Application des méthodes Kinetics stopped-flow pour étudier le mécanisme d'action d'une protéine réparation de l'ADN

Voici la présentation de deux méthodes de flux arrêté permettant de mesurer la cinétique de réaction de la protéine de réparation d'erreurs d'appariement d'ADN mush two mush six A. Mush two mush six reconnaît les paires de bases non appariées dans l'ADN et déclenche la réparation lors d'une réaction alimentée par de l'ATP. La première méthode mesure la liaison de mush two mush six à l'ADN par l'augmentation de la fluorescence d'une base de deux aminopurine positionnée adjacente à une paire GT non appariée dans l'ADN. Les réactifs sont mélangés dans un appareil de flux arrêté et suivis dans le temps afin de déterminer la constante de vitesse.

La deuxième méthode mesure l'activité de la TPA mush two mush six à l'aide d'un rapporteur fluorescent constitué d'une protéine de liaison au phosphate. Les réactifs sont mélangés dans un système d'écoulement arrêté et suivis dans le temps. Pour déterminer les constantes de vitesse de l'hydrolyse du TPA et du relâchement du phosphate, les données cinétiques obtenues permettent d'élucider le mécanisme d'action de mush two mush six dans la réparation des mésappariements de l'ADN.

Bonjour, je suis Noah Biro du laboratoire de MONI, du département de biologie moléculaire et de biochimie de l'Université Wesleyan. Salut, je suis DJ J, également du laboratoire de Man à l'Université Wesleyan. Et je suis Chris Dset, également du laboratoire de JI'S.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter deux dosages fluorescents permettant de suivre la cinétique d'une réaction à l'échelle du milliseconde. Nous utilisons ces méthodes dans notre laboratoire pour étudier comment la protéine de réparation de l'ADN MutSα lie les paires de bases non appariées dans l'ADN et initie la réparation. Commençons donc.

Avant de commencer cette procédure, les réactifs protéiques et d'ADN requis doivent être facilement disponibles. Obtenez la protéine s visier mush two mush six qui a été précédemment surexprimée dans coli et purifiée par chromatographie d'échange d'ions et par chromatographie d'affinité. Pour générer les réactifs d'ADN, achetez de l'ADN simple brin modifié avec l'analogue nucléotidique fluorescent amino purine, purifiez les brins par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant et hybridez-les afin d'obtenir un ADN duplex portant un désappariement GT adjacent à deux amino purines.

De la même manière, préparez de l'ADN non marqué à partir d'ADN simple brin non modifié. Les séquences d'ADN utilisées ici sont disponibles dans la partie écrite de ce protocole. Au cours de cette procédure, assurez une haute intégrité expérimentale en utilisant des produits chimiques de haute qualité afin de minimiser les impuretés fluorescentes.

Filtrez également toutes les solutions mères à l’aide d’une membrane de 0,2 micromètre afin d’éliminer les particules pouvant obstruer l’appareil de flux arrêté. Pour préparer les expériences de liaison à l’ADN, préparez des échantillons avec un volume final de 400 microlitres par échantillon, ce qui est suffisant pour environ 10 courbes cinétiques. Conservez les échantillons sur glace.

Pour préserver l'activité protéique, préparez l'échantillon d'ADN à 0,12 micromolaire et l'échantillon mush deux mush six à une concentration de 0,8 micromolaire dans le tampon de liaison à l'ADN. Cela donnera des concentrations finales de 0,06 micromolaire d'ADN et de 0,4 micromolaire de mush. Deux M six après un mélange un pour un dans le flux arrêté.

Un appareil à flux arrêté utilise un moteur d'entraînement pour pousser simultanément et rapidement les solutions réactives des seringues d'entraînement vers un dispositif de mélange. La solution mélangée s'écoule ensuite dans une cellule d'observation pour la collecte de données afin de préparer l'appareil. Tout d'abord, s'assurer que l'ordinateur et le contrôleur sont éteints.

Ensuite, allumez le bain d'eau circulant pour refroidir la lampe, puis allumez la lampe. Réglez le monochromateur sur la longueur d'onde d'excitation souhaitée, soit 315 nanomètres. Pour la deux-amino purine, réglez la largeur de fente (SL) à la valeur souhaitée.

