquer les calottes animales dans l&#39;assiette une Barth 1x est. 10 à 15 explants par les échantillons sont généralement suffisant pour une expérience. </li><li> Transférer les explants calotte animale à une plaque de FMC-MBS. Incuber les explants pour 45 - 60 minutes jusqu&#39;à ce que les explants sont complètement dissociés. Agitations doux dans toutes les 15 minutes vous aidera à la dissociation. </li></ol> Essai d&#39;adhésion cellulaire <ol><li> Ensemencement des cellules: Distribuer 500ml de 1x MBS-H pour la chambre de l&#39;adhérence préparés dans les étapes dans les sections ci-dessus, les Chambres de dosage adhérence et de revêtement de la Chambre. Transférer les cellules dissociées calotte animale de la plaque de FMC-MBS à la chambre de l&#39;adhérence à l&#39;aide d&#39;un P200 conseils sigmacoated et hachées-off jaune. </li><li> Facultatif: Si possible, soigneusement aspirer la moyenne jusqu&#39;à environ 2 / 3 à mi-chemin, sans exposer les cellules à l&#39;air. Ajouter environ la même quantité de produits frais MBS-H, pour s&#39;assurer que le milieu contient suffisamment de Ca 2 + et Mg 2 +. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 45 à 90 minutes. Vérifiez les cellules à l&#39;occasion de voir si elles sont attachés à la surface du fond. </li><li> Maintenant, vous pouvez prendre la photo des cellules sous un microscope. </li><li> Mettez la chambre de l&#39;adhérence sur une lame de verre de la grille. Aligner l&#39;un des coins de la chambre de l&#39;adhésion à un coin de la diapositive de la grille. Compter et noter le nombre de cellules attachées dans plusieurs grilles différentes. </li><li> Verser 1 litre de MBS-H dans un grand seau en plastique (par exemple, Tupperware, etc.) Sans forcer, insérez la chambre glisser l&#39;adhérence au fond du seau. Faites-la tourner sur le agitateur orbital pendant cinq minutes à basse vitesse (50 - 60rpm). </li><li> Mettez la chambre de l&#39;adhérence de retour sur la diapositive de grille, en alignant le même coin de la chambre pour le même coin de la diapositive grille, comme l&#39;a fait à l&#39;étape n ° 5 du présent article, Assay adhésion cellulaire. Comptez le nombre de cellules qui restent attachés sur la même grille que vous avez compté avant le lavage. Calculer le pourcentage de cellules qui restent attachées après le lavage. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>1x MBS-H</td><td>Tampon</td><td></td><td></td><td>Milieu de Barth&amp;rsquo;s modifié : recette pour 1 L : 5,14 g NaCl 75 mg KCl 0,2 g NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 0,2 g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 60 mg CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 80 mg Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)2&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;. 38 g HEPES, acide libre. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH. Stériliser à l'autoclave.</td></tr><tr><td>CMF-MBS</td><td>Tampon</td><td></td><td></td><td>Il s'agit de la version sans Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; du MBS-H. Recette pour 500 mL : 2,57 g NaCl 37,5 mg KCl 0,1 g NaHCO&lt;sub&gt;3/sub&gt; 1,19 g HEPES, acide libre. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH. Stériliser à l'autoclave.</td></tr><tr><td>Plaques d'agarose à 1 % / 1x Barth&amp;rsquo;s</td><td></td><td></td><td></td><td>autant que le nombre d'échantillons</td></tr><tr><td>Plaques d'agarose à 1 % / CMF-MBS</td><td></td><td></td><td></td><td>autant que le nombre d'échantillons</td></tr><tr><td>E-Cadhérine/Fc chimérique </td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2278</td><td>Dissoudre 0,1 mg d'E-cadhérine solide dans 100 µL de MBS-H 1x contenant 40 % de glycérol pour obtenir une solution mère 100x (1,0 mg/mL). Conserver à &amp;#8211;20 &amp;deg;C. Diluer 1/100 avec du MBS-H 1x pour obtenir une solution de travail à 10 µg/mL juste avant utilisation. Vous avez besoin de 200 µL par échantillon de cette solution de travail.