Name: Microinjection dembryons Medaka pour être utilisé comme un organisme modèle génétique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Apprenez la microinjection d'embryons de médaka pour étudier la fonction des gènes en biologie du développement. Cette méthode permet de manipuler l'expression génique in vivo au niveau cellulaire.

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1. L'accouplement et la collecte des œufs <ol><li> Médaka féminine et masculine se distinguent facilement par la taille et la forme des nageoires dorsale et anale. Les nageoires anales des mâles sont plus grands et en forme de parallélogramme comparé à celui des femelles. La nageoire anale des femmes est plus petite et en forme de triangle. La nageoire dorsale mâle a une encoche visible profonde entre les deux derniers rayons. </li><li> Medaka pondre jusqu'à 40 oeufs tous les jours et les femelles portent des oeufs médaka regroupées à leur ventre par des filaments d'attache pendant plusieurs heures avant ils sont supprimés dans les usines dans le réservoir. </li><li> Les femelles peuvent être pris dans un filet et maintenu à l'intérieur délicatement des deux côtés d'une seule main. Les oeufs peuvent alors être légèrement taquiné par le ventre avec l'index de l'autre main. La femelle peut alors être renvoyé dans le réservoir. Les œufs doivent être transférés dans une boîte de Pétri de 6 cm remplis avec les médias embryon par une pince émoussée ou un doigt. </li><li> Paires Medaka se battent rarement quand ils sont conservés dans une boîte d'accouplement de petite taille. Par conséquent, ils peuvent être gardés dans un petit réservoir avec un débit d'eau afin qu'ils puissent être nourris et les oeufs peuvent être recueillies auprès de la même paire chaque jour pendant une couple de mois. </li><li> Il est important que les poissons femelles ne devraient pas être conservés sans les hommes, puisque l'ovulation se produit tous les jours chez les femelles, médaka. Sinon, les femelles ne peuvent pas offrir des oeufs et de devenir malade. </li></ol> 2. Nettoyage des embryons <ol><li> Transfert unclustered oeufs avec une pipette de verre pour poncer (grain P2000, imperméable) placé dans le couvercle d'une boîte de Pétri de 9 cm. Retirer l'excès, mais d'assurer moyenne un volume suffisant demeure pour éviter le dessèchement des embryons. </li><li> Roulez doucement sur le papier de verre en utilisant des embryons de l'index, appliquer une pression minimale et garder doigt parallèlement à la surface du papier de sable pour environ 45-60 secondes pour enlever une partie des poils surface externe du chorion. Ne pas rouler plus de 5-7 embryons à la fois cette précaution permettra de minimiser le risque d'écrasement des embryons en dessous de l'autre. </li><li> Transfert embryons nettoyé à un plat frais de milieu embryon. </li></ol> 3. Faire plaques d'agarose pour la tenue de l'embryon pendant la microinjection Les embryons sont maintenus dans des auges pendant l'injection faite avec un moule en plexiglas agarose à 1,5% (figure 1). La concentration d'agarose est important de tenir embryons correctement. <ol><li> Tout d'abord, faire un cadre d'agarose à tenir le moule en plexiglas. Verser agarose à 1,5% dans l'eau à une profondeur 0.5cm dans un plat 9cm de Petri et attendre qu'il se solidifie complètement. Découpez une zone de l'agarose simplement plus grande que la taille du moule. </li><li> Verser 1,5% d'agarose pour remplir la zone de coupe et placez le moule de façon à ce qu'aucune bulle sont piégés et attendre d'agarose se solidifie. Cette plaque d'agarose peuvent être stockés dans le réfrigérateur pour accélérer solidifaction. </li><li> Retirer le moule pour créer des auges pour tenir les oeufs. Ajouter suffisamment d'embryons moyenne de plonger le moule, couvrir et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Schéma du sur-mesure moule utilisé pour préparer les creux dans les plaques d'agarose pour la microinjection. </li></ol> 4. Microinjection d'embryons médaka Dans le médaka, ADN, ARN, oligonucléotides morpholino et colorants traceurs sont microinjectés travers le chorion dans le cytoplasme de la 1 à 64 cellules embryon au stade plutôt que le jaune que chez le poisson zèbre. Depuis le cytoplasme est plus petit et moins visible dans le médaka, la pratique en injectant des colorants tels que la rhodamine-dextran est recommandé de développer cette compétence. Ajout de rouge de phénol comme traceur est également encouragée pour permettre la confirmation des injections. Comme