Name: La zone sous-ventriculaire Fr-face: Coloration Wholemount et Flow épendymaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T16:22:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Découvrez la technique de coloration wholemount pour étudier les parois du ventricule latéral et analyser le flux épendymaire dans le cerveau de mammifère adulte. Cette méthode révèle l'activité germinale de la zone sous-ventriculaire.

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Les travaux pris en charge par NIH HD-32116, la famille Sandler Soutenir la Fondation, le Fonds John Bowes de cellules souches, le MEXT, le MHLW et HFSP. ZM soutenu par la Fondation Carlos Baldoceda et UCSF Krevans Bourse. AA-B. Heather détient la présidence et Melanie Muss Doté.

<ol><li>Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+of+tangential+pathways+for+neuronal+migration+in+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14895-14900 (1996).</li>
<li>Shen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche%3A+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).</li>
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<li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+confer+unique+pinwheel+architecture+to+the+ventricular+surface+in+neurogenic+regions+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain.</a> Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Han, Y. G., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+organize+ependymal+planar+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cilia organize ependymal planar polarity.</a> J Neurosci. 30, 2600-2610 (2010).</li>
<li>Doetsch, F., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+a+germinal+layer+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 11619-11624 (1999).</li>
<li>Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+follow+the+flow+of+cerebrospinal+fluid+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain.</a> Science. 311, 629-632 (2006).</li>
<li>Coskun, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+neural+stem+cells+in+the+ependyma+of+mammalian+postnatal+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">CD133+ neural stem cells in the ependyma of mammalian postnatal forebrain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 1026-1031 (2008).</li>
<li>Merkle, F. T., Mirzadeh, Z., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+organization+of+neural+stem+cells+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mosaic organization of neural stem cells in the adult brain.</a> Science. 317, 381-384 (2007).</li>
<li>Young, K. M., Fogarty, M., Kessaris, N., Richardson, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+stem+cells+are+heterogeneous+with+respect+to+their+embryonic+origins+and+neurogenic+fates+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone stem cells are heterogeneous with respect to their embryonic origins and neurogenic fates in the adult olfactory bulb.</a> J Neurosci. 27, 8286-8296 (2007).</li>
<li>Waclaw, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zinc+finger+transcription+factor+Sp8+regulates+the+generation+and+diversity+of+olfactory+bulb+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The zinc finger transcription factor Sp8 regulates the generation and diversity of olfactory bulb interneurons.</a> Neuron. 49, 503-516 (2006).</li>
<li>Kohwi, M., Osumi, N., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6+is+required+for+making+specific+subpopulations+of+granule+and+periglomerular+neurons+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pax6 is required for making specific subpopulations of granule and periglomerular neurons in the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 25, 6997-7003 (2005).</li>
<li>Kohwi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subpopulation+of+olfactory+bulb+GABAergic+interneurons+is+derived+from+Emx1-+and+Dlx5%2F6-expressing+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A subpopulation of olfactory bulb GABAergic interneurons is derived from Emx1- and Dlx5/6-expressing progenitors.</a> J Neurosci. 27, 6878-6891 (2007).</li>
<li>Hack, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+fate+determinants+of+adult+olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal fate determinants of adult olfactory bulb neurogenesis.</a> Nat Neurosci. , (2005).</li>
<li>Ventura, R. E., Goldman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+radial+glia+generate+olfactory+bulb+interneurons+in+the+postnatal+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dorsal radial glia generate olfactory bulb interneurons in the postnatal murine brain.</a> J Neurosci. 27, 4297-4302 (2007).</li>