</td></tr><tr><td>Fibronectine, solution à 0,1 % </td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-1141</td><td>Cette solution prête à l'emploi peut être utilisée comme stock 50x. Diluer 1/50 avec du MBS-H 1x pour obtenir une solution de travail à 20 &amp;mu;g/mL juste avant utilisation. Vous avez besoin de 200 &amp;mu;L par échantillon de cette solution de travail. Je ne recommande pas d'utiliser de la fibronectine sous forme solide, car il est difficile de la dissoudre à une concentration de 0,1 % pour préparer la solution mère. Bien qu'elle soit plus coûteuse, cette solution prête à l'emploi à 0,1 % permet d'obtenir des résultats plus reproductibles.</td></tr><tr><td>BSA à 4 % / MBS-H</td><td>Tampon</td><td></td><td></td><td>BSA : fraction V de grade biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Pipettes jaunes Sigmacoted</td><td>Outil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lames de couverture No.1</td><td></td><td></td><td></td><td>40 mm x 24 mm ou 60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Isolateur en silicone pressé (Press-to-seal)</td><td>Outil</td><td>Glace Bio-Labs</td><td>JTR20-2.5</td><td>profondeur de 2,5 mm x diamètre de 20 mm</td></tr><tr><td>NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Outil</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-471</td><td>2 puits/lame</td></tr><tr><td>Verre à grille (graticule)</td><td>Outil</td><td></td><td></td><td>ou graticule Finder pour le comptage cellulaire</td></tr></tbody></table>

dissection de l&#39;organisateur et explants pôle animal à partir d&#39;embryons de xenopus laevis et de l&#39;assemblée d&#39;un test d&#39;adhésion cellulaire

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Cette vidéo montre la technique utilisée pour la préparation de l&#39;organisateur et les explants pôle animal à partir d&#39;embryons de Xenopus laevis, y compris l&#39;utilisation du couteau sourcils - un outil de dissection spécialisée est fait de son sourcil. Le protocole pour l&#39;assemblage d&#39;un test d&#39;adhérence est également donnée, ce qui sondes pour détecter la présence de molécules d&#39;adhérence clés présents sur la surface de l&#39;organisateur ou de cellules pôle animal qui sont critiques pour le bon développement.

Dissection de l&#39;organisateur et explants pôle animal à partir d&#39;embryons de Xenopus laevis et de l&#39;Assemblée d&#39;un test d&#39;adhésion cellulaire

Bonjour, je m'appelle Sochi Agata. Je suis chercheuse postdoctorale dans le laboratoire du Dr. Ken Cho, spécialisé en biologie du développement et en biologie cellulaire, à l'Université de Californie à Irvine. Aujourd'hui, je vais vous montrer la dissection et le test d'adhérence de l'ectoderme dorsal ou de l'organisateur expansé à partir d'embryons de grenouille XUS.Cette procédure peut être utilisée pour étudier les caractéristiques d'adhérence cellulaire et la morphologie cellulaire des cellules issues de tissus disséqués. Cette méthode implique la dissection d'un tissu spécifique à partir de l'embryon de grenouille Xenopus, la dissociation des cellules dans un milieu sans calcium ni magnésium, puis le transfert de ces cellules dissociées dans un milieu contenant du calcium et du magnésium, sur une lame de verre revêtue de molécules d'adhérence cellulaire. Grâce à cette procédure, on peut étudier le comportement cellulaire, la migration cellulaire et les caractéristiques d'adhérence des cellules issues de la dissection de X one.Très bien, pour l'ensemble de cette procédure de dissection de l'embryon et de l'essai d'adhérence, j'utilise d'abord des outils spéciaux étrangers. Ceci est une lame x à 1 % d'agar, sans calcium ni magnésium. Et ceci est juste ici, une lame x à 1 % d'agar, sur laquelle vous effectuez la dissection de l'embryon.Ensuite, ceci est un instrument de dissection, un outil de dissection spécial autre que la pince. On l'appelle couteau à sourcils, ce qui est un nom étrange, mais il est en réalité fabriqué à partir d'un vrai sourcil arraché du visage, puis fixé sur l'extrémité d'une pipette en plastique.Et cet autre outil ici est appelé boucle capillaire, qui consiste à nouveau en un cheveu formant une boucle à l'extrémité d'une pipette pasteur. Je n'ai pas utilisé cet outil cette fois-ci, mais certaines personnes préfèrent la boucle capillaire au couteau en forme d'œil pour les essais d'adhérence. J'utilise un isolant en caoutchouc de silicone que l'on colle sur la lame de verre pour créer une chambre pour l'essai d'adhérence.Tout