Name: Linéarisation du dosage des protéines Bradford (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Découvrez la linéarisation du dosage Bradford pour améliorer la quantification protéique en biochimie. Cette méthode augmente la sensibilité dix fois et réduit les interférences détergentes.

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Cet article est dédié à la mémoire du regretté Dr Zvi Selinger, qui a accueilli la recherche originale décrite ici.

Linéarisation du graphique d'étalonnage Bradford Protéines: Le dosage de Coomassie brillant protéines bleu, communément connu comme le dosage de Bradford 1, est largement utilisé en raison de son protocole rapide et pratique ainsi que sa sensibilité relative. Malheureusement, il ya un grand degré de courbure sur une large gamme de concentrations de protéines (Fig. 1). Par conséquent, seule une gamme étroite de concentrations en protéines relativement élevée, 2-10 mg / ml de BSA, est utilisé pour la courbe d'étalonnage, ce qui correspond le mieux, puis de régression linéaire (Fig. 1, en vert). Cependant, la non-linéarité exige de la concentration en protéines des échantillons inconnus à tomber dans la fourchette limitée de la courbe d'étalonnage afin d'éviter une erreur importante, et il réduit aussi la précision dans la gamme limitée. La non-linéarité présente un problème sérieux, en particulier lorsque des quantités microgrammes de protéine ne sont pas disponibles, et il faut souvent plusieurs dilutions des échantillons inconnus. Comme indiqué dans le document original Bradford, «la source de la non-linéarité est dans le réactif lui-même car il ya un chevauchement dans le spectre des deux formes différentes couleurs de la teinture." 1. En fait, trois formes de la teinture bleu de Coomassie sont en équilibre acido-basique au pH acide de l'habitude de dosage 2. Les formes rouges, bleues et vertes ont absorbance maxima à 470, 590 et 650 nm, respectivement (Fig. 2). Le bleu est la forme qui lie la protéine, formant un complexe qui absorbe intensément la lumière à 594 nm 3, 4 (fig. 2). Bradford a également noté que "la valeur du fond pour le réactif ne cesse de diminuer comme plus colorant est liée à la protéine" 1 (Fig. 3). Par conséquent, nous avons tenté de calculer la réduction de l'arrière-plan 590 nm comme les quantités de protéines augmente sont ajoutés, en mesurant la variation d'absorbance à 450 nm, où le complexe protéine-colorant n'absorbe pas. Nous avons constaté que le fond diminue partiellement, mais pas complètement, les comptes pour la non-linéarité (Fig. 4). Nous avons alors émis l'hypothèse que la diminution de la concentration du colorant libre produit une autre distorsion de la réponse linéaire, parce que la protéine-colorant liant est en équilibre 5, la formation de complexes ne dépend pas seulement de la concentration de la protéine libre, mais aussi sur celle du colorant libre (fig. 5). Prenant en compte à la fois les questions liées à la concentration variable du colorant libre, nous avons développé une équation mathématique qui décrit une relation linéaire entre la concentration de protéines et le ratio des mesures d'absorbance, 590 nm sur 450 nm (Fig. 6). Une description détaillée de l'étude théorique et expérimentale peut être trouvé dans notre publication de 1996 dans Analytical Biochemistry 6. L'équation mathématique a été testé et trouvé expérimentalement pour obtenir une courbe d'étalonnage linéaire sur la protéine concentrations varient (Fig. 7) tout entier. Par ailleurs, l'équation a été validé également par une détermination indépendante de la bonne valeur de pH-dépendante de l'interception de l'axe Y 6. Protocole détaillé pour le dosage de Bradford protéine améliorée, en utilisant un lecteur d'absorbance pour microplaques: <ol><li> Préparer une solution à 0,1 mg / ml de la norme, l'albumine sérique bovine. Toute autre norme peut être choisi, mais il faut noter que la même norme doit être utilisée dans toutes les expériences. </li><li> Diluer les échantillons inconnus dans de l'eau déminéralisée. Viser à 50-50 pg / ml. Pourtant, les concentrations en protéines supérieures ou inférieures sont acceptables, car il n'ya pas