le chorion entourant embryons médaka est rude, une courte aiguille d'injection solide et large est nécessaire (figure 2). Préparer cette aiguille d'injection fort et large à partir d'un verre à filament contenant capillaire. <ol><li> Préparer la solution d'injection avec le rouge de phénol comme traceur et le charger dans l'aiguille de l'arrière avec un microloader Eppendorf. Connectez à l'aiguille de l'injecteur pompe à air. </li><li> Les œufs doivent être collectés et unclustered dès que possible après la fécondation d'injecter au stade d'une cellule. Plus embryons peuvent être injectés en les stockant sur la glace (pas plus de 30 minutes) pour arrêter la division cellulaire. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Comparaison des aiguilles medaka et le poisson-zèbre. Notez la pointe de l'aiguille MF (en haut) est plus courte et plus large donc plus forte pour percer le chorion difficiles entourant embryons médaka. </li><li> Transfert des œufs dans la plaque d'agarose et les aligner dans le creux avec une pince. Juste avant l'injection, cinq œufs doivent être tournés de façon la membrane cellulaire du cytoplasme d'une cellule peut être touché par ee l'aiguille perpendiculairement. Le cytoplasme de la cellule unique peut être trouvée par la recherche d'une zone dépourvue de petites gouttelettes d'huile qui est opposé au côté de l'œuf avec des gouttelettes d'huile plus dense. La zone identifiée peut être confirmé pour être le cytoplasme en regardant par le côté. </li><li> Placer la fermeture aiguille pour les oeufs. Ouvrez la pointe de l'aiguille en touchant doucement la pointe de l'aiguille pour le chorion ou en utilisant microforceps (figure 3). Une petite quantité de substance d'injection doit être vu de s'écouler. </li><li> Crevaison à travers le chorion de placer la pointe de l'aiguille à l'intérieur du chorion. Régler la pression de maintien de l'injecteur à être relativement élevé, afin de s'assurer qu'aucun reflux survient en raison de la forte pression sur la ponction à travers le chorion difficiles (les paramètres de 80-100hPA pour la pression holding et 500-700hPa pour la pression d'injection). </li><li> Insérer la pointe de l'aiguille dans le cytoplasme par une forte piquer sa membrane. Evitez d'insérer la pointe de l'aiguille dans le jaune. Contrairement poisson zèbre, matière injectée dans le jaune ne sera pas transféré dans le cytoplasme. Liquides injectés ont une frontière distincte lorsqu'il est injecté dans le jaune alors que la limite est floue lorsque dans le cytoplasme (figure 4). Parfois, l'aiguille peut être bloquée par agarose / débris. Pince peuvent être utilisés pour toucher / sauts de la fin de l'aiguille et retirer le blocage. Si l'aiguille se casse à tout moment pendant l'injection, le bullage sera vu dans le support d'embryon et la substance vous injectez seront perdues. Les injections doivent être effectuées systématiquement de haut en bas le long des canaux d'agarose et de gauche à droite dans le moule. </li><li> Embryons injectés doivent être transférés à un plat propre milieu contenant l'embryon et développés à la température appropriée. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Briser la pointe de l'aiguille avant l'injection. 1: Déplacer la pointe de l'aiguille à proximité du chorion de l'embryon; 2: Touchez le chorion et déplacer l'aiguille d'avant en arrière doucement à briser la pointe; 3: Quand une petite quantité de substance par injection s'écoule de l'extrémité de l'aiguille, ce qui confirme la rupture de la pointe. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Images représentant des embryons injectés médaka. Le panneau A montre une image représentative de l'injection correcte de la rhodamine-dextran dans le cytoplasme d'un embryon d'une cellule de phase de médaka. Groupe B montre une image représentative de l'injection incorrecte de la rhodamine-dextran dans le sac vitellin d'un embryon d'une cellule de phase de médaka. Panneaux C et D montrent les embryons à partir de panneaux A et B respectivement à environ 30 heures après l'injection. EM: embryon, antérieure est à la hausse dans les panneaux C et D et la vue est dorsale. Notez le corps de l'embryon dans le panneau D n'est pas rouge comme le colorant a été incorrectement injecté dans le sac vitellin. Les flèches en B et D indiquent la rhodamine-dextran injecté correctement dans le sac vitellin noter la frontière distincte circulaire. Les lignes en pointillé dans A et B indiquent aperçu du cytoplasme d'une cellule, vue latérale.

