Name: Détermination des tissus Utilisation de la transplantation Cap animale (ACT) Dosage dans Xenopus laevis /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Découvrez le test de détermination tissulaire par greffe de chapeau animal chez Xenopus laevis. Cette méthode permet d'étudier comment les produits géniques spécifient le destin cellulaire du derme primitif.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche pour prévenir la cécité (Bourses de développement de carrière à MEZ et ASV et une subvention sans restriction à du Département d&#39;ophtalmologie), la Fondation E. Matilda Ziegler (MEZ et ASV) et le National Eye Institute / NIH (MEZ , les subventions et R01EY015748 R01EY017964).

Partie I. Mise en place pour le test ACT <ol><li> Générer ARN coiffé d'injection tel que suggéré par le fabricant, en utilisant leur phénol: chloroforme méthode de purification (par exemple mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). ARN codant pour une protéine fluorescente est utilisée comme traceur. On supporte transcrire protéine fluorescente jaune (YFP) ou mCherry 5 ADNc, qui est dans un vecteur d'expression pCS2 +. </li><li> Tirez tubes en verre borosilicate capillaires pour former conseils verre conique à l'aide d'un extracteur micropipette. Nous utilisons Sutter Micropipette Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc, Novato, CA), comme décrit précédemment 6. </li><li> Assurez solutions stériles dans le tableau 1 à partir d'un 10 X Marc jour Ringer (ROR) solution mère (10 mM de MgCl2, 20 mM de KCl, 20 mM CaCl2, 50 mM d'HEPES, 1 M de NaCl, ajusté à pH 7,5, autoclave et stockés à RT). </li><li> Isoler les testicules d'un homme grenouille et le tissu stocker à 4 ° C dans une solution stérile de1X MMR / gentamicine (50 pg / ml de sulfate de gentamicine; BioWhittaker, Cat # 17-518Z). Cela peut se faire jusqu'à une semaine avant le début de l'expérience, mais il est perd de son efficacité au fil du temps. </li><li> Solution de ponte (1X: 150 mM de NaCl, 2,62 mM de KCl, 0,8 mM Na 2 HPO 4, 20 mM Trizma de base, 2,62 mM NaHCO 3 et 2,75 mM MgSO 4, ajusté à pH 7,6) peut être faite comme un stock 8X, qui peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu'à deux semaines. Remarque: attention à la contamination dans cette solution, car cela aura une incidence sur la qualité de vos oeufs. </li><li> Générer des plaques d'injection. Pour ce faire, faire fondre 1% d'agarose dans ROR 0.4x dans un micro-ondes, ajouter ~ 6 ml solution fondue agarose en 60 plaques mm, doucement dérouler un moule en élastomère (figure 1) au-dessus de la solution pour éviter les bulles et laisser refroidir pendant environ 20 minutes à température ambiante. Pour déterminer le nombre nécessaire, considérez le nombre de conditions expérimentales (par exemple 1, YFP, 2, YFP + Noggin) et le nombre de embry hôte transplanté OS besoin. Pour nos expériences, nous générons au moins 20 embryons transplantés d'accueil pour chaque condition expérimentale. À 18-19 ° C, les embryons seront à l'étape 15 pendant environ une heure. Si cela prend une heure pour effectuer 20 greffes, puis deux points dans le temps de fertilisation sont nécessaires, en supposant que les embryons hôtes acceptent toutes les greffes. Par conséquent, quatre plats d'injection sera nécessaire (2 conditions exp x 2 points dans le temps de fécondation = 4). Stocker les plaques à 4 ° C pendant une semaine. </li><li> Générer des plaques d'isolation en utilisant capitalisation agarose à 1% + 0,7 X MMR avec des moules que pour la plaque d'injection. Faire le même nombre de plaques d'isolation bouchon en plus une injection supplémentaire de points par unité de temps la fécondation (4 + 2 points dans le temps de fécondation = 6). </li><li> Injecter femelles avec 500 unités de gonadotrophine chorionique humaine en fin de journée la veille de la micro-injection. Boutique femelles à 16-18 ° C pendant la nuit. </li></ol> Partie II. La