Insérez un filtre de coupure à 350 nanomètres au niveau du tube photomultiplicateur ou PMT pour collecter le signal fluorescent des deux purines aminées. Allumez le contrôleur et l'ordinateur. Ensuite, allumez le bain d'eau circulant.

Cela remplit la chemise d'eau entourant les seringues motrices afin de maintenir la réactance à la température souhaitée pendant l'expérience. Enfin, exécutez le programme d'arrêt d'écoulement dans le menu de commande P-M-T-H-V. Réglez la tension du PMT, qui peut être ajustée initialement pour modifier la sensibilité du PMT, mais qui doit ensuite rester constante.

Pendant l'expérience, mesurez le courant d'obscurité afin de corriger le bruit électrique de fond. Ensuite, rincez les seringues du dispositif d'écoulement arrêté et la cellule d'observation. Placez la vanne de chargement de l'échantillon en position de chargement.

Remplissez une seringue d'un millilitre avec de l'eau déionisée filtrée. Fixez la seringue au port de chargement situé sous la seringue d'entraînement et poussez l'eau entre les deux seringues. Répétez le processus deux fois pour chacune.

Utiliser la seringue pilote qui sera utilisée dans l'expérience. Ensuite, remplir les seringues pilotes avec de l'eau pour rincer la cellule d'observation. Passer le robinet de chargement de l'échantillon en position feu.

Utilisez la commande de réglage de la pompe à seringue pour abaisser la plaque d'entraînement et faire circuler l'eau à travers la cellule d'observation et dans la ligne de sortie. Veillez à ne pas pousser le piston jusqu'au bout de la seringue d'entraînement. Enfin, remontez la plaque d'entraînement et positionnez le robinet sur la position de chargement.

Lavez une fois avec le tampon de réaction et videz les seringues. Pour commencer les expériences de liaison de l'ADN, transférez chaque échantillon du tube vers une seringue fraîche d'un millilitre. Fixez chaque seringue à un port de chargement et poussez la solution dans la seringue motrice.

Éliminez toutes les bulles d'air en poussant manuellement la solution entre les deux seringues avec des pauses intermittentes. Abaissez ensuite la plaque d'entraînement jusqu'à ce qu'elle touche le haut des seringues d'entraînement. Pour la collecte des données, ouvrez la fenêtre de réglage des canaux temporels.

Sélectionnez le mode de canal de collecte des données pour l'analyse et le nombre de tracés à acquérir. Saisissez la durée de collecte des données pendant laquelle 1000 points de données seront recueillis. Ensuite, positionnez la vanne sur la position feu et cliquez sur le bouton de collecte des données.

Cette action déclenche le mélange du mush deux, du mush six et de l'ADN, suivi de l'entrée de la réaction dans la phase d'observation. L'émission fluorescente des cellules provenant de la deux-amino purine est surveillée en continu. Enregistrez au moins cinq courbes cinétiques afin d'obtenir un jeu de données de haute qualité et sauvegardez le fichier une fois l'expérience terminée.

Ouvrez chaque fichier de données et faites la moyenne de plusieurs courbes cinétiques. Ensuite, enregistrez le fichier de données moyennées et exportez-le vers un logiciel de tracé pour analyse. Enfin, éteignez la lampe, rincez soigneusement les seringues et la cellule d'observation avec de l'eau.

Ensuite, éteignez le reste de l'équipement sauf le bain d'eau circulant. Ce dernier reste allumé pendant encore 15 minutes afin de refroidir la lampe. Les données cinétiques de la liaison de mush deux mush six à l'ADN non apparié sont mieux ajustées par une fonction exponentielle simple, ce qui donne une vitesse rapide d'association de l'ordre de 10⁷ M⁻¹·s⁻¹. Des expériences analogues en flux arrêté fournissent la vitesse de dissociation du complexe mush deux mush six avec l'ADN non apparié, qui est très lente, comprise entre 0,01 et 0,02 s⁻¹.

Ces résultats fournissent une mesure directe de la vitesse et de l'affinité avec lesquelles mush deux mush six se lie. Mush deux mush six se fixe sur une paire de bases non appariée au cours de la réaction de réparation de l'ADN. Ensuite, une expérience de flux arrêté sera réalisée pour mesurer l'activité ATPAs de mush deux mush six.