de limite apparente de la gamme linéaire du dosage. Toutefois, la mesure doit être comprise dans la gamme linéaire du lecteur d'absorbance. </li><li> Diluer le réactif de Bradford (Bio-Rad) de 2,5 fois dans de l'eau déminéralisée. </li><li> Ajouter 0 et 10-50 ul de la solution stock de BSA à trois puits (création d'une courbe de calibration 0-5 mg BSA). Complément à l'eau déminéralisée pour atteindre 100 l / puits. </li><li> Dans les différents puits, ajouter 100 ul d'échantillon inconnu en triple. Plusieurs concentrations de l'échantillon inconnu peut être utilisé pour augmenter la précision. </li><li> Ajouter 100 ul de réactif dilué Bradford à tous les puits. Le volume total est de 200 l / puits. </li><li> Attendez au moins 5 minutes, mais pas plus de 60 min pour le développement de couleur. </li><li> Le blanc doit être de 200 l d'eau déminéralisée (et pas le colorant de protéines de zéro bien). </li><li> Mesurer l'absorbance à 590 nm et à 450 nm. </li><li> Préparer une courbe d'étalonnage en divisant les valeurs d'absorbance nette à 590 nm et à 450 nm. Notez que la protéine zéro (colorant uniquement) valeur doit être incluse comme un point de données (fig. 8). </li><li> Calculer la concentration de l'échantillon inconnu basé sur l'équation linéaire de la courbe de calibration (fig. 9). </li></ol> Les résultats représentatifs: Contrairement à l'absorbance à une seule longueur d'onde de 590 nm, le rapport des valeurs d'absorbance, 590 nm sur 450 nm, est linéaire wvec la concentration de protéines (Fig. 10). La concentration en protéines de l'échantillon inconnu peut être simplement calculé selon l'équation linéaire de la courbe de calibration (fig. 10, l'équation). Toutefois, une précision accrue est obtenue en mesurant plusieurs dilutions des échantillons inconnus. À cette fin, préparer deux graphiques. Le premier est un graphique d'étalonnage pour la norme avec ug de protéines sur l'axe X (fig. 11, à droite). Le deuxième graphique est pour l'échantillon inconnu, avec pl de l'échantillon non dilué d'origine sur l'axe X (Fig. 11, gauche). La valeur de teinture ne devrait être inclus dans les deux graphiques (fig. 11). La concentration en protéines de l'échantillon inconnu est obtenu en divisant les pentes de l'échantillon inconnu et la norme (fig. 11, l'équation). <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig2.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Conventionnel graphique d'étalonnage Bradford. La gamme linéaire est représenté par des symboles verts. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig1.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Spectres du complexe protéine-colorant et de la teinture seulement. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Protéine-colorant équilibre. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Réduction de l'arrière-plan correcte calculée diminue partiellement non-linéarité. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Protéine-colorant équilibre. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig6.jpg" alt="Figure 6" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 6"> Figure 6. Base mathématique pour la linéarisation de l'analyse des protéines de Bradford. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig7.jpg" alt="Figure 7" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 7"> Figure 7. Linéarisation de la courbe d'étalonnage de Bradford. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig8.jpg" alt="Figure 8" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 8"> Figure 8. Calcul des valeurs de rapport d'absorbance. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig9.jpg" alt="Figure 9" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 9"> Figure 9. Un graphique linéaire de calibration Bradford. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig10.jpg" alt="Figure 10" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 10"> Figure 10. Linéarisation de la courbe d'étalonnage de Bradford. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig11.jpg" alt="Figure 11" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 11"> Figure 11. Inconnue échantillon de concentration de calcul.