micro-injection d'ARN d'embryons de Xenopus laevis étape "&gt; A. Préparation de la micro-injection <ol><li> Retirer des femmes hormonale induite et les placer dans des réservoirs individuels contenant 1X ponte solution (ELS). Remarque: nous n'utilisons pas les œufs qui ont été dans les ELS plus de deux heures que la qualité des œufs est réduite. Par conséquent, environ une heure avant la fécondation in vitro, nous supprimons tous les œufs dans le bac afin que les œufs fraîchement pondus ne sont collectées. </li><li> Préparer l'aiguille pour la microinjection en coupant la pointe pour obtenir un diamètre de 25 à 35 um. Placer l'aiguille sur le picoinjector et l'étalonner de sorte qu'il distribue 10 nl par injection. </li><li> Définir un incubateur à 14 ° C. </li><li> Une fois que les femelles ont pondu pendant environ une heure, retirer les œufs dans le bac à l'aide d'une pipette de transfert et les placer dans des boîtes de 60 mm de Pétri. Enlever le ELS bien des œufs que possible et remplacer par 1X ROR. Les œufs peuvent être fécondés tout de suite ou rester dans ROR 1X pour jusqu'à une heure. Pour le dosage de transplantation, il estmieux pour fertiliser deux plats, 80% complets d'une seule couche d'œufs dans un maximum de trois lots distincts vers 11 h, midi et 13 heures. Après l'injection, ils seront placés à 14 ° C afin qu'ils atteignent les étapes souhaitées pour l'isolement du bouchon (stade 8,5 à 9) et de la transplantation (étape 15; voir Partie I, n ° 6 ci-dessus). </li><li> Pour vérifier la qualité des testicules, nous procédons à une fertilisation tôt le matin (~ 8 heures), ce qui nous permet d'extraire les testicules d'un autre mâle si le sperme du premier n'est pas viable. Note: nous homogénéiser ~ 0,25 testicules dans 1 ml MMR 1X et ajouter environ 5 à 7 gouttes par plaque d'ovocytes. </li><li> In vitro, la fécondation des oeufs avec des testicules homogénéisés et, une heure plus tard, enlever la couche de gelée sur les oeufs à l'aide de la gelée de solution (1M 164μl TNT + 10 ml de Tris 1M, pH 8,8 à 50 ml d'eau nanopure à l'autoclave). Attendez jusqu'à ce qu'ils atteignent deux cellules étape pour commencer le tri, ce qui prend environ 2 heures à 18 ° C ou 1,5 heures à température ambiante (22 ° C). </li><li> L'utilisation d'un transfoer pipette, en quelque sorte uniformément pigmentés et uniformément divisant embryons, comme indiqué dans le chapeau animale gauche de la figure 3, dans le puits d'injection d'un plat rempli de 0.4x ROR + 6% de Ficoll. </li></ol> Microinjection B. <ol><li> Étirer Parafilm sur le dessus du couvercle d'une boîte de Petri de 60 mm. Prélever 2 l de votre échantillon d'ARN d'abord sur le Parafilm et aspirer l'aide de la PLI-100 pour remplir votre aiguille d'injection. N'oubliez pas de vérifier que l'aiguille est encore distribuer 10 nL d'échantillon avant de commencer l'injection. </li><li> Injecter 20-30 embryons au stade de deux cellules (blastomères deux) avec 500 pg d'ARN YFP dans un plat et votre gène d'intérêt (par exemple 20 pg d'ARN Noggin) plus YFP ARN dans un autre plat 7. </li><li> Lieu 100-200 non injectables embryons par point de temps à autre plat d'injection de la solution de Ficoll. Les déplacer dans et hors de l'incubateur en même temps que les embryons injectés. Ce sont les hôtes qui seront utilisés dans la partie IV. </li><li> Après l'injection, incuber tous les embryons à 14 ° C overnight. Répétez l'opération pour tous les points dans le temps. </li></ol> Partie III. Isoler calottes animales à partir d'embryons injectés <ol><li> Arrivez tôt le matin pour organiser les embryons. Le point plus tôt devrait être à l'étape 9. Supprimer ceux qui n'ont pas survécu. Poursuivre avec les étapes de travail suivantes à chaque point dans le temps par lots. </li><li> Décanter la solution de Ficoll à partir de chaque assiette et ajouter MMR retour 0.7X / solution de gentamicine. Pour un plat d'isolation plafond, ajouter une quantité