Name: Homogène de détection rapide des essais biologiques utilisant un support magnétique Système de modulation Biosensing (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Découvrez la détection homogène rapide de biomolécules par biosensing à modulation magnétique (MMB). Cette méthode sans lavage permet de détecter l'IL-8 avec sensibilité via un sandwich immuno-enzymatique utilisant des billes magnétiques et un marquage fluorescent.

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Ce travail a été partiellement financé par le Fonds Ishaya Horowitz.

IL-8 d'essai: <ol><li> Le mélange réactionnel comprenait les quatre composantes suivantes dans 100 ul volume final de tampon de dosage de leurs concentrations respectives. 10 ul de billes magnétiques avec des anticorps de capture à 100 billes / ul concentrations finales, 2 pl de l'IL-8 biotinylé anticorps à une concentration finale nano-gram/μl, 1 pl de streptavidine protéine fluorescente à 20 concentration finale nano-gram/μl, et 1 ul d'IL-8 cible à 0,48 pico-gram/μl. Les composants sont ajoutés un par un à la mémoire tampon de dosage et sont ensuite agité pendant 30 minutes. </li><li> Une réaction de contrôle est préparé de la même manière sans l'IL-8 cible. </li><li> Les réactions sont placés plus tard sans aucune séparation ou de lavage dans les cuvettes et inspectés en utilisant le système MMB. </li></ol> Système de MMB: <ol><li> Placer la cuvette dans sa position entre les deux pôles électromagnétiques. </li><li> Actionnez le courant de modulation et d'attendre 30 secondes pour permettre l'agrégation et la condensation des perles </li><li> Mesurer le signal de l'amplificateur lock-in à l'aide d'un oscilloscope. </li></ol> Les résultats représentatifs: L'inspection visuelle des grains agrégés présenté une nette différence entre la réaction avec la cible et la réaction sans la cible. Dans toutes les réactions avec la cible, les billes ont formé un seul agrégat dense qui se déplaçait dans et hors le faisceau laser de manière à s'unir. Cependant, dans tous la réaction sans la cible, les billes sont moins regroupées et leur mouvement a été moins s'unir (voir Figure 1). <img src="/files/ftp_upload/1935/1935fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: inspection visuelle de l'immuno-sandwich "(a) sans la cible IL-8 (b) Avec la cible d'IL-8. L'horloge de modulation poteau (jaune) et le signal de sortie du PMT (magenta) tout en détectant 0,48 pico-grammes d'IL-8 cibles sont présentés dans la figure 1 (a). La fréquence de modulation pour chaque pôle est à 2 Hz. Toutefois, comme il était théoriquement prévu, lorsque les billes passer le faisceau laser, le PMT détecte la lumière fluorescente et il ya un pic dans la tension de sortie du PMT. Par conséquent, la fréquence de démodulation est à 4 Hz. Lorsque le signal du PMT et l'horloge doublé de modulation (à 4 Hz) sont nourris à l'écluse de l'amplificateur, le détecteur de phase sensible détecte la synchronisation et les résultats à haute tension (voir Figure 2). <img src="/files/ftp_upload/1935/1935fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: (a) l'horloge de modulation (en jaune) et le signal de PMT (magenta) lorsque la détection 0,48 pico-grammes d'IL-8 cible. (B) Le blocage a entraîné tension de l'amplificateur à deux scans différents. Le verrouillage de l'amplificateur n'a pas détecté de signal lorsque l'échantillon de contrôle a été testé. Ce fait, avec la différence visuelle dans l'agrégation suggère que le système MMB peut clairement identifier la présence d'IL-8 cible.

<ol><li>Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+fluorescent-labeled+probes+at+sub-picomolar+concentrations+by+magnetic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation.</a> Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).</li>
<li>Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+homogenous+detection+of+the+Ibaraki+virus+NS3+cDNA+at+pico-molar+concentrations+by+magnetic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bio-Rad+%22Human+angiogenesis+assay+panel%22%22">Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel"</a>. , Bio-Plex Pro. Forthcoming.</li>
<li>Instruction Manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bio-Plex+Precision+Pro+Cytokine+Assay%22">Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay</a>. , Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.</li>
</ol>

En résumé, nous avons montré que le système MMB peut être utilisé pour détecter la présence d&#39;IL-8 cibles à faible concentration (0,5 pico-gramme est la limite de détection des tests de précision Bio-Plex cytokine pro [3,4]). La capacité du système ne se limite pas à l&#39;IL-8 et peut être utilisé pour détecter d&#39;autres protéines. Les avantages du système MMB sont la capacité à détecter la cible rapidement et sans aucune séparation ou de lavage. Ainsi, il facilite le processus de détection et permet au système ...