<ol><li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li>
<li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka+and+zebrafish%2C+an+evolutionary+twin+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).</li>
</ol>

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour traceur cellulaire, de l&#39;ARNm, l&#39;ADN ou anti-sens d&#39;injection d&#39;oligonucléotides en une seule cellule embryons médaka scène. Cette technique nous a permis d&#39;étudier divers processus de développement in vivo en temps réel. Ce processus et l&#39;analyse subséquente détaillées qu&#39;il offre a le potentiel d&#39;améliorer considérablement notre compréhension de l&#39;organogenèse des vertébrés et de la biologie cellulaire sous-jacent. Ces connaissances peuvent être importants pour, et le rendement des applications thérapeutiques en médecine régénérative.

<table><tbody><tr><td>Filet fin de 4&quot;</td><td>Outils</td><td>J K Aquatics Ltd.</td><td>MD001</td><td>Utilisé pour capturer les poissons lors de la récolte des œufs.</td></tr><tr><td>Milieu pour embryons</td><td>Réactif</td><td>Préparé en laboratoire</td><td></td><td>200 ml de solution mère 50X, 1 ml de bleu de méthylène à 1 % dans H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O/10 litres d’eau RO (solution mère 50X : NaCl 14,7 g, KCl 0,6 g, CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 2,4 g, MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 4,0 g/1 litre d’eau RO).</td></tr><tr><td>Papier de verre imperméable très fin – grain 2000</td><td>Outils</td><td>Hermes Abrasives Ltd.</td><td></td><td>Grain très fin pour rouler/nettoyer les embryons avec chorions.</td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>Outil</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-10F</td><td>Pour la fabrication d’aiguilles de microinjection.</td></tr><tr><td>Tireur de micropipettes</td><td>Équipement</td><td>Narishige International</td><td>Modèle PP-830</td><td>Pour la fabrication d’aiguilles de microinjection.</td></tr><tr><td>Microchargeur Eppendorf</td><td>Outil</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Pour charger les aiguilles de microinjection.</td></tr><tr><td>Appareil de microinjection</td><td>Équipement</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Modèle 5242.</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Équipement</td><td>Narishige International</td><td></td><td>Modèle MN151.</td></tr><tr><td>Plaque d’injection en agarose</td><td>Outils</td><td>Préparée en laboratoire</td><td></td><td>Pour maintenir les embryons pendant l’injection.</td></tr></tbody></table>

microinjection d&#39;embryons medaka pour être utilisé comme un organisme modèle génétique

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Dans cette vidéo, nous démontrons la technique de micro-injection dans une cellule embryons médaka scène. Medaka est un poisson d&#39;eau douce petite ponte qui permet des analyses génétiques et embryologiques et est l&#39;un des organismes modèles vertébrés dans lequel l&#39;ensemble du génome phénotype mutant axée écrans ont été effectuées 1, comme dans le poisson zèbre et la souris. Divergence de chevauchement fonctionnelle des gènes liés entre medaka et le poisson-zèbre permet l&#39;identification de phénotypes nouveaux qui ne sont pas identifiables dans une seule espèce 2, ainsi medaka et le poisson-zèbre sont complémentaires pour la dissection génétique du génome des vertébrés fonctions. Pour profiter de poissons médaka dont les embryons sont transparents et développer à l&#39;extérieur, la microinjection est une technique essentielle pour injecter des cellules-traceurs pour les cellules de l&#39;étiquetage, les ARNm ou oligonucléotides anti-sens pour les sur-exprimant et frapper vers le bas des gènes d&#39;intérêt, et d&#39;ADN pour faire lignées transgéniques.