généreuse de 0,7 X MMR / gentamicine solution. Déloger les embryons de leurs puits d'injection de plat à l'aide d'une pipette de transfert et le placer dans le plat isolement bouchon fraîchement préparé. </li><li> Isoler calottes animales en 0.7X MMR solution + gentamicine, avec 2 ou 3 embryons intacts pour la mise en scène. Soit le Gastromaster, muni d'une pointe jaune plié à 400 um, ou une paire de pinces 5 Numéro forte peut être utilisé. </li><li> Placer des bouchons de retour dans 14 incubateur ° C jusqu'au lendemain. Les embryons d'accueil devraient être retirées de l'incubateuren même temps que les chapeaux de les garder au même stade de développement que le tissu du donneur. </li></ol> Partie IV. La transplantation de bouchons sur le flanc <ol><li> Retirer les capuchons et les embryons du point première fois de l'incubateur 14 ° C et organiser les embryons. Trier par uniformes jaune ou rouge fluorescent positifs casquettes, selon le traceur injecté (figure 2). </li><li> Comptez le nombre de caps et de supprimer le double du nombre d'étages 12 à 13 embryons dans un plat fraîchement préparée avec injection de 0,7 X MMR / gentamicine solution. Avec des pinces ° 5 pointues, retirez la membrane vitelline de chacun. Transférez-les sur la plaque avec les bouchons, mais soyez prudent. Sans leurs membranes vitellines, les embryons peuvent rapidement se dissocient à la surface de l'eau. </li><li> Utilisation de la gastromaster (pointe jaune, 200 250 pm fil plié, réglage le plus élevé) ou n ° 5 pinces, retirez de 200 um carrés sur le côté de l'embryon au stade 14-15 (figure 3). Ensuite, coupez un chapeau de moitié (à l'gastromaster ou til # 5 forceps) et de placer le tissu dans le trou pratiqué dans l'embryon hôte. Tournez l'embryon contre le bien pour permettre la cicatrisation. Faites cela pour que les embryons que vous pouvez alors qu'ils sont à l'étape 15. Répétez l'opération pour tous les points dans le temps. </li><li> L'embryon se guérissent habituellement dans les 30 minutes. Éliminer les cellules mortes (blanc) avec un léger mouvement de brossage avec une pince n ° 5. Cultivez-les à 18 ° C pendant la nuit. </li><li> Sous la loupe binoculaire à fluorescence, les embryons de tri avec marquée par fluorescence, tissu transplanté. Remettez-les à 18 ° C pour se développer jusqu'au stade 42-43. </li><li> Anesthésier les animaux dans tricaïne. À ce stade, vous pouvez prendre des photos sous un microscope à fluorescence de dissection. Une fois que vous avez terminé, fixer, section et coloration immunologique ou d'effectuer l'hybridation in situ en utilisant des marqueurs pour votre tissu d'intérêt. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Conception de plexiglass pour la coulée de la m élastomèreancien utilisé pour la fabrication des plats de détention d'embryons. A 38 x 38 mm carré aux angles arrondis (~ 5 mm de profondeur) a été acheminé sur un morceau de plexiglas qui est de 50 x 50 mm carré et de 25 mm d'épaisseur. Circulaire, régulièrement espacés les puits (1,5 mm de diamètre) ont été forés 1 mm de profondeur dans la matière plastique. Pour faire le moule en élastomère pour les plats micro-injection, nous avons versé élastomère Sylgard dans le plexiglas et lui a permis de se solidifier, selon les instructions du fabricant. Ce moule en élastomère est utilisé pour fabriquer des plaques d'isolation par injection et le chapeau. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Bouchon de tri des animaux avant la transplantation est importante, car l'expression peut varier. Bouchon animale sur la gauche exprime mCherry uniformément dans les tissus tandis que l'explant sur ​​le droit a l'expression inégale et seront rejetées. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Un hôte TADPole a développé une structure oculaire comme sur son flanc transplantés à partir de cellules de la coiffe des animaux. Une image fluorescente a été superposée sur l'image en fond clair.

