Détermination des tissus Utilisation de la transplantation Cap animale (ACT) Dosage dans Xenopus laevis

L’objectif global du test A CT est de tester si un ou plusieurs gènes d’intérêt peuvent spécifier le derme primitif vers un destin cellulaire particulier. La procédure commence par la surexpression des ARN dans le codage du gène rapporteur fluorescent et du ou des gènes d’intérêt dans le développement des embryons XUS lavis. L’étape suivante consiste à disséquer la calotte animale ou odum primitif exprimant les ARN surexprimés et à les faire croître jusqu’au stade 15.

La troisième étape de la procédure consiste à prélever du tissu sur le flanc d’un embryon hôte de stade 15. La dernière étape consiste à transplanter la moitié du tissu de la coiffe animale du donneur sur le flanc de l’embryon hôte et à faire croître l’hôte jusqu’au stade 42 à 43. Les résultats montrent la formation de tissus ectopiques tels que des structures semblables à des yeux par sectionnement et immunocoloration pour des marqueurs tissulaires spécifiques.

Bonjour, je suis au département d’ophtalmologie de l’Upstate Medical University. Aujourd’hui, je vais vous montrer la procédure que nous appelons le test de greffe de chapeau animal que j’ai développé en collaboration avec Mike Suber. Nous utilisons ce test dans nos deux laboratoires pour étudier les gènes qui sont suffisants pour la formation de l’œil.

Alors commençons. Pour commencer cette procédure, préparez les ARN de la coiffe pour l’injection, transcrire la caboche ou un autre gène d’intérêt et YFP à utiliser comme traceur. Préparez également les solutions à base de ROR, un stock de huit x solution de ponte d’œufs et les aiguilles pour l’injection des embryons.

Un moule en élastomère sur mesure est utilisé pour la fabrication de plats de conservation d’embryons. Générer une plaque d’injection par condition expérimentale en faisant fondre 1 % d’AROS dans 0,4 XMMR dans un micro-ondes. Transférez environ six millilitres de la solution dans une plaque de 60 millimètres.

Placez délicatement un moule en élastomère sur la solution pour éviter les bulles et laissez refroidir pendant environ 20 minutes. À température ambiante, générez une plaque d’isolation de capuchon par condition expérimentale, en utilisant 1 % d’AGROS plus 0,7 XMMR avec des moules, comme cela vient d’être montré pour les plaques d’injection. Préparez des assiettes supplémentaires pour chaque point temporel.

Consultez le protocole écrit ci-joint pour plus de détails sur le calcul des points de temps. Isolez ensuite. Testez-les sur une grenouille mâle et conservez le tissu à quatre degrés Celsius dans une solution stérile d’un XMMR complétée par 50 microgrammes par millilitre de gentamycine.

Cela peut être fait jusqu’à une semaine avant le début de l’expérience, mais notez que les spermatozoïdes perdent de leur efficacité avec le temps, tard dans la journée la veille de la micro-injection. Injectez aux femelles 500 unités de gonadotrophine chorionique humaine. Placez les femelles à une température de 16 à 18 degrés Celsius pendant la nuit.

Maintenant, tout est prêt pour la micro-injection du lendemain. Commencez par retirer les femelles induites par l’hormone et placez-les dans des réservoirs individuels contenant un XELS. Préparez l’aiguille pour la micro-injection en coupant la pointe.

Pour obtenir un diamètre de 25 à 35 micromètres, placez l’aiguille sur l’injecteur pico PLI 100 et calibrez-la pour qu’elle distribue 10 nanolitres par injection. Réglez un incubateur à 14 degrés Celsius en plaçant la sortie à cette température plus basse après leur avoir injecté de l’ARN, le développement de l’embryon est ralenti et de nombreuses autres greffes peuvent être effectuées en une seule expérience environ une heure avant la fécondation, retirez les ovules du réservoir. Une fois que les femelles ont pondu des œufs pendant une heure supplémentaire, utilisez une pipette de transfert pour retirer les œufs nouvellement pondus de l’aquarium.

Notez de ne pas utiliser d’œufs qui ont été dans la solution ELS pendant plus de deux heures. Au fur et à mesure que la qualité des œufs diminue, placez les œufs dans des boîtes pétro de 60 millimètres. Le plat est rempli à environ 80 % d’une seule couche d’œufs.

Retirez autant d’ELS que possible des œufs et remplacez-les par un XMMR. Les œufs peuvent rester dans un XMMR jusqu’à une heure. Ensuite, fécondez in vitro les ovules avec des testicules homogénéisés.

Il est préférable de féconder les embryons en trois lots distincts vers 11h00 midi et 13h00 afin qu’ils puissent atteindre le stade souhaité. 8,5 à neuf pour l’isolement du chapeau et stade 15 pour la transplantation. Une heure après la fécondation des œufs, retirez la couche de gelée sur les œufs à l’aide de la solution de gelée D avec des quantités copieuses de 0,1 XMMR, puis attendez que les œufs fécondés atteignent le stade de deux cellules.

Pour commencer le tri. Préparez un plat d’injection rempli de 0,4 XMMR plus 6 % C F. Une fois que les embryons atteignent le stade de deux cellules, utilisez une pipette de transfert pour trier les embryons uniformément pigmentés et divisés uniformément dans le puits de la boîte d’injection.

Procéder à la micro-injection : étirer d’abord le perfil sur le dessus d’un couvercle de boîte pétro de 60 millimètres. Piquez deux microlitres de l’échantillon d’ARN sur le biofilm et aspirez. Utilisation du pico-injecteur pour remplir l’aiguille d’injection.

