Name: La transplantation de blastomères exprimant la GFP pour limagerie en direct sur le développement de la rétine et du cerveau dans les embryons de poissons zèbres chimériques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Apprenez la transplantation de blastomères GFP pour l'imagerie en direct du développement de la rétine et du cerveau chez Danio rerio. Cette méthode permet de suivre le comportement cellulaire dans des embryons chimériques normaux.

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Cette étude a été soutenue par un National Institutes of Health (NIH) Core Grant (5P30EY008098) et les fonds suivants au XW: des subventions du NIH et de la Recherche R01EY016099 visant à prévenir la cécité Prix du développement de carrière. Nous remercions Lathrop Kira à l&#39;aide de l&#39;imagerie confocale.

Jour 1. Préparation 1. Mettre en place des croix de poisson Mettre en place des croix paires du poisson zèbre dans la soirée. Pour empêcher l'accouplement au hasard avant l'heure désirée, l'utilisation des diviseurs de séparer les poissons féminins et masculins dans les cassettes d'accouplement. Exprimant la GFP poissons transgéniques sont utilisés comme une source de blastomères donateurs. La ligne pt104 transgéniques (Zou et al., 2008), utilisé ici, exprime la GFP omniprésent sous le contrôle du promoteur EF1. Expression de la GFP permet de visualiser les cellules du donneur par imagerie en temps réel. Autres lignes de poissons transgéniques qui expriment des protéines fluorescentes adaptée peut être utilisée pour des besoins spécifiques. 2. Préparer cunéiforme agarose des puits pour la tenue de l'embryon Verser fondu 1% d'agarose, préparée dans de l'eau d'œuf E3 (Westerfield, 2007), dans une boîte de Pétri. Float un moule en plastique qui a des protubérances en forme de coin sur la solution d'agarose et laisser la solution d'agarose complètement solidifié. Retirez soigneusement le moule et plongez le lit d'agarose avec de l'eau E3. 3. Préparer la transplantation d'aiguilles Utilisez un extracteur d'aiguilles verticales (David Kopf Instruments) à réglage de puissance de 11,5 à faire des aiguilles en tirant des pipettes capillaires en verre (instruments de précision du monde). Bonne pointes d'aiguille doit conique avec des arbres de long. Broyer les pointes d'aiguille à un angle de 45 degrés avec un broyeur Micro (Marishige) jusqu'à ce que les ouvertures en biseau de 40 45μm de diamètre interne sont obtenues (figure 1A). Pour nettoyer les pointes d'aiguille, de brancher un tuyau à l'extrémité émoussée de l'aiguille, connecter le tuyau à une seringue, puis aspirer et libérer une solution d'acide fluorhydrique à 10% jusqu'à ce que tous les débris visible est enlevée. Ensuite, lavez les pointes avec de l'eau distillée, suivi par l'éthanol 100%. Sécher à l'air jusqu'à ce que toutes les aiguilles s'évapore éthanol. Il est important de s'assurer que les conseils sont complètement sèches: éthanol résiduel va ruiner les aiguilles lors de l'étape de polissage à haute température. Pour adoucir et polir les aspérités de la pointes d'aiguille, cuire les pointes d'aiguille avec la chaleur générée par le filament d'un faussaire Micro (Marishige). Ne laissez pas les pointes d'aiguille toucher le filament pendant le polissage. La quantité d'électricité passant à travers le filament et la distance entre le filament et les conseils d'aiguille peut être ajustée pour atteindre des conditions de chauffage souhaitée. La température ne doit pas être trop élevée: ce va fondre et déformer les pointes d'aiguille. Après les aspérités sont lissées, touchez délicatement le filament chauffé à la pointe de l'aiguille et tirez doucement le filament loin de l'aiguille pour générer une extrémité pointue (Fig. 1B). Une aiguille fine, lisse et propre est essentiel pour obtenir des blastomères intacts et les donateurs pour ne pas endommager les embryons hôtes. 4. Préparer une sonde embryon positionnement Tirez une pipette en verre sur une flamme de gaz pour obtenir une sonde de verre fines avec une extrémité lisse. Cette sonde sera utilisée pour la position de l'embryon dans le bon sens avant la transplantation. Jour 2. Blastomère la transplantation 1. Recueillir et embryons dechorionate Le lendemain, retirez les diviseurs dans les cassettes croisées pour permettre aux poissons de se reproduire. Placer les embryons dans une boîte de Pétri remplie d'eau E3. Puis, les embryons dechorionate manuellement en arrachant les chorions des embryons avec une paire de pinces fines. Utiliser une pipette en verre avec tige plié soigneusement transférer les embryons dans dechorionated agarose puits. Évitez tout contact de l'embryon avec l'air, qui causent les embryons à éclater. Laissez les embryons se développent à 28,5 ° C dans les puits d'agarose jusqu'à 3 heures après fécondation, ou HPF. 2. Mettre en place un dispositif de transplantation Alors que les embryons se développent, mis en place un dispositif de transplantation par raccordement de l'aiguille de transplantation à l'huile minérale remplie de micro-système de pompage. Assurez-vous que le système ne fuit pas et pas de bulles d'air emprisonnées dans le système. Retour de remplir l'aiguille de transplantation entier avec de l'huile minérale, à l'exception des 0,5 à 1 l de l'espace à l'ouverture. 