Dans les conditions d'état pré-étude pour ce dosage, il est absolument essentiel d'éviter l'utilisation de verre à toutes les étapes de la préparation des réactifs, y compris la purification des protéines et de l'ADN, afin de minimiser les niveaux de phosphate de fond. La protéine de liaison du phosphate, ou PBP, purifiée à partir d’e. coli et marquée avec le fluorophore MDCC, est utilisée comme indicateur pour mesurer le relâchement du phosphate après l'hydrolyse de l'ATP. Le M-D-C-C-P-B-P est un indicateur robuste de l'hydrolyse de l'ATP et de la cinétique de libération du phosphate à l'état pré-étude. Il se lie au phosphate libre rapidement et avec une forte affinité, ce qui entraîne une forte augmentation de la fluorescence MDCC.

Préparez un échantillon contenant quatre micromolaire de mush, deux mush six protéine avec ou sans six micromolaire d'ADN non apparié. Préparez un autre échantillon contenant un millimolaire de HEP fraîchement dissous et 20 micromolaires de M-D-C-C-P-V-P afin de piéger tout phosphate contaminant. Ajoutez de la purine, du nucléoside, de la phosphorylase et de la guanine sept méthylée aux échantillons, puis incubez sur glace pendant au moins 20 minutes.

Préparez l'instrument de flux arrêté comme décrit précédemment. En outre, éliminez toute contamination par des phosphates des seringues motrices à l'aide de purine, de nucléoside, de phosphoryle et de sept méthylguanines. Incubez pendant 20 minutes. Réglez la longueur d'onde d'excitation à 425 nanomètres et utilisez un filtre de coupure à 450 nanomètres avec le PMT pour la détection de la fluorescence M-D-C-C-P-B-P.

Chargez les seringues d'entraînement avec les échantillons comme décrit précédemment. Réglez les paramètres de collecte des données et cliquez sur collecter les données pour mélanger mush deux mush six avec un TP et surveiller la libération de phosphate par mush deux mush six ainsi que l'augmentation couplée de la fluorescence de M-D-C-C-P-P-P. Au fil du temps, collectez au moins cinq courbes cinétiques afin d'obtenir un jeu de données de haute qualité, faites la moyenne de plusieurs courbes cinétiques, puis enregistrez et exportez le fichier de données pour analyse comme décrit précédemment. Préparez une courbe d'étalonnage afin de déterminer la relation linéaire entre la concentration en phosphate et la fluorescence de M-D-C-C-P-P-P : mélangez d'abord M-D-C-C-P-P-P avec différentes concentrations de phosphate dans les mêmes conditions expérimentales en flux arrêté.

Ensuite, tracez la fluorescence maximale de M-D-C-C-P-P-P en fonction de chaque concentration de phosphate pour la courbe d'étalonnage, et utilisez la pente pour déterminer la concentration de phosphate dans les réactions mush deux mush six. Représentez la concentration de phosphate en fonction du temps et ajustez les données à une fonction exponentielle et à une fonction linéaire. Cette fonction décrit un pic d'hydrolyse de l'ATP et de libération de phosphate dans un état pré-étude A, suivi d'une phase linéaire en régime permanent de la réaction. Les données cinétiques montrent que mush deux mush six hydrolyse l'ATP et libère du phosphate rapidement à raison de 1,4 par seconde lors du premier cycle catalytique.

Cela est suivi par une étape lente dans la réaction, limitant les cycles suivants à une constante catalytique en état stationnaire sept fois plus lente, de 0,2 par seconde. Toutefois, lorsque Mush to Mush six est lié à de l'ADN comportant une paire de bases non appariée, le pic d'hydrolyse de l'ATP et la libération de phosphate sont supprimés. Ces résultats montrent directement qu'après liaison d'une paire de bases non appariée, Mush to Mush six passe à un état lié à l'ATP.

Cette commutation constitue une étape cruciale dans la réaction de réparation de l'ADN. Nous venons de vous montrer comment utiliser un appareil à arrêt d'écoulement pour mesurer les cinétiques d'une réaction en temps réel. De telles mesures ont approfondi notre compréhension du mécanisme d'action de MASH deux, MASH six et de la réparation des mésappariements de l'ADN.

Lorsque vous réalisez ce type d'expériences, il est important de vous rappeler d'utiliser des réactifs de haute qualité, notamment de l'ADN et des protéines très purs, et de prendre des précautions particulières pour éviter toute contamination par des phosphates dans le dosage des ATP. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.