<li>Kelsch, W., Mosley, C. P., Lin, C. W., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mammalian+precursors+are+committed+to+generate+neurons+with+defined+dendritic+projection+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct mammalian precursors are committed to generate neurons with defined dendritic projection patterns.</a> PLoS Biol. 5, e300(2007).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+centrosome+inheritance+maintains+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric centrosome inheritance maintains neural progenitors.</a> Nature. 461, 947-955 (2009).</li>
</ol>

La plupart des études de la neurogenèse dans les zones ventriculaires et sous-ventriculaire se sont appuyés sur des techniques classiques de sectionnement d&#39;examiner les relations microanatomie et cellulaires dans ces régions. Nous décrivons ici une technique alternative, d&#39;abord utilisé pour analyser le réseau de chaînes migratoires des neuroblastes générés dans le SVZ 1, puis utilisées pour étudier la régénération de la population progénitrices SVZ suivantes antimitotiques traitement de 6, et plus récemment utilisée pour étudier les apicale précise basale et interactions cellule-cellule des cellules souches neurales adultes SVZ 2,3,4. Fait intéressant, cette technique a révélé que les cellules souches neurales, ou des cellules de type B1, de l&#39;adulte SVZ font partie d&#39;un neuroépithélium mélangé avec différenciées ne se divisent cellules épendymaires. En face d&#39;imagerie utilisant des échantillons entiers a montré que ce mélange a une architecture neuroépithélium moulinet composé des terminaisons apicale des cellules de type B1 entouré par de grandes surfaces apicales des cellules épendymaires 4. Cette analyse en face a clarifié notre compréhension de la lignée de cellules souches neurales dans le cerveau embryonnaire et adulte comme étant composé de cellules avec des terminaisons à la surface apicale du ventricule et des processus basale contactant une niche vasculaire. Ces résultats aurait été presque impossible en utilisant les techniques classiques de sectionnement. Échantillons entiers aussi faciliter l&#39;identification des cellules souches neurales via leur ventricule contactant processus apical. Comme marqueurs plus spécifiques de ces cellules souches sont trouvées, des échantillons entiers seront une partie intégrante de l&#39;identification et l&#39;analyse de comportement des cellules souches neurales. Échantillons entiers des murs ventricule latéral fournissent également la perspective idéale pour étudier la polarité planaire des cellules épendymaires. Cellules épendymaires sont les cellules tapissant les ventricules multiciliated cette fonction pour propulser le LCR de façon coordonnée. Avec la technique wholemount, l&#39;épithélium épendymaire entière est exposée en face et peut être teinté et étudiées en détail de son avant vers l&#39;arrière et dorsale des frontières ventrale. Par ailleurs, des tests de débit effectués sur épendymaires aiguë disséqué, échantillons entiers vivent robuste montrer le flux planaire polarisée générés par les cils épendymaires. Des travaux récents utilisant des approches wholemount a découvert déterminants cellulaires de cette polarité planaire épendymaires 5. Fait intéressant, les études wholemount ont également suggéré que épendymaires-généré des flux de LCR établit des gradients de chemorepellents qui guident la migration des jeunes neurones dans le SVZ 7. Des approches Wholemount qu&#39;il a identifié le réseau de chaînes de neurones migratoires sont donc continuer à fournir des indications sur les mécanismes de régulation de la migration en chaîne. L&#39;analyse de la VZ et SVZ par wholemount imagerie ajoute une nouvelle approche à la fois pour les études futures et une façon de clarifier notre compréhension des études existantes. Par exemple, une étude récente suggère que les cellules souches neurales dans le SVZ adulte ont été CD133 + / CD24-cellules en contact avec les 8 ventricule. Basé sur leur immunomarquage dans les sections, ces auteurs ont prétendu que ces cellules ont été une sous-population de cellules épendymaires multiciliated. Cependant, dans notre étude en utilisant l&#39;approche wholemount, ce qui donne une vue plus complète de l&#39;épithélium toute épendymaires, nous avons constaté que toutes les cellules épendymaires exprimer CD24 et le seul ventricule contact de cellules qui ont été CD133 + / CD24-ont un sous-ensemble de l&#39;type B1 cellules 4. Par ailleurs, la technique wholemount promet d&#39;être utile dans de futures