d'abord, retirez l'enveloppe de vigne de l'embryon. Ce fragment est l'enveloppe de vigne. Ensuite, disséquez l'ectoderme du pôle animal.Ceci est un projet sur les animaux, vous n'en avez pas besoin. Retournez l'embryon et vous verrez ici cette lèvre dorsale claire. C'est magnifique.Ensuite, prenez un couteau pour globe oculaire, appliquez-le sur le côté de la lèvre dorsale, faites de même pour l'autre côté, puis découpez ce fragment juste en dessous de la lèvre dorsale. Ce fragment contient l'organisateur méso- et l'épiderme environnant. Retournez-le puis épluchez la partie abdominale à partir de l'organisateur interne.Ok. J'ai un peu abîmé la partie dermique, mais ce n'est pas important. Ce n'est donc pas grave. Et ce morceau du côté droit est la mesure de l'organisateur.Je viens de passer au côté plus propre de la boîte. La pièce située à droite est un morceau d'organisateur mère et ceci est l'embryon entier. Et maintenant, vous voyez à quel point la taille du morceau d'organisateur semble importante.Et cela peut être utilisé pour extraire un facteur exprimant la région organisatrice, créer un ADN complémentaire de l'organisateur en bibliothèque, ou étudier la tératologie dans le tissu ectomésoblastique migrant. Avant de disséquer l'ectoderme animal, vous devez identifier le stade approprié. Nous utilisons l'embryon blastula au stade huit.Et maintenant, nous observons ici trois embryons à trois stades différents. Les deux embryons situés à gauche sont au stade sept, blastocyste, et les deux embryons du milieu sont au stade huit. Les deux embryons situés à droite sont presque au stade neuf, fin de blastocyste.Nous aimons observer et utiliser également le stade huit, car vous voyez, tout d'abord, la différence nette entre chaque blastomère au pôle animal. Cet embryon au stade huit offre une bonne combinaison de cellules bien visibles et d'une facilité de dissection supérieure par rapport au stade sept. Au stade huit, les cellules au pôle animal sont trop grandes et leur nombre est trop faible, tandis qu'à l'embryon au stade neuf, chaque cellule est trop petite et le tissu de l'exome au pôle animal devient plus mince qu'au stade huit.Afin que vous n'obteniez pas autant de cellules que souhaité. Tout d'abord, fixez la pince sur le côté de l'embryon et retirez l'enveloppe vitelline de l'embryon. Voici l'enveloppe vitelline.Ensuite, vous disséquez le centre du pôle animal à partir de l'embryon. Voilà, c'est un bel échantillon. Le côté gauche est l'explante de calotte animale disséquée et ceci est le reste de l'embryon.Et ce fragment peut être utilisé, par exemple, si vous injectez une construction du gène Porto au pôle animal de l'embryon à un stade précoce, puis que vous disséquez ce fragment à un stade ultérieur et l'utilisez pour un test Porto, comme un test de réciprocité par exemple. Maintenant, je vais utiliser une greffe et transférer l'organisateur x explan afin d'étudier le test d'adhésion cellulaire. Pour ce faire, je dois dissocier l'organisateur x explan dans un milieu contenant du chlorure de calcium à 3 mM.Je procède donc au transfert de l'explante d'organisateur de cette boîte de culture standard vers une boîte contenant un milieu sans calcium ni magnésium. Pour ce faire, si vous avez une excellente dextérité manuelle, vous pouvez utiliser la pipette de transfert classique, mais vous risquez tout de même d'endommager l'embryon pendant l'opération. Ce que je fais habituellement, c'est utiliser une pipette P200 avec un embout jaune.Et cette extrémité jaune est préalablement traitée avec ce code chimique unique afin d'empêcher les cellules de s'agglutiner sur les parois de l'embout jaune. De plus, j'ai coupé l'extrémité avec des ciseaux au bout de l'embout jaune afin que celle-ci devienne émoussée et à large orifice, ce qui permet de minimiser le risque d'endommager l'explant DX. Bon, ce que vous voyez maintenant à l'écran, ce sont les deux explants organisateurs, et je vais transférer ces deux morceaux depuis cette boîte de Pétri ordinaire vers une boîte contenant un milieu exempt de mécanisme au calcium.Aspirez lentement ces morceaux et transférez-les dans un milieu sans calcium ni magnésium. Voici à quoi ils ressemblent au départ, et voici comment ils se dissocient