Microscopie dispersion optique basé sur des filtres de Gabor bidimensionnelle

Dans cette vidéo, la microscopie à diffusion optique est utilisée pour quantifier la fragmentation mitochondriale au cours de l’apoptose. Bien que la microscopie optique à diffusion ne nécessite normalement pas de fluorescence dans ce protocole, des images fluorescentes seront acquises à des fins de validation. Après la mise en place du système d’imagerie, les cellules sont marquées avec MIT tracker green et traitées avec stor sporin pour induire l’apoptose.

Les données optiques sont acquises pour détecter les changements d’orientation des organites cellulaires dans les deux heures. Le début de la fragmentation mitochondriale peut être mesuré à l’aide des données optiques diffusées, qui montrent une diminution du degré d’orientation des particules subcellulaires. Les données sont ensuite validées en corrélant les données optiques diffusées avec les régions fluorescentes contenant des mitochondries.

Bonjour, je m’appelle Nada Bustani et je travaille au Laboratoire de biooptique du Département de génie biomédical de l’Université Rutgers. Je m’appelle Rob Pak du Bio Optics Lab, et je m’appelle Deen, également du Bio Lab. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de quantification de la dynamique morphologique subcellulaire à l’aide d’une méthode qui ne repose pas sur des colorants fluorescents.

Nous utilisons cette technique dans notre laboratoire pour étudier les changements dynamiques de la structure subcellulaire pendant l’apoptose ou programmer la mort cellulaire. Alors commençons. Commencez cette procédure en stérilisant les mains gantées avec de l’éthanol à 70 %.

Ensuite, placez une solution mère préparée de 100 nano molaires de milieu de culture cellulaire miot tracker vert et préchauffé, BAEC dans le capot avec la lumière éteinte et stérilisez toutes les surfaces. Ensuite, placez une boîte de culture à six puits avec des cellules plaquées sur du verre de couverture sous le capot. À l’aide d’une pipette à pâte reliée à une conduite de vide.

Retirez le milieu cellulaire des puits. Ajoutez ensuite immédiatement deux millilitres du milieu marqué dans chaque puits pour marquer les cellules. Mitochondrie. Couvrez la plaque de culture tissulaire pour éviter l’exposition à la lumière directe de la pièce et remettez rapidement les cellules dans l’incubateur.

Incuber pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius pendant l’incubation des cellules. Préparez la configuration optique, allumez d’abord la pince à arc au mercure. Ensuite, allumez l’ordinateur, les caméras du microscope et branchez le laser dans le diffuseur rotatif.

Ensuite, regardez à travers l’oculaire du microscope pour voir si le lancement optique est aligné. Le champ de vision doit être éclairé par une lumière laser. Pour charger l’échantillon, placez une à deux petites gouttes d’huile d’immersion sur un objectif d’immersion dans l’huile 63 x pendant qu’il est complètement descendu.

Ensuite, sur la scène, montez une diapositive composée d’une grille de lignes à intervalles réguliers de 10 micromètres appelée le gradi, et soulevez l’objectif de manière à ce que l’huile s’accroche à sa focale. Ensuite, concentrez-vous sur le bord hexagonal du champ du condenseur. Arrêtez-vous pour qu’il soit aligné dans l’éclairage central Kohler.

Le bord hexagonal doit être centré dans l’oculaire et bien focalisé. Ensuite, à l’aide des boutons de position d’arrêt du champ du condenseur, le champ du condenseur, s’arrêtent sur le champ de vision. Démarrez IP lab et entrez les paramètres pour faire fonctionner la caméra.

Vérifiez que l’appareil photo est réglé sur le mode de transfert d’image. Exécutez la commande acquire focus pour démarrer l’aperçu en direct. Définissez ensuite le préfixe de l’index et l’emplacement du fichier dans lequel les images seront enregistrées.

Ensuite, lancez l’image RS. Désignez les paramètres de fonctionnement de l’appareil photo cool. Le mode d’horloge doit être réglé sur normal.

Démarrez le logiciel DMD. Placez l’iris du champ sombre dans le menu du script. Cliquez ensuite sur charger et réinitialiser.

Pour exécuter le script manuellement, réglez la barre optique du microscope dans la fenêtre d’affichage sur LSM. Cela enverra l’image à travers le DMD dans l’optique alignée. Projection de l’image en fond noir sur le CCD de la caméra Cascade five 12.

L’image du fond noir doit apparaître sur l’aperçu en direct dans IP lab. Si nécessaire, concentrez l’image sur l’aperçu en direct. Réglez le temps d’exposition suffisamment haut pour garantir au moins 10 000 comptes de signal dans l’image.

Prenez ensuite un instantané du champ de vision à l’aide de la commande acquire single après l’acquisition. Utilisez la commande Enregistrer en tant qu’indexé pour enregistrer l’image sur le disque. L’image de la GTI mesure la taille du champ de vision.

Déplacez maintenant l’échantillon GTI de manière à ce qu’il soit au-delà du champ de vision et que seul l’arrière-plan soit visible. Capturer une image d’arrière-plan du terrain avec un temps d’exposition suffisant pour acquérir au moins 5 000 comptes. Cette image aidera à la soustraction d’arrière-plan des images non filtrées.