études examinant l&#39;organisation de mosaïque récemment décrit des cellules souches neurales dans le cerveau adulte 9. Plusieurs études ont montré que les cellules souches neurales dans le cerveau adulte ne sont pas une population homogène, mais sont spécifiées régionalement et, normalement, ne produisent que des sous-types spécifiques d&#39;interneurones bulbe olfactif. Ces études ont proposé que différentes sous-populations de cellules souches neurales peuvent être distingués soit par l&#39;expression des facteurs de transcription spécifiques 10,11,12,13,14 et / ou par leur localisation régionale le long de la dorsale des degrés-ventral et antéro-postérieure de la paroi latérale 9,15,16. Comme plusieurs marqueurs moléculaires de la sous-populations régionalement spécifié de cellules souches neurales adultes sont identifiés, l&#39;imagerie wholemount devrait fournir une vue complète de l&#39;parcelation de ces domaines progénitrices différents le long de la paroi ventriculaire. La dissection wholemount et des techniques d&#39;imagerie présentées ici peuvent également être utilisés pour analyser les parois ventriculaires chez l&#39;embryon. La dissection de la paroi latérale est réalisée embryonnaire, étape par étape, de la même manière. Il ya seulement de légères différences dans le niveau de difficulté; les ventricules embryonnaires sont relativement plus faire la dissection plus facile, mais le tissu est doux rendant la manipulation plus difficile. En particulier, une exposition similaire du ventricule latéral peut être utilisé dans EmbryOS pour disséquer la paroi corticale du ventricule pour étudier la neurogenèse corticale. Des données récentes suggèrent que l&#39;héritage asymétriques centrosome maintient glie radiaire à la surface ventriculaire pendant la neurogenèse corticale 17. En face de l&#39;imagerie radiale gliales surfaces apicales peuvent fournir des indications sur la manière dont les centrosomes au sein de ces cellules qui se divisent de façon asymétrique sont héréditaires. Comme avec la plupart des techniques, en particulier celles impliquant la dextérité précise, la maîtrise exige la pratique. Il ya, cependant, quelques éléments dans la dissection qui sont essentiels à de meilleurs résultats: 1) l&#39;éclairage ajuster l&#39;éclairage de l&#39;échantillon pour créer des ombres donne un contraste précieuse lors de la dissection du tissu qui est par ailleurs relativement homogène, 2) à l&#39;aide de la pince, comme deux broches d&#39;insectes de la pince dans cette technique sont jamais utilisés pour pincer ensemble ou ramasser des tissus, mais ils sont utilisés comme des épingles maniable qui peut être constamment réajustés afin de stabiliser le tissu tout en réduisant, 3) un équilibre de rétractation doux et la coupe du couteau ne doit pas seulement être utilisé pour couper, mais aussi de fournir la rétraction douce pour séparer les murs médial et latéral, en rappelant que la majorité de cette dissection est effectivement réalisé par le biais de rétraction douce avec seulement la coupe intermittente.

la zone sous-ventriculaire fr-face: coloration wholemount et flow épendymaire

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

Les parois des ventricules latéraux contiennent la plus grande région germinales dans le cerveau adulte des mammifères. La zone sous-ventriculaire (SVZ) dans ces murs est un système modèle largement étudiés pour comprendre le comportement des cellules souches neurales et la régulation de la neurogenèse adulte. Traditionnellement, ces études se sont appuyés sur des techniques classiques de sectionnement pour l&#39;analyse histologique. Nous présentons ici une approche alternative, la technique wholemount, qui fournit une approche globale, en vue de face de cette région germinales. Comparé à des sections, des échantillons entiers de préserver la cytoarchitecture complète et les relations cellulaires dans le SVZ. Cette approche a récemment révélé que les cellules souches adultes de neurones, ou cellules de type B1, font partie d&#39;un neuroépithélium mélangé avec des cellules différenciées épendymaires tapissant les ventricules latéraux. En outre, cette approche a été utilisée pour étudier la polarisation planaire des cellules épendymaires et l&#39;écoulement du liquide céphalorachidien qu&#39;ils génèrent dans le ventricule. Avec des preuves récentes que cellules souches neurales adultes constituent une population hétérogène qui est régionalement spécifié, l&#39;approche wholemount sera probablement un outil essentiel pour comprendre l&#39;organisation et parcellisation de ce créneau de cellules souches.