3. La transplantation de blastomères Pour la transplantation blastomères, l'utilisation d'une sonde de positionnement de verre à orienter le côté blastomère de l'embryon 3-4-HPF vers le haut. Ensuite, insérez l'aiguille greffe dans un embryon de donateurs et lentement sucer 5-20 blastomères dans l'aiguille. Insérez l'aiguille blastomère rempli dans un embryon hôte et libérer les blastomères lentement. Le site sur lequel des blastomères sont libérés va influencer leur progéniture, où localiser à des stades ultérieurs de développement. Pour analyser le développement de la rétine et le cerveau, les cellules libèrent au pôle animal. Pendant la transplantation, assurez-vous que l'aiguille n'entre pas en contact de l'air. Afin de minimiser les dommages mécaniques, des embryons d'accueil doit être laissé dans les puits d'agarose à 28,5 ° C jusqu'au lendemain. Puis, transfert des embryons mosaïque pour plaques de 24 puits pré-enduits avec 0,5 ml d'agarose à 1%, avec un embryon dans chaque puits. 1 ml d'eau oeuf E3 est ajouté à chaque puits. Pour prévenir les infections bactériennes, ajouter 10 l de pénicilline et de streptomycine 100X à l'eau d'œuf E3. Jour 3. Intégration et de l'imagerie en direct d'embryons mosaïques 1. Embryons Embedding Préparer 1,5% d'agarose à faible point de fusion (LMP) dans de l'eau d'œuf E3 et maintenir la solution dans un bain d'eau à 30 ° C. Transfert d'un embryon mosaïque pour une boîte de culture tissulaire FluoroDish avec un fond de verre d'une épaisseur de 0.17mm (instruments de précision du monde). Enlever l'eau excédentaire E3 de quitter l'embryon juste couvertes par un montant minimal de l'E3. Ajouter 30-50 ul LMP fondue de 1,5% à l'embryon. Positionner rapidement l'œil ou le cerveau comme proche du fond de verre que possible avant que la solution d'agarose se solidifie. Après que la solution se refroidit, ajouter des solutions d'agarose pour sécuriser davantage les embryons en place. Ensuite, plonger le bloc solidifié agarose avec 2-3 ml d'eau oeuf E3. 2. Imagerie confocale Pour la microscopie confocale, un objectif à immersion dans l'eau inversé (Olympus, Planapo, 40 X/0.90 WLSM, Japon) avec profondeur de focalisation importante est utilisée. Une goutte d'eau est ajoutée à l'objectif et ensuite placer un plat du tissu FluoroDish la culture sur l'objectif. Pour le développement d'image, effectuez imagerie time-lapse en prenant des photos des embryons toutes les 5 minutes. Selon la nature des expériences, les intervalles de temps entre les prises doit être ajusté. Les résultats représentatifs La figure 2 illustre un représentant de poisson zèbre mosaïque de 24 HPF. Expression de la GFP met en évidence les cellules du donneur dans le vert. Les cellules de la rétine neuro durée de toute l'épaisseur du mur de la rétine. Le film montre les mouvements des cellules du donneur dans le cerveau hôte à 24 HPF. Avis cellules morphologies évoluent avec le temps. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Formes des pointes d'aiguille de la transplantation. A. L'ouverture en biseau de la pointe d'une aiguille était libre de débris après des lavages d'acide fluorhydrique. B. Une extrémité pointue a été généré à la pointe de l'aiguille. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Visualisation des cellules exprimant la GFP donateurs dans un embryons de poissons zèbres chimérique moins 24 HPF. Le panneau de gauche montre les signaux GFP dans le cerveau et la rétine. Le panneau du milieu est une image en champ clair de l'embryon. Le panneau de droite montre l'image fusionnée. Film 1. Live imagerie de cellules GFP positives donateurs a démontré l'étendue des changements dans la morphologie des cellules du cerveau neuroépithéliales cours du développement. Les images individuelles du film ont été recueillies toutes les 5 minutes entre 24 et 25 HPF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">Cliquez ici pour voir le film</a> .