Medaka et le poisson-zèbre sont complémentaires pour la dissection génétique du génome des vertébrés fonctions. Ce protocole met en évidence les points clés pour réussir la microinjection dans des embryons de medaka, une technique importante pour l&#39;analyse embryologique et génétique à l&#39;aide medaka et le poisson zèbre dans un laboratoire.

Microinjection d&#39;embryons Medaka pour être utilisé comme un organisme modèle génétique

Dans cette vidéo, nous démontrons la technique de micro-injection dans des embryons de medaka au stade d'une cellule. Le medaka est un petit poisson d'eau douce ovipare qui permet...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer la fonction d'un gène ou d'une protéine en perturbant les schémas d'expression normaux de votre gène ou protéine d'intérêt. Cela est réalisé en fabriquant d'abord le moule aros et les aiguilles d'injection. La deuxième étape de la procédure consiste à collecter des embryons intermédiaires au stade d'une seule cellule.La troisième étape de la procédure consiste à orienter les embryons au stade uniloculaire dans la position correcte pour l'injection. La dernière étape de la procédure consiste à injecter des traceurs cellulaires, des ARNm ou des oligonucléotides antisens dans les embryons midar au stade uniloculaire. Enfin, les résultats peuvent être obtenus par observation microscopique, révélant des modifications morphologiques, physiologiques ou moléculaires associées à la protéine affectée par la substance injectée.Bonjour, je suis Sean Brazinski du laboratoire du Dr Makoto Fki, du département de biologie et de biochimie à l'Université de Bath. Je fais également partie intégrante du laboratoire complet de Seki. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'injection microscopique d'embryons Meca avec des traceurs cellulaires, des ARNm et des oligonucléotides antisens.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la fonction d'un gène d'intérêt in vivo au niveau d'une seule cellule. Commençons donc. Contrairement au poisson zèbre, les mâles et les femelles, maka peuvent être facilement distingués par leurs nageoires dimorphes.Les nageoires femelles ont une forme arrondie avec une marge lisse. Les nageoires anale et dorsale du mâle sont plus grandes que celles de la femelle, et la nageoire dorsale présente une profonde encoche entre les deux derniers rayons. Conserver un couple reproducteur de meca dans un aquarium de reproduction avec ou sans courant d'eau.Ce P peut être conservé dans le réservoir avec de l'eau courante pendant jusqu'à deux mois. Pour les injections quotidiennes, la femelle peut pondre jusqu'à 40 œufs par jour, qui s'agglomèrent au niveau du ventre grâce à des filaments d'attachement. Utilisez un filet pour attraper et sortir une femelle du réservoir, puis maintenez le poisson avec une main pour le stabiliser à l'intérieur du filet. Détachez délicatement les œufs à l'aide de l'index.Replacer la femelle dans le réservoir. Utiliser une pince ou l'index pour transférer les œufs dans une boîte de Pétri de six centimètres remplie de milieu pour embryons. Sous un microscope stéréoscopique, utiliser deux paires de pinces pour couper les filaments d'attachement et séparer les œufs en grappes.Prélevez les embryons à l’aide d’une pipette en plastique pour les séparer des déjections et des algues, puis transférez un maximum de 40 œufs dans une boîte contenant du milieu pour embryons frais. Placez les œufs sur de la glace s’ils doivent être micro-injectés immédiatement. Sinon, modifiez la vitesse de développement vers des stades ultérieurs en faisant varier la température d’incubation.Un moule en plexiglas est nécessaire pour fabriquer des plaques d'agarose servant à maintenir les embryons pendant l'injection. Se référer à la partie écrite de ce protocole pour plus de détails. Verser 0,5 centimètre de 1,5 % d'agarose dans l'eau dans une