<ol><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectral+study+of+the+charge+forms+of+Coomassie+blue+G%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A spectral study of the charge forms of Coomassie blue G.</a> Anal Biochem. 209, 258-266 (1993).</li>
<li>Chial, H. J., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+binding+of+Coomassie+brilliant+blue+to+proteins+at+low+and+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH.</a> Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).</li>
<li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).</li>
<li>Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+interaction+of+Coomassie+blue+with+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The binding interaction of Coomassie blue with proteins.</a> Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).</li>
<li>Zor, T., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+protein+assay+increases+its+sensitivity%3A+theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies.</a> Anal Biochem. 236, 302-308 (1996).</li>
</ol>

Le dosage des protéines de Bradford est populaire en raison de sa facilité d&#39;exécution et de la sensibilité relative. La linéarisation sur les concentrations de protéine ensemble de la gamme obtenue par le protocole présenté ici simplifie encore le dosage, comme des échantillons inconnus n&#39;ont pas besoin de tomber dans la plage de la courbe d&#39;étalonnage. Fait important, le protocole prévoit en outre améliorée les avantages suivants sur l&#39;original du protocole de Bradford: </p...

<table><tbody><tr><td>Réactif de Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Amersco</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur d'absorbance Multiplate</td><td>BioTek</td><td>Synergy2</td><td></td></tr></tbody></table>

linéarisation du dosage des protéines bradford

Linearization of the Bradford Protein Assay

Détermination des quantités de microgrammes de protéine de Bradford dans le bleu de Coomassie brillant essai est réalisé par la mesure de l&#39;absorbance à 590 nm. Ce test permet de quantifier la plus courante de protéines rapides et simples dans les lysats cellulaires, les fractions cellulaires, ou des échantillons de protéines recombinantes, dans le but de la normalisation des mesures biochimiques. Toutefois, une non-linéarité intrinsèque compromis la sensibilité et la précision de cette méthode. Il est montré que dans des conditions test standard, le ratio des mesures d&#39;absorbance à 590 nm et 450 nm est strictement linéaire avec la concentration de protéines. Cette procédure simple augmente la précision et améliore la sensibilité du dosage d&#39;environ 10 fois, la quantification permettant à 50 ng d&#39;albumine sérique bovine. Par ailleurs, le brouillage couramment introduites par les détergents qui sont utilisés pour créer les lysats cellulaires est fortement réduite par le nouveau protocole. Une équation linéaire développé sur la base d&#39;une action de masse et la loi de Beer s&#39;adapte parfaitement aux données expérimentales.

La précision et la sensibilité du dosage des protéines par le test rapide et pratique Bradford est compromise par la non-linéarité intrinsèque. Nous montrons une procédure de linéarisation simple qui augmente considérablement la précision, améliore la sensibilité du dosage d&#39;environ 10 fois, et réduit considérablement les interférences par les détergents.

Linéarisation du dosage des protéines Bradford

La détermination de quantités de protéines de l'ordre du microgramme dans le dosage au bleu de Coomassie de Bradford est réalisée par la mesure de l'absorbance à 590 nm. ...