Les murs du ventricule latéral contiennent la plus grande région germinales dans le cerveau adulte des mammifères. Traditionnellement, les études sur la neurogenèse dans cette région se sont appuyés sur des techniques classiques de sectionnement pour l&#39;analyse histologique. Nous présentons ici une approche alternative, la technique wholemount, qui fournit une approche globale, en vue de face de cette région germinales.

La zone sous-ventriculaire Fr-face: Coloration Wholemount et Flow épendymaire

Les parois des ventricules latéraux contiennent la plus grande région germinale du cerveau mammalien adulte. La zone sous-ventriculaire (SVZ) située dans ces parois est une ...

Bonjour, je suis Zaman. Je suis Arturo Alvarez Bia. Nous sommes aujourd’hui dans le laboratoire d’Arturo, qui fait partie du département de neurochirurgie et du centre Eli Edith Broad de médecine régénérative et de recherche sur les cellules souches, et nous allons vous montrer comment nous préparons des montages complets des parois des ventricules latéraux.Ces montages complets peuvent être utilisés soit fixés pour une coloration immunohistochimique, soit en préparations vivantes pour analyser le flux pénal. La technique de montage complet que Mann va vous illustrer aujourd'hui a été développée au fil des années dans le laboratoire et perfectionnée pour étudier toute la paroi du ventricule latéral, incluant les cellules pénales et l'activité germinative sous-jacente dans la zone subépendymaire où se trouvent les cellules souches neuronales. Elle a été initialement développée par Fiona Dutch, puis perfectionnée par HIE Victor et Casu Moto.Aucun d'entre eux ne se trouve plus dans le laboratoire. Les schémas suivants illustrent la préparation d'une monture complète de la paroi latérale du ventricule latéral. Le cerveau est d'abord divisé en deux hémisphères.Une coupe coronale est réalisée postérieurement pour révéler l'hippocampe, dont la section transversale apparaît ici en violet. La paroi médiale, qui recouvre l'hippocampe et est représentée en violet, est ensuite détachée de la paroi latérale, qui recouvre le *stratum alba* et est illustrée en rose. Les deux parois seront écartées l'une de l'autre comme on ouvre un livre, et la paroi médiale sera retirée, laissant la paroi latérale exposée.La première section de cette vidéo traite de la dissection en montage entier, mais cela peut ne pas être la première étape. Sur le plan chronologique, si l'on prévoit d'analyser un flux pénal, veuillez vous reporter au protocole écrit pour plus de détails. Avant chaque dissection, assurez-vous que tous les instruments sont stériles et à portée de main. Placez une boîte de dissection de six centimètres contenant du milieu L 15 leitz à 37 degrés Celsius sous un microscope stéréoscopique à fluorescence, puis déposez un cerveau de souris fraîchement disséqué dans la boîte sous le microscope stéréoscopique.Utilisez la pince fine pour disséquer les bulbes olfactifs. Utilisez un couteau à piquer pour diviser le cerveau en ses deux hémisphères. Effectuez une coupe coronale à l'extrémité postérieure d'un hémisphère.Pour exposer l'hippocampe cordal et sa coupe transversale, insérez le couteau à ponction dans l'espace ventriculaire réduit situé entre le cortex et l'hippocampe, puis sectionnez afin de libérer le cortex au niveau de son insertion dorsale à l'hippocampe. Enlevez un coin de cortex au niveau de l'angle et utilisez une pince fine pour le détacher lentement de l'hippocampe. Poursuivez le décollement du cortex tandis qu'il s'enroule jusqu'au bord ventral de l'hippocampe.Utilisez un couteau à piquer pour détacher l'hippocampe des parties ventrales du cortex. Utilisez le couteau et une pince fine pour écarter l'hippocampe du cortex. Avancez soigneusement vers l'avant sans endommager les parois des ventricules.Les deux parois doivent s'ouvrir l'une par rapport à l'autre. Comme un livre avec un couteau, découpez les parties du cortex qui dépassent de la paroi latérale. Pour mieux visualiser cette surface lorsque la résistance à la rétraction augmente, deux coupes supplémentaires devront être effectuées.Une coupure