<table><tbody><tr><td>Kit Bio-Plex Pro Cytokine humaine IL-8</td><td>Bio-Rad</td><td>171-B5008M</td><td></td></tr><tr><td>Cible recombinante humaine IL-8</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>R202625</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal murin anti-IL-8 humaine biotinylé G265-8</td><td>BD Biosciences</td><td>554718</td><td></td></tr><tr><td>Protéine fluorescente couplée à la streptavidine</td><td>Bio-Rad</td><td>Streptavidin PE</td><td></td></tr></tbody></table>

homogène de détection rapide des essais biologiques utilisant un support magnétique système de modulation biosensing

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

Un système de modulation magnétique biodétection (MMB) [1,2] rapide et homogène détecté cibles biologiques à de faibles concentrations sans aucun lavage ou étape de séparation. Lorsque l&#39;IL-8 cible a été présent, une «sandwich&#39; essai basé sur des billes magnétiques attachés avec de l&#39;IL-8 anticorps de capture à la streptavidine couplée protéine fluorescente via l&#39;IL-8 et un objectif de l&#39;IL-8 biotinylé anticorps. Les billes magnétiques sont manoeuvré en mouvement oscillatoire en appliquant un gradient de champ magnétique alternatif à travers deux pôles électromagnétiques. Les protéines fluorescentes, qui sont attachés aux billes magnétiques sont condensés dans la zone de détection et leur mouvement dans et hors d&#39;un rayon laser orthogonaux produit un signal périodique fluorescent qui est démodulé en utilisant la détection synchrone. Le système de modulation magnétique biodétection a été précédemment utilisé pour détecter les séquences codantes de la protéine non structurale du virus Ibaraki 3 (NS3) de l&#39;ADN complémentaire (ADNc) [2]. Les techniques qui sont mises en évidence dans ce travail pour la manipulation extérieure et la condensation des particules peut être utilisé pour d&#39;autres applications, par exemple la livraison de médicaments à accouplement magnétique<em&gt; In vivo</em&gt; Ou améliorer le contraste pour<em&gt; In vivo</emLes applications d&#39;imagerie&gt;.

Magnétique de modulation biodétection système est utilisé pour rapidement, avec tact et simplement de détecter des dosages biologiques, tels que les molécules d&#39;ADN et des protéines.

Homogène de détection rapide des essais biologiques utilisant un support magnétique Système de modulation Biosensing

Un système de biosensage à modulation magnétique (MMB) [1,2] a permis de détecter rapidement et de manière homogène des cibles biologiques à de faibles concentrations sans aucun lavage ni...