<ol><li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%22">THE ZEBRAFISH BOOK</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li>
<li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li>
</ol>

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour la transplantation blastomère d&#39;analyser le développement de la rétine et du cerveau chez le poisson zèbre. Ce protocole peut également être utilisé pour analyser le développement des autres tissus et organes, simplement en libérant les blastomères donateurs à des emplacements correspondants dans les embryons hôte. L&#39;étiquetage avec des molécules GFP donne un nettoyant de fond que l&#39;étiquetage avec colorant fluorescent conjugué Dextran (Ho et Kane, 1990). C&...

L&#39;eau d&#39;œuf E3: <ul><li> 5 mM de NaCl </li><li> 0,17 mM de KCl </li><li> 0,33 mM de CaCl2 </li><li> 0,33 mM MgSO 4 </li><li> Bleu de méthylène 0,1% </li></ul>

la transplantation de blastomères exprimant la gfp pour l&#39;imagerie en direct sur le développement de la rétine et du cerveau dans les embryons de poissons zèbres chimériques

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cellules changement abondamment dans leurs emplacements et des biens lors de l&#39;embryogenèse. Ces changements sont réglementés par les interactions entre les cellules et leur environnement. Embryons chimériques, qui sont composés de cellules du fond génétique différent, sont d&#39;excellents outils pour étudier les interactions cellule-cellule médiée par des gènes d&#39;intérêt. La transparence des embryons de poisson zèbre au premiers stades de développement permet la visualisation directe de la morphogenèse des tissus et des organes au niveau cellulaire. Ici, nous démontrons un protocole visant à générer des rétines chimérique et le cerveau chez l&#39;embryon de poisson zèbre et d&#39;effectuer l&#39;imagerie en direct de cellules du donneur. Le protocole couvre la préparation des aiguilles greffe, la transplantation de blastomères exprimant la GFP donateurs à la GFP-négatif hôtes, et l&#39;examen du comportement des cellules des donneurs en microscopie confocale vivre. Avec de légères modifications, ce protocole peut également être utilisée pour étudier le développement embryonnaire des autres tissus et organes chez le poisson zèbre. Les avantages d&#39;utiliser la GFP aux cellules du donneur d&#39;étiquettes sont également discutés.

Nous démontrons un protocole visant à générer des embryons de poissons zèbres chimérique pour l&#39;imagerie cellulaire comportements direct durant l&#39;embryogenèse.

La transplantation de blastomères exprimant la GFP pour l&#39;imagerie en direct sur le développement de la rétine et du cerveau dans les embryons de poissons zèbres chimériques

Les cellules changent considérablement de localisation et de propriétés au cours de l'embryogenèse. Ces changements sont régulés par les interactions entre les cellules et leur...