dorsale au niveau où les parois médiale et latérale se rejoignent, et une coupure similaire en position ventrale. Utilisez de petits mouvements du couteau piqueur pour effectuer ces incisions. Ces coupures supplémentaires permettent une rétraction accrue de la paroi médiale afin de mettre en évidence l'antérieur du ventricule.Réglez l'éclairage de manière à ce que les ombres révèlent la jonction entre les parois médiale et latérale, comme une vallée entre les deux parois. Utilisez le couteau pour couper précisément dans la vallée, puis retirez le thalamus et tout cortex en surplomb.Le montage avec trou doit être utilisé immédiatement pour une analyse du flux pénal. Si l'on dissèque les montages avec trou pour une immunomarquage, plusieurs montages peuvent être disséqués en une seule séance, à condition de les immerger dans le fixateur dès qu'ils sont terminés. La prochaine section de la vidéo montrera comment réaliser des tests du flux de fluide généré par les cils des cellules épendymaires.Utilisation de microbilles fluorescentes. Le trou de la paroi latérale fraîchement disséqué est d'abord fixé au plat de dissection à l'aide de deux épingles à insecte. La pointe d'une micropipette en verre remplie de microbilles fluorescentes est ensuite abaissée sur la surface de la préparation entière, et les billes fluorescentes sont déposées délicatement sur la surface en mode acquisition temporelle.La vidéo enregistre le déplacement des billes lors du test d'écoulement appendu. Une micropipette en verre doit être préparée avant la dissection en montage entier, comme décrit dans la partie écrite de ce protocole. La micropipette terminée doit présenter un affinement régulier et progressif, un biseau à 45 degrés et un diamètre interne d'environ 100 micromètres.Remplir partiellement la pipette d’huile minérale par action capillaire, environ à la moitié. Insérer un piston enduit de graisse à vide à l’arrière de la pipette. Ensuite, pousser pour faire avancer le ménisque de l’huile jusqu’à l’extrémité de la pipette.Fixez la pipette munie d'un piston à un micromanipulateur sur un bras réglable. Chargez la pipette par l'avant avec une solution contenant 50 % de microbilles fluorescentes, 5 % de glycérine et 45 % d'eau. Découpez récemment une préparation trouée comme indiqué précédemment, puis transférez-la, côté ventriculaire vers le haut, dans une coupelle de dissection propre remplie d'eau à 37 degrés Celsius.Milieu Leitz, fixez le support à trous sur la boîte de dissection à l’aide de deux épingles à insectes plantées dans le thalamus et le cortex dorsal antérieur. Placez la base du bras fixe supportant le micromanipulateur à côté du microscope stéréo, en gardant le bras surélevé pour éviter de casser l’aiguille de la micropipette. Plongez la pointe de la micropipette dans un tube contenant du milieu afin d’éliminer les microbilles situées à l’extérieur de la pointe.En prenant soin de ne pas casser la pointe. Positionner l'extrémité des pipettes au-dessus de la surface dorsale de la paroi latérale et abaisser le bras pour amener la pointe de la pipette juste au-dessus de la surface du tissu. Se focaliser sur un champ de vision englobant la moitié antérieure du montage en trou et commencer à enregistrer les images souhaitées.Utilisez le piston pour éjecter environ cinq litres de microbilles sur la surface du support percé. Une fois que le bolus initial de billes a été éliminé de la surface par un flux de rinçage, utilisez le piston pour éjecter des suppléments de cinq nanolitres de microbilles. Le flux, la direction et la vitesse peuvent être analysés à l’aide de la vidéo enregistrée.La dernière section de cette vidéo montre comment les montages de puces sont immunomarqués et montés sur des lames pour l'imagerie confocale. Les montages de puces fraîchement disséqués sont d'abord transférés dans une plaque de 24 puits et fixés par immersion dans du paraformaldéhyde. Cela est suivi par une série d'incubations avec des anticorps primaires, puis avec des anticorps secondaires conjugués à une fluorochrome, avec des lavages intermédiaires.Après la coloration, les préparations complètes