<ol><li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+noggin%2C+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li>
<li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li>
<li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Methods+in+Developmental+Biology%3A+Xenopus+%26+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).</li>
<li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li>
</ol>

Dans cette vidéo, nous avons démontré notre version de techniques classiques utilisées par les biologistes de Xenopus, qui nous réarrangés pour créer le test greffe animale bouchon. A température ambiante, les embryons de xénope se développer très rapidement à travers les étapes 9 et 15. En les plaçant à 14 ° C, le développement de l&#39;embryon est ralentie et beaucoup d&#39;autres greffes peuvent être effectuées en une seule expérience. S&#39;il est nécessaire d&#39;augmenter les embryons de stades p...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd"><html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en"><div><table border="1"><thead><tr><th> Nom du produit </th><th> Type </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commenter </th></tr></thead><tbody><tr><td> mMessage mMachine SP6 Kit </td><td></td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM1340 </td><td></td><tr><td> Tubes capillaires en borosilicate (1.0mm x 0.5mm OD ID) </td><td></td><td> FHC, Inc </td><td> 27-30-1 </td><td></td><tr><td> Sutter Micropipette Puller </td><td></td><td> Sutter Instruments, Inc </td><td> P-97 </td><td></td><tr><td> Sulfate de gentamicine [50 mg / ml] </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> BW17-528Z </td><td></td><tr><td> Sylgard / Kit élastomère £ 1,1 </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> NC9644388 </td><td></td><tr><td>60 x 15 mm boîte de Pétri en polystyrène </td><td></td><td> USA Scientific </td><td> 8609-0160 </td><td></td><tr><td> gonadotrophine chorionique humaine </td><td></td><td> Intervet </td><td> 22219 </td><td></td><tr><td> Pico-injecteur systèmes de microinjection </td><td></td><td> Harvard Apparatus </td><td> 650003 </td><td></td><tr><td> Torrey Pines Scientific Incubateur ECHOtherm </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> 11-680-21 </td><td></td><tr><td> Transfert de pipette </td><td></td><td> Krackeler </td><td> 6290-20635A </td><td></td><tr><td> Dumostar ° 5 Pince </td><td></td><td> Pêcheur </td><td> 11295-10 </td><td></td></tbody></table></div>

détermination des tissus utilisation de la transplantation cap animale (act) dosage dans<em&gt; xenopus laevis</em

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

De nombreuses protéines jouent un double rôle dans le développement embryonnaire. Celles qui régissent la détermination du destin cellulaire dans un tissu spécifique peut également affecter le développement d&#39;une grande région de l&#39;embryon. Cela rend la définition de son rôle dans un tissu particulier difficile à analyser. Par exemple,<em&gt; Caboche</em&gt; Surexpression dans<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons provoque la dilatation de l&#39;ensemble de la région antérieure, y compris l&#39;oeil<sup&gt; 1,2</sup&gt;. De ce fait, on ne sait pas si Noggin joue un rôle direct dans la détermination de l&#39;œil ou en provoquant une expansion du tissu neural, Noggin affecte indirectement la formation de l&#39;œil. Ayant ce phénotype complexe rend l&#39;étude de son œil le rôle spécifique dans la détermination du destin cellulaire difficiles à analyser. Nous avons développé un test qui permet de surmonter ce problème. Profitant du caractère pluripotent de l&#39;<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Animaux bouchon<sup&gt; 3</sup&gt;, Nous avons développé un test pour tester l&#39;aptitude du produit du gène (s), comme<em&gt; Caboche</em&gt; Ou les facteurs de transcription (oeil de champ EFTFs), pour transformer les bouchons dans un tissu particulier ou des types de cellules en transplantant ce tissu sur le côté de l&#39;embryon<sup&gt; 4</sup&gt;. Bien que nous ayons constaté qu&#39;il s&#39;agisse du traitement de protéine Noggin ou un ensemble de facteurs de transcription peuvent déterminer le destin des cellules rétiniennes dans les calottes animales, cette procédure pourrait être utilisée pour identifier le produit du gène (s) impliqué dans la spécification d&#39;autres tissus ainsi.