Les blastomères sont les cellules embryonnaires formées au cours du stade de segmentation du développement. Ici, des blastomères marqués par la GFP sont transférés d'un embryon de poisson zèbre à un autre à l'aide d'une aiguille de transplantation. Cette méthode permet de suivre, par imagerie microscopique en temps réel, le comportement et le destin des cellules présentant des fonds génétiques modifiés au sein d'un embryon sinon normal, ou inversement.Bonjour, je suis le Dr Zoran, du laboratoire du Dr Shawe, au Département d'ophtalmologie de l'Université de Pittsburgh. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de transport de myèles mammaires chez l'embryon de poisson zèbre. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le développement de la rétine et du cerveau.Commençons donc. Le soir, mettez en place des croisements par paires de poissons zèbres afin d'éviter l'accouplement aléatoire. Avant l'heure souhaitée, utilisez des séparateurs pour isoler les poissons femelles des mâles. Ici.Les poissons transgéniques exprimant la GFP sont utilisés comme source de blastomères donneurs. La lignée transgénique PT 1 0 4 exprime de façon ubiquitaire la GFP sous le contrôle du promoteur EF one afin de préparer les puits d'agarose. Versez de l'agarose fondue à 1 %, préparée dans de l'eau pour œufs E three, dans une boîte de Pétri. Placez un moule en plastique doté de protrusions en forme de coin sur la solution d'agarose.Ensuite, laissez refroidir. Pour une solidification soigneuse, retirez le moule et immergez le lit d'agar dans de l'eau E3. Préparez ensuite les aiguilles de transplantation.Utilisez un tire-embryon vertical avec un réglage de puissance de 11,5 pour tirer des pipettes capillaires en verre. De bonnes pointes d'aiguille doivent présenter une forme effilée avec des tiges longues. Aiguisez les pointes d'aiguille à un angle de 45 degrés à l'aide d'un micro-aiguiseur jusqu'à l'obtention d'ouvertures biseautées dont le diamètre intérieur est compris entre 30 et 40 micromètres.Pour nettoyer les extrémités des aiguilles, fixez un tuyau à l'extrémité émoussée, reliez le tuyau à une seringue, puis aspirez et relâchez une solution d'acide fluorhydrique à 10 %. Répétez jusqu'à ce que tous les débris visibles soient éliminés. Rincez les extrémités avec de l'eau distillée.Ensuite, avec de l'éthanol à 100 %, séchez à l'air les aiguilles jusqu'à ce que tout l'éthanol se soit évaporé. Il est important de s'assurer que les extrémités soient parfaitement sèches. L'éthanol résiduel abîmerait les aiguilles lors du polissage à haute température.Deuxième étape : pour adoucir et polir les bords rugueux des pointes d'aiguille, faites-les chauffer à l'aide de la chaleur produite par le filament d'un micro-forgeur. Ne laissez pas les pointes d'aiguille toucher le filament pendant le polissage ; ajustez la quantité d'électricité traversant le filament ainsi que la distance entre le filament et l'aiguille. Les réglages peuvent être modifiés afin d'obtenir les conditions de chauffage souhaitées.La température ne doit pas être trop élevée. Cela risquerait de faire fondre et de déformer les extrémités des aiguilles après que les bords rugueux ont été lissés. Touchez délicatement le filament chauffé avec l'extrémité de l'aiguille, puis retirez doucement le filament afin d'obtenir une pointe effilée.Une aiguille fine, lisse et propre est essentielle pour obtenir des blastocystes donneurs intacts sans endommager les embryons hôtes. Tirez une pipette en verre au-dessus d'une flamme de gaz afin d'obtenir une sonde en verre fine dotée d'une extrémité lissée. Cette sonde servira à positionner les embryons dans l'orientation appropriée avant la transplantation.Le jour de l'expérience, retirer les séparateurs des boîtiers en croix pour permettre aux poissons de se reproduire. Huit. Après 30 minutes, recueillir de 100 à 200 embryons en les versant dans un filet. Placer les embryons dans une boîte de Pétri remplie d'eau E trois.Ensuite, à l’aide de fines pinces, décollez les embryons en arrachant manuellement les COR. Puis utilisez une pipette en verre à tige courbée pour transférer