La BIOSENSORIQUE par modulation magnétique, ou MMB, est une technique nouvelle permettant la détection de molécules biologiques. Ici, un test de principe est présenté, dans lequel l'interleukine huit est détectée lorsque l'interleukine huit, également appelée IL-8, est ajoutée à un mélange réactionnel contenant des billes magnétiques revêtues d'anticorps, d'anticorps anti-IL-8 marqués et de streptavidine marquée fluorescent. Un sandwich moléculaire est ainsi formé, reliant efficacement la molécule fluorescente à la bille magnétique.La réaction est placée dans un vortex et un champ magnétique alternatif. Des gradients sont appliqués via deux pôles électromagnétiques, qui mettent les billes en mouvement oscillatoire. Le mouvement périodique de la bille, avec les protéines fluorescentes fixées, entrant et sortant d'un faisceau laser orthogonal produit un signal fluorescent qui est recueilli par un PMT et démodulé.À l'aide d'un amplificateur synchrone, le mouvement des billes peut être visualisé à l'aide d'une caméra CCD ; un mouvement synchrone est observé dans les échantillons où les billes magnétiques ont été liées à des protéines fluorescentes via l'IL-8. Bonjour, je suis Adia du Laboratoire d'optique non linéaire et de laser du Département d'électronique physique de l'Université de Tel Aviv. Je suis NoGo du Département des sciences biologiques de l'Université de l'Illinois à Chicago, et je suis Marcelo Erlich du Département de recherche cellulaire et d'immunologie de l'Université de Tel Aviv.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une méthode de détection homogène rapide des dosages biologiques utilisant un système de détection biomoléculaire par modulation magnétique. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour détecter des protéines spécifiques et des séquences d'ADN à de faibles concentrations. Commençons donc.Commencez cette procédure en préparant et en étiquetant un tube pour chaque réaction, y compris un échantillon cible et un témoin non cible. Ajoutez dans chaque tube les composants suivants du test cytokinique Bio-Plex Precision Pro, un par un : billes magnétiques couplées, anticorps de détection IL-8, streptavidine-PE et cible IL-8. Ajustez le volume à 100 microlitres avec le tampon de dosage, puis agitez pendant 30 minutes sur un agitateur orbital compact.Après avoir agité les échantillons pendant 30 minutes à température ambiante, les placer directement dans des cuvettes pour analyse. À l’aide du système MMB, nettoyer les cuvettes transparentes avec un tissu de nettoyage pour lentilles et de l’éthanol à 70 %. L’appareil utilisé pour l’analyse comprend un laser à double fréquence de 488 nanomètres servant de source de lumière d’excitation, dirigé à l’aide d’un séparateur de faisceau dichroïque de 562 nanomètres vers une lentille d’objectif de microscope.L'objectif du microscope focalise le laser en un faisceau de 27 micromètres de diamètre dans un tube en verre silicaté BO de 400 micromètres de large. La lumière émise est filtrée spectralement à l'aide de deux filtres passe-bande successifs, puis détectée par un photomultiplicateur ou PMT et démodulée à l'aide d'un amplificateur synchrone. Un moduleur de courant maison est utilisé pour appliquer successivement une onde carrée à chaque électroaimant.L'amplitude doit être de 1,4 ampère avec une fréquence comprise entre un et six hertz, car les billes entrent et sortent du faisceau laser deux fois par cycle. La fréquence de démodulation de l'amplificateur synchrone est comprise entre deux et 12 hertz. Démarrer le système en tournant la clé du laser de 488 nanomètres vers la position marche et en enclenchant l'alimentation.Ensuite, réglez la puissance du laser au minimum, environ quatre à six milliwatts. Allumez l'oscilloscope, puis activez le PMT. Placez ensuite l'échantillon entre les deux pôles électromagnétiques.Utilisez le plateau rotatif du vete pour vous assurer que le faisceau laser traverse le vete sans heurter les parois du vete. Utilisez les plateaux de translation XY et Z du vete pour modifier sa position par rapport à l'objectif et aux pôles électromagnétiques. Pour optimiser le couplage de la lumière fluorescente dans le détecteur, le vete doit être positionné légèrement en arrière de la ligne des pôles.Réglez maintenant l'oscilloscope sur la mesure de la trace temporelle. Réglez le contrôle de gain du PMT à 0,5 volts. Ensuite, allumez le modulateur de courant et réglez la fréquence à trois hertz.Attendre 30 secondes pour permettre l'agrégation et la condensation des billes. Les billes magnétiques commenceront à osciller en se rapprochant de l'avant du tube. Lorsque le faisceau laser atteint les billes en oscillation, un scintillement de lumière laser réfléchie devrait être visible depuis les billes.Remarquez que les billes se déplacent plus rapidement lorsque la modulation du courant augmente et plus lentement lorsqu'elle diminue. La position des billes dans le tube peut être ajustée à l'aide de plateaux commandés par micromètre. Pour déplacer les pôles, le mouvement des billes peut être visualisé à l'aide d'une caméra CCD placée en remplacement du PMT.L'oscilloscope détecte le signal périodique provenant des billes couplées à un fluorochrome et enregistre le tracé temporel de l'oscilloscope. Les données enregistrées peuvent être analysées à l'aide de MATLAB. Des mélanges réactionnels avec et sans IL huit ont été analysés par MMB. Dans toutes les réactions contenant la cible, les billes ont formé un unique agrégat dense qui se déplaçait à l'intérieur et à l'extérieur du faisceau laser de manière synchrone.Cependant, en l'absence de cible, les billes étaient moins agrégées et leur mouvement était moins coordonné. Ici, l'horloge de modulation du pôle représentée en jaune et le signal de sortie du PMT représenté en magenta illustrent la fréquence de modulation pour chaque pôle à deux hertz. Par conséquent, la fréquence de démodulation est de quatre hertz, comme prévu théoriquement.Lorsque les billes traversent le faisceau laser, le PMT détecte la lumière fluorescente et un pic apparaît dans la tension de sortie du PMT lorsque le signal du PMT et l'horloge de double modulation sont envoyés à l'amplificateur synchrone. Le détecteur de phase sensible assure la synchronisation et produit une haute tension. Les deux couleurs indiquent deux balayages différents à la même concentration cible.Les lignes noires représentent la moyenne de chaque signal. L'amplificateur à détection synchrone n'a détecté aucun signal lors du test de l'échantillon témoin. L'amplificateur à détection synchrone n'a fourni aucun signal verrouillé pour ce cas.Ce fait, conjugué à la différence visuelle dans l'agrégation, suggère que le système MMB et la différence dans les mesures enregistrées dans le temps du signal de sortie du PMT peuvent clairement identifier la présence de la cible ILH. Nous venons de vous montrer comment détecter rapidement et de manière homogène des molécules biologiques en utilisant la modulation magnétique. Biosensing avec l'IL-8 comme exemple.Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de vous rappeler de respecter les consignes de sécurité relatives aux lasers. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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