Le dosage des protéines par la méthode de Bradford commence par l'ajout d'une solution étalon de BSA en quantités croissantes ainsi que des dilutions d'un échantillon inconnu dans une plaque de 96 puits ; de l'eau déionisée est ajoutée pour compléter le volume variable. Le réactif de Bradford est ensuite ajouté dans tous les puits, sauf dans le témoin, qui doit contenir uniquement de l'eau après cinq minutes. L'absorbance est mesurée à 590 nanomètres pour la détection du complexe protéine-colorant et à 450 nanomètres.Pour la linéarisation du graphique, le rapport des valeurs d'absorbance à 590 nanomètres et à 450 nanomètres est strictement linéaire par rapport à la quantité de protéine. Bonjour, je viens du Département de biochimie de l'université de Tel Aviv, en Israël, je suis ou T du laboratoire. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de déterminer la concentration en protéines à l'aide d'un protocole de Bradford amélioré et linéarisé.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour normaliser la quantité de protéines dans le SZaS, par exemple, avant de charger les gels. Commençons donc. Dans le dosage de Bradford, trois formes du colorant bleu brillant de Kumasi sont en équilibre acido-basique au pH acide habituel du dosage.Les formes rouge, bleue et verte présentent des maxima d'absorption à 470, 590 et 650 nanomètres respectivement. La forme bleue est celle qui se lie à la protéine, formant un complexe qui absorbe fortement la lumière à 594 nanomètres. Cet essai largement utilisé présente un degré élevé de courbure sur une large gamme de concentrations en protéine.Par conséquent, seule une plage étroite de concentrations protéiques relativement élevées est utilisée pour le graphique d'étalonnage, ce qui permet un meilleur ajustement à la régression linéaire. L'une des causes de la non-linéarité est l'absorbance à 590 nanomètres du colorant libre, qui diminue lorsque des quantités croissantes de protéines sont ajoutées. La non-linéarité est partiellement réduite en mesurant la variation d'absorbance à 450 nanomètres, où le colorant lui-même, mais pas le complexe protéine-colorant, absorbe.Et en réduisant le blanc correctement calculé, la diminution de la concentration de colorant libre produit une autre distorsion de la réponse linéaire, car, la liaison du colorant aux protéines étant à l'équilibre, la formation du complexe dépend non seulement de la concentration de protéine libre, mais aussi de celle du colorant libre. En tenant compte des deux phénomènes liés à la concentration variable du colorant libre, une équation mathématique a été élaborée, décrivant une relation linéaire entre la concentration en protéine et le rapport des mesures d'absorbance à 590 nanomètres sur 450 nanomètres.L'équation mathématique a été testée expérimentalement et s'est révélée produire une courbe d'étalonnage linéaire sur toute la gamme de concentration en protéines. Pour commencer, préparez une solution de tige à 0,1 milligramme par millilitre d'albumine sérique bovine standard. Tout autre étalon peut être choisi, mais notez que le même étalon doit être utilisé dans toutes les expériences.Effectuez une dilution des échantillons inconnus dans de l’eau déionisée. Visez une concentration de cinq à 50 microgrammes par millilitre, bien que des concentrations protéiques plus élevées ou plus faibles soient acceptables, car il n’existe aucune limite apparente pour la gamme linéaire du test. Notez toutefois que la mesure doit se situer dans la gamme linéaire du lecteur d’absorbance.Diluez également le réactif de Bradford 2,5 fois dans de l'eau déionisée. Ensuite, ajoutez zéro ainsi que cinq à 50 microlitres de la solution mère de BSA dans des puits triplicates d'une plaque de 96 puits afin de créer une courbe d'étalonnage de 0 à 5 microgrammes de BSA, en complétant avec de l'eau déionisée pour atteindre un volume de 100 microlitres par puits dans différents puits. Pour les échantillons inconnus, utilisez 100 microlitres en triplicats ; plusieurs concentrations de l'échantillon inconnu peuvent être testées afin d'améliorer la précision.Enfin, ajouter 100 microlitres du réactif de Bradford dilué à tous les puits. Le volume total est de 200 microlitres par puits. Préparer également un témoin pour la mesure de l'absorbance.Cela doit être 200 microlitres d'eau déionisée et non du colorant sans protéine. Laisser incuber au moins cinq minutes, mais pas plus de 60 minutes, pour le développement de la couleur.Procédez à la mesure de l'absorbance à 590 nanomètres et à 450 nanomètres. N'oubliez pas d'utiliser de l'eau pour la mesure du blanc. Préparez un graphique d'étalonnage en divisant les valeurs d'absorbance nette à 590 nanomètres et à 450 nanomètres.Remarquez que la valeur zéro protéine doit être incluse comme point de données. Calculez la concentration de l'échantillon inconnu à partir de l'équation linéaire de la courbe d'étalonnage. Contrairement à l'absorbance à une longueur d'onde unique de 590 nanomètres, le rapport des valeurs d'absorbance à 590 nanomètres sur 450 nanomètres est linéaire par rapport à la concentration en protéine.La concentration en protéines de l'échantillon inconnu peut être simplement calculée à l'aide de l'équation linéaire de la courbe d'étalonnage. Toutefois, une précision accrue est obtenue en mesurant plusieurs dilutions de l'échantillon inconnu. À cet effet, préparez deux graphiques.Le premier est un graphique d'étalonnage pour l'échantillon témoin, avec les microgrammes de protéine sur l'axe des abscisses. Le second graphique concerne l'échantillon inconnu, avec les microlitres de l'échantillon initial non dilué sur l'axe des abscisses. La valeur correspondant au colorant seul doit être incluse dans les deux graphiques.La concentration en protéines de l'échantillon inconnu est déterminée en divisant la pente de l'échantillon inconnu par celle de l'étalon. Nous venons de vous montrer comment mesurer la concentration en protéines à l'aide d'un protocole de Bradford linéarisé amélioré. L'utilisation de cette procédure augmente considérablement la précision du dosage, améliore la sensibilité d'environ 10 fois et réduit significativement les interférences dues aux détergents lors de cette procédure.Il est important de se rappeler d'utiliser le témoin approprié, qui est l'eau plutôt que l'échantillon de colorant sans protéine. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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