Maintenant, pour acquérir des images filtrées Gabor de l’arrière-plan, chargez le script Gabor Filter Bank dans le logiciel de contrôle DMD. Exécutez l’intégralité du script pour mettre les filtres en mémoire tampon dans la mémoire intégrée du DMD. Cela peut prendre quelques minutes une fois que l’intégralité du script est mise en mémoire tampon.

Utilisez les marqueurs de démarrage et d’arrêt dans le logiciel DMD pour vous assurer qu’un seul ensemble de filtres correspondant à un filtre Gabor Like est chargé à la fois. Exécutez le script pour acquérir des images filtrées de l’arrière-plan. L’aperçu de l’image en direct doit passer du champ sombre à l’image filtrée.

Pour ce filtre, ouvrez le script d’acquisition dans IP lab à partir du disque. Ajustez le temps d’exposition pour vous assurer qu’au moins 2000 comptes sont acquis. Pendant l’exécution du script DMD, annulez l’aperçu en direct dans IP lab et exécutez le script d’acquisition.

Cela permettra d’acquérir automatiquement l’index et d’enregistrer l’image filtrée sur le disque. Une fois la première image acquise, arrêtez l’exécution du script dans DMD. Supprimez les commandes utilisées du script.

Replacez ensuite les marqueurs de début et d’arrêt au début et à la fin du prochain jeu de filtres. Répétez l’acquisition dans IP lab jusqu’à ce que toute la banque de filtres ait été utilisée et que toutes les images filtrées aient été acquises et enregistrées. Préparez-vous à plaquer les cellules en branchant un fer à souder sur la paillasse du laboratoire et en chauffant le L 15 à 37 degrés Celsius.

Fabriquez un poste de travail avec une serviette en papier et une lingette Kim pour absorber tout produit renversé et garder la zone propre. Préparez plusieurs mèches en déchirant et en faisant tourner les lingettes kimm. Les mèches seront utilisées pour aspirer le fluide à travers la plaque cellulaire.

Ensuite, utilisez le porte-échantillon en métal pour créer un sandwich de cellules. À l’aide d’une seringue, appliquez un mince cordon de graisse sous vide autour de la périphérie supérieure du trou dans la plaque métallique usinée, s’étendant à peu près à mi-chemin des extrémités des rainures de chaque côté. Passez délicatement une glisse de couvercle numéro un propre sur la graisse.

Retournez la plaque et appliquez la graisse autour du trou. Éteignez les lumières de la pièce en portant des gants d’examen NI stérilisés à l’éthanol. Récupérez les cellules de l’incubateur.

Retirez la lamelle qui sera utilisée pour l’expérience de la plaque à six puits. Séchez soigneusement la lamelle. Appuyez ensuite sur le couvercle côté cellule vers le bas dans la plaque métallique graissée au-dessus du trou de visualisation.

Prise en sandwich des cellules à l’intérieur de la plaque. Assurez-vous qu’il ne reste pas d’espace d’air et que la graisse a formé un joint étanche afin que le fluide puisse être chargé. Maintenant, retournez la plaque sur le pipetage de 200 microlitres à la fois.

Ajoutez du préchaud L 15 medium dans le sandwich à travers la rainure entre la lamelle de recouvrement supérieure et la plaque métallique jusqu’à ce que le liquide atteigne presque la rainure de l’autre côté. Ensuite, lavez les cellules en tenant une mèche dans la rainure opposée et en pipetant 200 microlitres supplémentaires de fluide dans le sandwich. Le fluide s’écoulera d’un côté à l’autre au fur et à mesure que la mèche enlève l’ancien support.

Veillez à ce que des bulles ne se forment pas dans le liquide pendant cette étape. Répétez ce processus deux à trois fois en utilisant une nouvelle mèche pour chaque rinçage. Maintenant, retournez une fois de plus la plaque en soutenant la plaque par les bords afin de piéger le liquide dans le réservoir de la cellule.

Trempez le fer à souder dans le bécher du veap pour faire fondre rapidement une partie du veap, qui s’accrochera ensuite à la pointe du fer à souder. À l’aide de la pointe du fer à souder, appliquez soigneusement le veap de mue sur les bords de la lamelle de couverture inférieure. Continuez à tremper et à appliquer tout autour du périmètre de la lamelle, en la scellant à la plaque métallique.

Cela crée une bonne garniture mécanique afin que la lamelle ne se détache pas de la plaque pendant qu’elle est vue. Nettoyez tout résidu du fond. Couvrez la surface en braillant une lingette et en nettoyant la housse.

Glissez-le en un seul mouvement de glissement pour vous assurer que le couvercle est le plus propre au centre où il sera vu. Remettez les six plaques murales dans l’incubateur. Apportez les cellules plaquées au laboratoire d’optique et montez-les sur l’objectif.