délicatement les embryons enrobés dans les puits d’un plateau aros. Veillez à ce que les embryons n’entrent pas en contact avec l’air, ce qui provoquerait leur rupture.Laisser les embryons se développer à 28,5 degrés Celsius dans les puits d'aros jusqu'à trois heures après la fécondation, ou HPF, pendant que les embryons se développent. Préparer un appareil de transplantation en reliant l'aiguille de transplantation à un système de micro-pompage rempli d'huile minérale. S'assurer que le système ne fuit pas et ne contient aucune bulle d'air piégée.Remplir entièrement l'aiguille de transplantation avec de l'huile minérale, sauf pour un espace de 0,5 à un microlitre au niveau de l'ouverture de la pointe. Retirer les embryons de l'incubateur et les placer sur la platine d'un microscope pour la transplantation du blasphème. Utiliser une sonde de positionnement en verre pour orienter vers le haut le côté blasphème des embryons âgés de trois à quatre HPF.Insérez ensuite délicatement l'aiguille de transplantation dans un embryon donneur et aspirez lentement cinq à vingt blastomères dans l'aiguille, en veillant à ce que la pointe de l'aiguille n'entre pas en contact avec l'air pendant la transplantation. Insérez l'aiguille chargée de blastomères dans un embryon hôte et libérez lentement les blastomères. L'emplacement où les blastomères sont libérés influencera la localisation de leurs cellules descendantes aux stades ultérieurs du développement ; pour analyser le développement rétinien et cérébral, libérez les cellules au pôle animal.Si le développement d'autres tissus et organes doit être analysé, différents emplacements de libération doivent être envisagés en conséquence. Afin de minimiser les dommages mécaniques pendant la transplantation, les embryons hôtes sont laissés dans les puits d'agros à 28,5 degrés Celsius jusqu'au lendemain. Ensuite, transférez les embryons mosaiques dans des plaques de 24 puits pré-enduites avec 0,5 millilitre de 1 %aros et remplies d'un millilitre d'eau pour œufs E trois.Un embryon doit être ajouté à chaque puits afin de prévenir les infections bactériennes avec 10 microlitres de pénicilline et de streptomycine à 100 x. Pour chaque puits, peser et préparer de l'agarose à bas point de fusion, ou LMP aros, et maintenir la solution dans un bain-marie à 30 degrés Celsius. Transférer un embryon mosaique dans une boîte de culture avec un fond en verre d'une épaisseur de 0,17 millimètre.Éliminer tout excès d’eau E3 afin que l’embryon soit juste recouvert. Ensuite, ajouter rapidement 30 à 50 microlitres de LMP à 1,5 % fondu à l’embryon avant que la solution ARO ne durcisse. Placer l’œil ou le cerveau aussi près que possible du fond en verre.Une fois la solution refroidie, ajoutez une solution d'agarose supplémentaire pour fixer davantage les embryons en place. Plongez le bloc d'agarose solidifié dans deux à trois millilitres d'eau pour œufs E3 pour la microscopie confocale. On utilise un objectif inverse à immersion dans l'eau 40 x doté d'une grande profondeur de foyer.Ajoutez une goutte d'eau sur l'objectif et placez une boîte de culture tissulaire pour préparation végétale sur la platine, puis faites le point pour développer l'image. Effectuez une imagerie en lapso-temporel en prenant des photos des embryons toutes les cinq minutes. Selon la nature des expériences, les intervalles de temps entre les prises de vue peuvent être ajustés.Ici, une image représentative d'un poisson séber à 24 HPF est présentée. L'expression de la GFP met en évidence les cellules donneuses en vert. Les cellules neuroépithéliales rétiniennes s'étendent sur toute l'épaisseur de la paroi rétinienne.Ce film montre les mouvements des cellules donneuses dans le cerveau hôte à 24 HPF. Remarquez comment la morphologie des cellules évolue au fil du temps. Montre simplement comment effectuer le transport miroir du sein chez le poisson zèbre.Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de préparer soigneusement une bonne aiguille sur la zone du sein destinée à la greffe. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.

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