boîte de Pétri de neuf centimètres.Une fois que l'aase a durci, découper une zone légèrement plus petite que le moule afin que ce dernier ne s'enfonce pas jusqu'au fond. Combler la zone découpée avec davantage d'aase à 1,5 % et poser le moule en plexiglas dessus. Éviter d'introduire des bulles d'air une fois que l'Aris a solidifié.Relâchez généralement le moule pour créer des sillons. Recouvrez les Aris de milieu pour embryon. Couvrez la boîte et stockez à quatre degrés Celsius jusqu'à utilisation. Préparez une aiguille d'injection large et solide à partir d'un filament contenant un capillaire en verre. Utilisez un micro-chargeur pour remplir par aspiration l'aiguille d'injection avec la solution d'injection, incluant le rouge de phénol comme traceur, puis reliez l'aiguille à un support d'injection avec pompe à air. Installez le dispositif à côté d'un microscope stéréoscopique.Transférez les œufs du stade approprié sur la plaque d'injection contenant l'agarose. Les embryons peuvent être conservés sur de la glace pendant jusqu'à 30 minutes afin d'interrompre leur développement pendant l'injection réalisée au microscope stéréo. Utilisez une pince pour aligner de sept à dix œufs dans chaque rainure.Faites pivoter les œufs de manière à ce que l'aiguille d'injection les pénètre perpendiculairement. La cellule unique de l'embryon se trouve opposée aux gouttelettes de dent de sol. Par conséquent, la gouttelette d'huile doit être orientée vers la gauche, de sorte que la cellule unique se trouve à droite pour l'injection.Dans le cas des acides nucléiques et des colorants traceurs, ceux-ci sont micro-injectés à travers la choriale directement dans le cytoplasme de l'embryon plutôt que dans le vitellus. Comme pour le poisson zèbre, approchez l'aiguille près des œufs. Touchez la pointe de l'aiguille à la choriale ou utilisez une pince microchirurgicale pour briser délicatement la pointe de l'aiguille afin qu'une petite quantité de la solution d'injection s'écoule à l'extrémité.Réinsérez l'aiguille en cas d'obstruction, percez le Corian et déplacez la pointe de l'aiguille d'injection juste à l'intérieur de la couche interne afin de réduire la probabilité d'un reflux dans l'aiguille. Ajustez la pression de maintien de l'injecteur à environ 80 à 100 hectopascals de manière précise. Percez la membrane et insérez l'aiguille dans le cytoplasme.Injecter l'embryon. Observer l'embryon de côté afin de confirmer la répartition homogène du liquide injecté dans le cytoplasme. Les liquides correctement injectés dans le cytoplasme présentent une limite floue ; en revanche, un liquide injecté trop profondément dans le vitellus possède une limite nette et ne sera pas transféré vers le cytoplasme.Transférez les embryons injectés dans une boîte de Pétri propre contenant du milieu pour embryons et laissez-les se développer selon les besoins dans un incubateur à température appropriée. Le panneau A montre une image représentative d'une injection correcte de dextran rumine dans le cytoplasme d'un embryon Meca au stade une cellule. Le panneau B montre une image représentative d'une injection incorrecte de dextran rumine dans le sac vitellin d'un embryon Meca au stade une cellule. Les lignes pointillées indiquent le contour du cytoplasme d'une cellule.Les panneaux C et D montrent les embryons des panneaux A et B respectivement environ 30 heures après l'injection. Remarquez que le corps de l'embryon dans le panneau D n'est pas rouge, car le colorant a été injecté de façon incorrecte dans le sac vitellin. Nous venons de vous montrer comment injecter par microinjection des acides nucléiques ou des traceurs au stade unidcellulaire des embryons plus foncés.Lors de cette procédure, il est important d'utiliser un embryon correctement stagé pour une injection réussie. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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