Comme précédemment, trouvez un champ de cellules d’apparence saine et acquérez une image du champ sombre du champ de vision. Alignez ensuite le microscope en DIC et assurez-vous que les temps d’exposition sont adéquats. Acquérez une image DIC avec une caméra en cascade.

Dans cette configuration, les images fluorescentes sont acquises à l’aide de la caméra SNAP alors que le microscope est toujours aligné en DIC. Réglez le VAR du microscope sur un x et la fenêtre d’affichage sur 100 % binoculaire et déviez l’image de l’oculaire vers l’appareil photo. Placez une LED bleue sur le condenseur pour éclairer le champ.

Ensuite, prévisualisez le champ de vision dans l’image RSS et ajustez la mise au point fine. Si nécessaire, acquérez une image DIC et enregistrez-la sur le disque. Notez en quoi le champ de vision est différent de celui obtenu avec la caméra en cascade.

Ces images devront être enregistrées lors de la phase d’analyse de l’expérience. Ensuite, déplacez le cube du filtre fluorescent en position et acquérez une image de fluorescence en activant brièvement l’excitation de fluorescence à l’aide de l’obturateur du microscope, puis désactivez-le dès que l’acquisition est terminée. Pour minimiser le photoblanchiment, enregistrez l’image de fluorescence sur le disque.

Pour acquérir des images filtrées, réinitialisez le microscope sur le terrain et envoyez la lumière via le port LSM. Comme précédemment, exécutez l’ensemble du script de la banque de filtres Gabor comme auparavant pour terminer l’acquisition des données pour un point temporel pendant que les cellules sont encore sur la scène et sans perturber le champ de vision. Utilisez la méthode de mèche pour remplacer le milieu L 15 régulier par le même contenant une solution micromolaire de STS.

Au cours de l’expérience, ajoutez du milieu supplémentaire pour éviter le dessèchement en pipetant le milieu dans le sillon de la plaque cellulaire sans le retirer de la platine ni perturber le champ de vision. Maintenant, répétez ces étapes pour les points temporels suivants jusqu’à ce que l’expérience soit terminée. Les données collectées comprendront un grand nombre d’images filtrées qui devront être traitées pour extraire les données structurelles subcellulaires.

Deux exemples d’expériences sont présentés ici. Cette figure montre des images séquentielles d’un échantillon d’algues diatomées marines. Les caractéristiques orientées sont clairement visibles.

En imagerie en fond noir. Les images filtrées optiquement étiquetées cinq égale zéro degré à cinq égale 160 degrés sont affichées à côté de l’image non filtrée de l’échantillon. À titre de comparaison, l’ensemble de neuf images filtrées de Gabor de la diatomée a été traité pixel par pixel pour l’orientation de l’objet.

À chaque pixel, le signal maximum a été divisé par le signal moyen en fonction de l’orientation du filtre pour donner une valeur de rapport d’aspect. Ici, un rapport d’aspect proche de celui indiqué par le bleu est présent dans les zones où il n’y a pas d’angle de réponse préféré. Les valeurs supérieures indiquées par le rouge indiquent les zones dans lesquelles une réponse d’angle préféré plus élevée est présente.

La luminosité et la signification du code de la réponse totale du filtre GABOR, l’orientation du filtre, donnant le signal maximal à chaque pixel, correspond à la direction perpendiculaire à l’orientation de l’objet sous-jacent. L’orientation des particules de sous-structure est codée dans un tracé de carquois où chaque ligne correspond étroitement à l’orientation locale de l’objet sous-jacente visible en fond noir non filtré. Le graphique de carquois montre l’orientation des objets avec des intensités de réponse supérieures à 10 % du maximum.

Ces images en fond noir et filtrées optiquement d’un champ contenant des cellules endothéliales bovines vivantes, des images filtrées ont ensuite été acquises toutes les 20 minutes pendant une période de trois heures après le traitement avec l’inducteur d’apoptose stor sporin. Ici, la carte du rapport hauteur/largeur dans le panneau supérieur et l’imagerie de fluorescence des mitochondries dans le panneau inférieur sont affichées en fonction du temps. La teinte de couleur représente le degré d’orientation, car avant ces graphiques temporels comparent la diminution du degré d’orientation du rapport d’aspect des particules dans les cellules endothéliales traitées avec s thoro sporin, les traces individuelles représentent des tracés temporels à l’intérieur de cellules individuelles.

L’orientation drop-in est confinée aux régions des cellules qui s’enregistrent avec les régions fluorescentes. Maintenant, la validation contre la fluorescence a été réalisée. Cela devient archivistique.

Ainsi, dans les expériences suivantes, les mesures mitochondriales pourront être effectuées en omettant les étapes d’imagerie de fluorescence et en utilisant directement la méthode de diffusion optique. Nous venons de vous montrer comment surveiller la fragmentation mitochondriale pendant l’apoptose à l’aide de signatures de diffusion de la lumière basées sur des filtres de Gabor. Lors de cette procédure, il est important d’avoir une bonne préparation au mode de vie et de s’assurer que la configuration optique est bien alignée et calibrée.

Prenons donc un sens pour regarder et CoLab avec des expériences d’interface utilisateur.