sont sous-dissectées afin de séparer uniquement la fine couche de la paroi latérale contenant la zone subventriculaire du reste de la préparation complète, qui contient le stratum stromal sous-jacent et le cortex. Ce fin fragment de tissu plat est ensuite transféré sur une lame et recouvert d'une lamelle pour fixer les préparations complètes en vue d'une immunocoloration à froid. Une plaque de 24 puits contenant 4 % de paraformaldéhyde et 0,1 % de Triton X-100 sur glace.Dans une hotte chimique, immergez délicatement un cœur disséqué monté sur un support, côté ventricule vers le haut, dans un puits de la plaque. Fixez l'échantillon toute la nuit à quatre degrés Celsius, aspirez le fixateur, puis utilisez une pipette de transfert pour laver soigneusement le support dans un XPBS contenant 0,1 % de Triton X-100, trois fois pendant cinq minutes chacun. Pour toutes les étapes de manipulation des liquides, pipetez délicatement sur le côté du puits afin d'éviter de retourner le support et d'endommager le tissu.Ajouter une solution de blocage contenant du Triton X et 10 % de sérum de chèvre normal dans du PBS 1X, en utilisant jusqu'à 2 % de Triton X selon la profondeur de pénétration des anticorps requise. Incuber le montage complet dans la solution de blocage pendant une heure. À température ambiante, retirer la solution de blocage.Ajouter les anticorps primaires dilués dans la solution de blocage et incuber à quatre degrés Celsius pendant 24 ou 48 heures, selon l'antigène ciblé. Rincer par deux rinçages rapides au PBS 1X avec du Triton X, suivis de trois lavages de 20 minutes chacun à température ambiante. Ajouter les anticorps secondaires dilués dans la solution de blocage et incuber à quatre degrés Celsius pendant la même durée que pour l'anticorps primaire, puis laver de la même manière que pour les anticorps primaires. La série suivante d'étapes montre comment disséquer uniquement la paroi latérale du reste du montage complet afin d'obtenir un spécimen plat unique, qui peut ensuite être monté pour une imagerie à haute résolution.Replacer le montage du tissu immunomarqué, côté ventriculaire vers le haut, dans une boîte de dissection propre remplie de 1 XPBS sous le microscope stéréoscopique, en se déplaçant de la partie postérieure vers la partie antérieure. Utiliser un couteau à piquer pour retirer le cortex dorsal ainsi que le corps calleux blanc sous-jacent afin de visualiser l'interface entre la zone sous-ventriculaire et le striatum. Ensuite, effectuer une longue incision horizontale sur l'aspect ventral du montage entier.Utilisez une pince fine pour orienter le tissu sur ce nouveau bord plat de manière à ce que la surface dorsale soit orientée vers le haut. La zone subventriculaire est une mince bande de tissu homogène de couleur rose, tandis que le striatum est infiltré par des cordons de matière blanche. Utilisez la pince comme deux broches dans le stri AUM pour fixer le tissu sans endommager la paroi ventriculaire.Commencer par la partie antérieure. Utiliser le couteau à ponction pour commencer soigneusement à couper entre le striatum et la zone sous-ventriculaire. Il est important de maintenir les incisions parallèles à la surface ventriculaire et de conserver l'épaisseur du tissu disséqué.Comme la zone sous-ventriculaire s'amincit postérieurement, retirez soigneusement tous les tissus environnants des prélèvements troués qui ne font pas partie de la paroi ventriculaire. L'épaisseur du prélèvement troué doit être uniforme, comprise entre 200 et 300 micromètres.Utilisez une pince pour soulever la lamelle de tissu par en dessous et transférez-la sur une lame de microscope. Appliquez un milieu de montage, puis un couvre-objet. Essayez de ne pas introduire de bulles d'air.Conserver les lames à plat dans un classeur à lames à quatre degrés Celsius pendant un à deux jours afin de permettre aux lamelles de bien adhérer avant l'acquisition d'images des échantillons. Voici quelques résultats représentatifs d'immunomarquages sur coupes entières et de tests d'appendice en flux. La première image est une vue à faible grossissement d'un immunomarquage sur coupe entière pour la