Animaux bouchons surexprimant le produit du gène (s) sont transplantées dans le flanc de développement<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons afin d&#39;établir si le tissu est déterminée.

Détermination des tissus Utilisation de la transplantation Cap animale (ACT) Dosage dans<em&gt; Xenopus laevis</em

De nombreuses protéines jouent un double rôle dans le développement embryonnaire. Celles qui régulent la détermination du destin cellulaire dans un tissu spécifique peuvent également affecter le développement...

L'objectif général du test A CT est de déterminer si un gène ou plusieurs gènes d'intérêt peuvent diriger la derme primitive vers un destin cellulaire particulier. La procédure commence par une surexpression des ARN codant pour un gène rapporteur fluorescent et le gène ou les gènes d'intérêt dans des embryons en développement de XUS lavis. L'étape suivante consiste à disséquer le cap animal ou l'odum primitif exprimant les ARN surexprimés, puis à les faire croître jusqu'au stade 15.La troisième étape de la procédure consiste à retirer un tissu sur le flanc d'un embryon hôte au stade 15. La dernière étape consiste à transplanter la moitié du tissu du blastopore donneur sur le flanc de l'embryon hôte et à faire développer l'hôte jusqu'au stade 42 à 43. Les résultats montrent la formation de tissus ectopiques, tels que des structures semblables à des yeux, grâce à des coupes histologiques et à une immunomarquage pour des marqueurs spécifiques aux tissus.Bonjour, je suis et sine du Département d'ophtalmologie de l'Université médicale d'Upstate. Aujourd'hui, je vais vous présenter une procédure que nous appelons le test de greffe de calotte animale, que j'ai développé en collaboration avec Mike Suber. Nous utilisons ce test dans nos deux laboratoires pour étudier les gènes suffisants pour la formation de l'œil.Commençons. Pour commencer cette procédure, préparez les ARN de coiffe destinés à l'injection en transcrivant la noggin ou un autre gène d'intérêt, ainsi que la YFP qui servira de traceur. Préparez également les solutions à base de MMR, un stock de solution de ponte à 8 x et les aiguilles pour injecter les embryons.Un moule en élastomère sur mesure est utilisé pour fabriquer des boîtes de maintien des embryons. Préparez une plaque d'injection par condition expérimentale en faisant fondre 1 % d'AROS dans du 0,4 XMMR au micro-ondes. Transférez environ six millilitres de la solution dans une plaque de 60 millimètres.Placer délicatement un moule en élastomère au-dessus de la solution pour éviter les bulles et laisser refroidir environ 20 minutes. À température ambiante, préparer une plaque d'isolement de bouchon par condition expérimentale, en utilisant 1 % d'AGROS plus 0,7 XMMR avec des moules, comme vient d'être montré pour les plaques d'injection. Préparer des plaques supplémentaires pour chaque point temporel.Consulter le protocole écrit accompagnant pour les détails concernant le calcul des points temporels. Ensuite, isoler. Tester ces échantillons à partir d'une grenouille mâle et conserver le tissu à quatre degrés Celsius dans une solution stérile de 1 XMMR supplémentée avec 50 microgrammes par millilitre de gentamicine.Cela peut être effectué jusqu'à une semaine avant le début de l'expérience, mais notez que les spermatozoïdes perdent de leur efficacité avec le temps ; effectuez cette étape tard dans la journée, la veille de la microinjection. Injectez les femelles avec 500 unités de gonadotrophine chorionique humaine. Placez les femelles à une température de 16 à 18 degrés Celsius pendant la nuit.Tout est désormais prêt pour la microinjection le jour suivant. Commencez par retirer les femelles induites hormonalement et placez-les dans des aquariums individuels contenant un XELS. Préparez l'aiguille pour la microinjection en coupant la pointe.Pour obtenir un diamètre de 25 à 35 micromètres, placez l'aiguille sur l'injecteur pico PLI 100 et étalonnez-le afin