presque jusqu’au niveau de la cellule isolée. Les explants organisés se trouvent maintenant dans un milieu sans calcium ni magnésium, et je les incuberai dans ce milieu dépourvu de calcium et de magnésium pendant une heure afin de permettre leur dissociation au niveau de la cellule unique, étape suivante pour étudier la morphologie ou le comportement cellulaire. Après une heure d’incubation, les cellules, c’est-à-dire les explants organisés, doivent être dissociés.Ils sont assez bien. Et maintenant, observez les micros et le microscope. Ils sont, oui, ils ont l'air assez impressionnants.Très bien, maintenant j'étudie le comportement cellulaire dans une chambre d'imagerie constituée d'une lame recouverte de cadhérine, d'INE ou d'un autre type de molécule d'adhésion cellulaire afin de créer une chambre d'imagerie pour l'adhésion cellulaire. Je prends cette lame ainsi que cet isolant en caoutchouc de silicone, puis je place simplement l'isolant en caoutchouc de silicone à la surface de la lame et j'appuie fermement pour m'assurer qu'il adhère complètement tout autour du cercle. Ensuite, je vérifie depuis l'autre côté que l'adhérence est complète afin qu'aucun liquide ne puisse s'échapper par le haut.Dans cette chambre à sable, je verse une goutte de 200 microlitres de la suspension cellulaire, qui contient des protéines d’adhésion cellulaire telles que la cohérine ou la fibronectine. Ensuite, je bloque cette chambre avec 500 microlitres de BSA à 4 %. Puis, je remplace la BSA par du milieu de culture régulier à 1 x.Et maintenant, voici une chambre prête à transporter la cellule. Je prends donc à nouveau cette pipette P 200 munie d'une pointe jaune coupée et enduite de code sigma, puis j'aspire la cellule à partir du milieu sans calcium ni magnésium vers cette chambre, qui contient un milieu comprenant du calcium et du magnésium. Maintenant, je transfère cet organisateur dissocié du point X à l'aide de la P 200.Tout d'abord, insérez cette pipette P200 et aspirez doucement la cellule ; vous pouvez alors l'agiter très délicatement vers le haut et vers le bas. Je continue à répartir la cellule partout, mais afin de vous assurer qu'elles sont bien individuelles, placez ensuite la chambre d'imagerie au centre de votre champ de vision, puis répartissez les cellules uniformément dans la chambre d'imagerie. Les cellules sont maintenant réparties sur la surface recouverte.Et voyons, dans le tube supérieur, les cellules ont cet aspect. Bon, après deux à trois heures d'incubation pendant lesquelles les cellules se sont étalées dans la chambre adhésive, je compte les cellules dans cette chambre à l’aide de ce microscope. Généralement, lorsque vous souhaitez étudier l’adhésion des cellules d’un organisme à partir d’un explant d’organisateur, vous laissez les cellules sur une lame recouverte pendant deux à trois heures.Ensuite, vous pouvez quantifier le nombre de cellules sur la lame au microscope avant le lavage. Pour éliminer les cellules non liées ou non touchées de DO trois, il suffit de placer cette chambre hession dans le récipient contenant une grande quantité de tampon. Puis, démarrez l'agitation à une vitesse très faible, environ 50 tr/min, c'est-à-dire à cette vitesse, et attendez cinq minutes.Après cinq minutes, retirez soigneusement cette chambre d'adhérence sans exposer la cellule à l'intérieur de cette chambre. Ainsi, retirez-la délicatement de cette manière, puis essuyez l'excès de tampon et observez à nouveau au microscope afin de déterminer le pourcentage de cellules restant attachées à la surface revêtue. Après le lavage, replacez la chambre d'adhérence exactement à la même position pour vous assurer d'observer le même emplacement précis de la chambre.Et maintenant, commencez le décompte. Sur cet écran, je montre deux types différents de cellules exprimant la même molécule d’adhésion cellulaire. Ces deux types cellulaires présentent des caractéristiques d’adhérence complètement différentes sur le même support.Sur le dessus de la même protéine adhésive pour cellules adhérentes. Nous pourrions également utiliser cette cellule dissociée de l'explant pour étudier son comportement d'agrégation ou de migration en imagerie temporelle.

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