double cottine, un marqueur des neuroblastes, qui met en évidence le réseau de chaînes de jeunes neurones en migration dans la zone subventriculaire adulte.Voici une autre vue à faible grossissement d'une préparation en montage complet, colorée pour KI 67 en vert et pour les vaisseaux sanguins en rouge, illustrant à un grossissement plus élevé l'interaction étroite récemment décrite entre les cellules en division et le système vasculaire dans la zone subventriculaire. L'image suivante montre une image confocale de la surface ventriculaire, la surface apicale des cellules bordant le ventricule étant délimitée par une coloration en vert du bêta-caténine, tandis que les corps basaux de ces cellules sont marqués en rouge par la gamma-tubuline. La dernière image, prise à fort grossissement, correspond à une projection maximale d'une série confocale obtenue à partir d'une coloration en montage complet pour la GFAP, révélant la longue fibre basale positive pour la GFAP des cellules de type B1 de la zone ventriculaire subépendymaire, utilisée pour analyser l'écoulement, la direction et la vitesse du LCS à la surface ventriculaire.Des images consécutives provenant de films d'écoulement append peuvent être fusionnées en une seule image composite. Ces images composites montrent la position de billes individuelles à différents moments pendant qu'elles parcourent l'appendice ou la surface. Voici un exemple de l'aspect des résultats une fois terminés.Vous venez de voir comment préparer des montages complets à partir de la zone subventriculaire de la paroi latérale des ventricules latéraux. Cette méthode fournit une vue d'ensemble de l'ensemble de la paroi et a permis de nombreuses découvertes au fil des années, notamment l'observation que cette région ventriculaire est organisée en un réseau de voies destinées à la migration en chaîne. Elle nous a également permis d'étudier la façon dont le liquide céphalorachidien circule sur cette paroi, et a indirectement suggéré des mécanismes par lesquels ces cellules orientent leur migration à travers ce vaste réseau de voies.Récemment, cette technique nous a permis de découvrir que la zone subventriculaire est organisée en étoiles de meule avec les cellules souches situées au cœur de ces structures, révélant ainsi l'extrémité optique des cellules souches au sein de cette organisation. Étant donné que la préparation en monture entière permet une vision d'ensemble de cette zone ventriculaire, elle offre une perspective que les coupes histologiques ne peuvent pas fournir. Pour cette raison, nous la mettons à disposition de tous, car elle devrait s'avérer utile pour de nombreuses autres études. Quelques points essentiels doivent être gardés à l'esprit lors de la préparation des montures entières afin d'améliorer vos dissections.La première consiste à bien régler l'éclairage afin que des ombres soient projetées sur le support du trou. Cela fournira un contraste et vous indiquera l'endroit où vous devez effectuer vos incisions. La deuxième consiste à utiliser la pince comme deux broches mobiles.Vous ne devez pas utiliser la pince pour comprimer le tissu ou le soulever. Utilisez-la plutôt comme deux broches mobiles qui maintiendront le tissu en place pendant que vous effectuez la coupe. La troisième méthode consiste à combiner une rétraction générale et une coupe.Comme vous pouvez le remarquer dans les dissections, très peu de tissu est effectivement coupé. La majeure partie de la dissection est réalisée par une rétraction générale lors du deuxième passage de la dissection, lorsque vous retirez la paroi latérale du reste du montage complet.La chose la plus importante est d'orienter vos coupes dans un plan parallèle au plan de la surface ventriculaire. Cela garantira une épaisseur uniforme d'avant en arrière le long de la paroi latérale. Cela assurera également que, lorsque vous effectuerez un examen en microscopie confocale à haute résolution, toutes les images seront nettes dans un seul plan focal.Nous espérons que cette vidéo vous sera utile pour vos études. Bonne chance avec vos expériences.

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