Assurez-vous de vérifier que l’aiguille distribue toujours 10 litres d’échantillon avant de commencer l’injection. L’ARN est injecté dans les deux blasters sur un embryon à deux stades cellulaires. Injectez 20 à 30 embryons avec chacun 500 picogrammes de Y-F-P-R-N-A et placez-les dans une boîte.

Injectez 20 à 30 autres embryons avec chacun 20 picogrammes de Nain, ARN prémélangé avec Y-F-P-R-N-A et placez-les dans la boîte. De plus, placez 100 à 200 embryons injectés par point temporel dans une autre boîte d’injection contenant la solution FICO. Faites entrer et sortir ces embryons de l’incubateur en même temps que les embryons injectés.

Ce sont les hôtes à utiliser pour le repiquage des coiffes après injection. Incuber tous les embryons à 14 degrés Celsius pendant la nuit. Répétez l’opération pour tous les points temporels prévus.

Après l’incubation d’une nuit, le chapeau de l’animal peut être isolé. Arrivez tôt le matin pour stadifier les embryons. N’oubliez pas de retirer également les embryons hôtes injectés de l’incubateur.

Le point temporel le plus proche devrait être à l’étape neuf. Tout d’abord, retirez les embryons qui n’ont pas survécu. Procédez à l’isolement des chapeaux animaux des embryons viables, en travaillant avec chaque point temporel par lots dans une boîte d’isolement du chapeau.

Ajoutez une quantité généreuse de solution de gentamycine 0,7 XMMR plus . Versez ensuite la solution de fol de chaque plaque contenant les embryons injectés et ajoutez à nouveau 0,7 XMMR plus une solution de gentamycine. Délogez les embryons de leurs puits de boîte d’injection à l’aide d’une pipette de transfert et placez-les dans la boîte d’isolement du capuchon fraîchement préparée.

Utilisez soit le gastro master équipé d’une pointe jaune pliée à 400 micromètres, soit une paire de pinces pointues numéro cinq pour isoler les capuchons d’animaux dans une solution de 0,7 XMMR plus Gentamycin. Conservez deux ou trois embryons intacts pour la stadification. Après avoir isolé les chapeaux d’animaux, remettez-les dans l’incubateur à 14 degrés Celsius avec les embryons hôtes jusqu’au lendemain, lorsque les chapeaux sont transplantés sur le flanc des embryons hôtes.

Retirez les capuchons et les embryons hôtes dès le premier point temporel de l’incubateur à 14 degrés Celsius et préparez le tri des embryons pour obtenir des capuchons positifs fluorescents uniformes. Comptez le nombre de capuchons et retirez-les. Doublez le nombre d’embryons hôtes dans une boîte d’injection fraîchement préparée avec une solution de 0,7 XMMR plus Gentamycine avec une pince pointue numéro cinq.

Retirez la membrane Lene de chaque embryon hôte. Transférez-les dans l’assiette avec les bouchons, mais attention sans leurs membranes de lène. Les embryons peuvent se dissocier rapidement à la surface de l’eau à l’aide du gastro master équipé d’une pointe jaune avec un fil plié de 200 à 250 micromètres au réglage le plus élevé ou à l’aide d’une pince numéro cinq.

Retirez un carré de 200 micromètres sur le côté de l’embryon aux stades 14 et 15. Puis à nouveau à l’aide du gastro master ou de la pince chiffre cinq. Coupez un chapeau en deux et placez le tissu dans le trou pratiqué dans l’embryon hôte.

Faites pivoter l’embryon contre le puits pour permettre la guérison. Faites-le pour autant d’embryons que possible pendant qu’ils sont au stade 15. Répétez l’opération pour tous les points temporels.

L’embryon guérit généralement en 30 minutes. Et à l’aide de la pince numéro cinq, retirez les cellules mortes qui apparaissent blanches avec un léger mouvement de brossage. Faites pousser les embryons transplantés à 18 degrés Celsius pendant la nuit.

Après l’incubation d’une nuit, passez au microscope à fluorescence dissectionnelle pour trier les embryons avec des tissus transplantés marqués par fluorescence. Remettez les embryons sélectionnés à 18 degrés Celsius pour qu’ils grandissent jusqu’au stade 42 à 43. Lorsque les animaux atteignent le stade souhaité, anesthésiez-les dans des triques et examinez-les sous un microscope à disséquation de fluorescence et prenez des photos.

Les embryons transplantés peuvent ensuite être fixés, sectionnés et immuno-marqués, ou on peut effectuer une hybridation in situ à l’aide de marqueurs pour un tissu d’intérêt. Voici les résultats représentatifs d’un têtard hôte avec du tissu donneur exprimant un traceur fluorescent et une caboche un jour après la transplantation. Remarquez comment le tissu se boule sur le côté du têtard.

Les embryons hôtes recevant du tissu de donneur contrôlé exprimant uniquement le traceur fluorescent commencent déjà à incorporer les cellules de la coiffe animale sur leur flanc. Quelques jours plus tard, les têtards recevant des cellules donneuses exprimant le nain forment des structures semblables à des yeux sur leur côté, tandis que les têtards recevant le tissu du donneur témoin ont des cellules fluorescentes à la surface de leur peau. Nous venons de vous montrer comment effectuer le test de greffe de chapeau animal dans Zaps Lavis.

Lors de la réalisation de ce test. Il est important de se rappeler que tout est prêt avant l’intervention du jour afin que les embryons ne se développent pas plus vite que vous ne pouvez les atteindre. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.