qu'il délivre 10 nanolitres par injection. Réglez un incubateur à 14 degrés Celsius en plaçant la sortie à cette température plus basse ; après injection d'ARN, le développement de l'embryon est ralenti et beaucoup plus de greffes peuvent être réalisées dans une même expérience. Environ une heure avant la fécondation, retirez les œufs du réservoir. Une fois que les femelles ont pondu des œufs pendant une heure supplémentaire, utilisez une pipette de transfert pour retirer les œufs fraîchement pondus du réservoir.Ne pas utiliser les œufs qui ont séjourné dans la solution ELS pendant plus de deux heures. Comme la qualité des œufs diminue, placer les œufs dans des boîtes de Pétri de 60 millimètres. La boîte est remplie à environ 80 % d'une couche unique d'œufs.Retirez autant que possible d'ELS des œufs et remplacez par un XMMR. Les œufs peuvent rester dans un XMMR jusqu'à une heure. Ensuite, fécondez in vitro les œufs avec des testicules homogénéisés.Il est préférable de féconder les embryons en trois lots séparés vers 11 h, midi et 13 h afin qu'ils puissent atteindre le stade désiré : 8,5 à 9 pour l'isolement des calottes animales et le stade 15 pour la greffe. Une heure après la fécondation des œufs, retirez la gaine gélatineuse à l'aide de la solution D jelly. Rincez abondamment avec du MMR 0,1 X, puis attendez que les œufs fécondés atteignent le stade à deux cellules.Pour commencer le tri, préparez une boîte d'injection remplie de 0,4 XMMR plus 6 %F ccal. Une fois que les embryons ont atteint le stade à deux cellules, utilisez une pipette de transfert pour trier les embryons uniformément pigmentés et se divisant régulièrement dans la cavité de la boîte d'injection.Passez à l'étape d'injection microscopique : étirez d'abord le profilé par-dessus le couvercle d'une boîte de Pétri de 60 millimètres. Déposez deux microlitres de l'échantillon d'ARN sur le biofilm à l'aide d'une pipette, puis aspirez. Utilisez l'injecteur pico pour remplir l'aiguille d'injection.Veillez à vérifier que l'aiguille distribue toujours 10 litres d'échantillon avant de commencer l'injection. L'ARN est injecté dans les deux blastomères d'un embryon au stade deux cellules. Injectez 20 à 30 embryons, chacun avec 500 picogrammes d'ARN-Y-F-P, et placez-les dans une même boîte. Injectez encore 20 à 30 embryons, chacun avec 20 picogrammes de Nain, ARN pré-mélangé avec Y-F-P-R-N-A, et placez-les dans une boîte. En outre, placez 100 à 200 embryons non injectés par point temporel dans une autre boîte d'injection contenant la solution FICO. Transférez ces embryons dans et hors de l'incubateur au même moment que les embryons injectés.Il s'agit des hôtes à utiliser pour la transplantation des carpophores après injection. Incuber tous les embryons à 14 degrés Celsius pendant la nuit. Répéter pour tous les points temporels prévus.Après l'incubation nocturne, le blastopore animal peut être isolé. Arrivez tôt le matin pour stager les embryons. N'oubliez pas de retirer les embryons hôtes non injectés de l'incubateur également.Le premier point temporel doit correspondre au stade neuf. Commencez par éliminer les embryons qui n'ont pas survécu. Procédez ensuite à l'isolement des calottes animales à partir des embryons viables, en traitant chaque point temporel par lots dans une boîte de culture dédiée à l'isolement des calottes.Ajouter une quantité généreuse de solution XMMR 0,7 X plus de la gentamicine. Ensuite, verser la solution fol sur chaque plaque contenant les embryons injectés et rajouter de la solution XMMR 0,7 X plus de la gentamicine. Détacher les embryons de leurs puits dans la boîte d'injection à l’aide d’une pipette de transfert et les placer dans la boîte d’isolement de cap préparée fraîchement.Utilisez soit le gastro master équipé d'une pointe jaune courbée à 400 micromètres, soit une paire de forceps fins numéro cinq pour isoler les calottes animales dans une solution de 0,7 XMMR additionnée de gentamicine. Conservez deux ou trois embryons intacts pour le stadage. Après avoir isolé les calottes animales, remettez-les dans l'incubateur à 14 degrés Celsius avec les embryons hôtes jusqu'au lendemain, moment où les calottes seront transplantées sur le flanc des embryons hôtes.Retirer les calottes et les embryons hôtes du premier point temporel à partir de l’incubateur à 14 degrés Celsius et stader les embryons pour sélectionner les calottes uniformément positives au marquage fluorescent. Compter le nombre de calottes et les retirer. Doubler le nombre d’embryons hôtes dans une boîte d’injection fraîchement préparée contenant une solution de 0,7 XMMR additionnée de gentamicine, à l’aide de pinces n°5 effilées.Retirez la membrane de Lene de chaque embryon donneur. Transférez-les dans la plaque avec les capsules, mais manipulez-les avec précaution en l'absence de leurs membranes de Lene. Les embryons peuvent rapidement se dissocier à la surface de l'eau à l'aide du gastro maître équipé d'une pointe jaune munie d'un fil métallique courbé de 200 à 250 micromètres en réglage maximal, ou à l'aide de pinces de numéro cinq.Retirez un carré de 200 micromètres sur le côté de l'embryon au stade 14 à 15. Ensuite, à l’aide du gastro master ou de la pince numéro cinq, coupez un capuchon en deux et placez le tissu dans l’ouverture pratiquée dans l’embryon hôte.Faites pivoter l'embryon contre la cavité pour permettre la cicatrisation. Effectuez cette manipulation pour autant d'embryons que possible pendant qu'ils sont au stade 15. Répétez pour tous les points temporels.L'embryon guérit généralement en 30 minutes. À l’aide de la pince numéro cinq, retirez les cellules mortes, qui apparaissent blanches, par un léger mouvement de brossage. Faites développer les embryons transplantés à 18 degrés Celsius pendant la nuit.Après l'incubation nocturne, travailler sous microscope stéréofluorescent pour trier les embryons présentant un tissu transplanté marqué de manière fluorescente. Remettre les embryons sélectionnés à 18 degrés Celsius pour les laisser croître jusqu'au stade 42 à 43. Lorsque les animaux atteignent le stade souhaité, les anesthésier dans du trica et les examiner sous un microscope stéréofluorescent, puis prendre des photographies.Les embryons transplantés peuvent ensuite être fixés, sectionnés et immunomarqués, ou l'on peut réaliser une hybridation in situ en utilisant des marqueurs pour un tissu d'intérêt. Voici des résultats représentatifs d'une têtard hôte présentant un tissu donneur exprimant un traceur fluorescent et la noggin un jour après la transplantation. Remarquez comment le tissu s'arrondit sur le côté du têtard.Les embryons hôtes ayant reçu un tissu donneur contrôlé exprimant uniquement le traceur fluorescent commencent déjà à intégrer les cellules du chapeau animal sur leur flanc. Quelques jours plus tard, les têtards ayant reçu des cellules donneuses exprimant nain forment des structures semblables à des yeux sur leur côté, tandis que les têtards ayant reçu le tissu donneur témoin présentent des cellules fluorescentes à la surface de leur peau. Nous venons de vous montrer comment réaliser le test de greffe du chapeau animal chez Zaps Lavis.Lorsque vous réalisez ce dosage, il est important de tout préparer à l'avance afin que les embryons ne se développent pas plus vite que vous ne pouvez les traiter. Voilà tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Xenopus embryonnaire épithéliums sont un système modèle idéal pour étudier les comportements cellulaires tels que le développement de polarité et changer de forme lors de la morphogenèse épithéliale. Histologie classique d'échantillons fixe est de plus en plus complétée par des cellules vivantes imagerie confocale. Ici nous démontrons méthodes pour isoler les tissus de grenouilles et de visualiser en direct les cellules épithéliales et de leur cytosquelette des cellules vivantes en utilisant la...

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