Sectionnement des préparations minces tranches d'immunohistochimie
28 avril 2007
Le présent procédé permet cryostat reproductibles sectionnement de petits morceaux de tissu, difficile à gérer, comme les biopsies et les tranches de cerveau. Nous utilisons une étape de congélation en aluminium simple pour faciliter la manipulation des tissus et un cryostat standard pour produire en routine des sections 50 à 10 microns de série à partir de 400 microns tranches épaisses du cerveau.
Bonjour, je m'appelle Jun Park, chercheur postdoctoral à la Harvard Medical School, et je suis également étudiant en médecine à la faculté de médecine du Y University College, hôpital Severance, Corée du Sud. Voici le matériel nécessaire pour la microtomie de préparations en tranches. Je prépare un moule à l'aide d'un ruban adhésif en forme de cadre sur une plateforme OCT.
Je forme une empreinte avec du OCT et je congèle à l'intérieur du cryostat, ou en utilisant des morceaux de glace sèche, j'élimine le TAFE autour de la plateforme de OCT congelée. Je repère les marques d'alignement sur la craie de congélation et sur le plateau de montage du cryostat, puis je fixe la craie. Je réalise des coupes à travers la plateforme de OCT.
La surface de l’Ontario est plate. J’enlève la plateforme OCT reconstituée et je la place sur le plateau de congélation du cryostat. Je place cet échantillon dans de l’OCT, et cet échantillon a été précédemment cryopréservé avec 30 % de glycérol ou de saccharose dans du PBS.
Voici l'étape de préparation de la colonne de congélation avec un anneau externe dépassant d'environ cinq millimètres au-dessus du haut de la colonne en formation. Un puits pour OCT est réalisé en positionnant soigneusement l'échantillon de tissu au centre de la surface de la colonne de congélation, puis en ajoutant lentement de l'OCT jusqu'à ce que le puits soit rempli. La colonne de congélation est entourée de copeaux de glace carbonique broyée.
Le tissu et l'OCT doivent geler complètement en 20 à 60 secondes. Lorsque la préparation augmente en température, l'anneau externe peut être retiré tandis que l'échantillon reste congelé. Cette étape consiste à faire glisser latéralement l'échantillon du bloc de congélation et à le placer dans le cryostat.
Je dépose une goutte d’OCT sur la surface de la plateforme OCT et je positionne le spaceman en exerçant une légère pression ; le spaceman va rapidement geler sur la plateforme OCT. Cette étape consiste à fixer fermement le ch On sur le porte-échantillon du cryostat, les repères étant alignés. Je réalise des coupes à travers la couche d’OCT superficielle au tissu spaceman.
Je monte des coupes minces sur des lames en verre et je les conserve congelées ou à température ambiante ; les réactions peuvent être réalisées sur des tissus montés sur des lames en verre. Le réactif est appliqué sur la lame, peut être doucement agité et peut être recouvert s'il est sensible à la lumière ; les étapes suivantes de la réaction sont facilement réalisées par inversion. Placer la lame dans un récipient pour déchets, ce qui affaiblit la lame, puis appliquer la création suivante.
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Aperçu
Cette méthode permet une sectionnement reproductible au cryostat d'échantillons tissulaires petits et difficiles, notamment des biopsies et des tranches de cerveau. Elle utilise un simple plateau de congélation en aluminium pour faciliter la manipulation des tissus et un cryostat standard pour produire des sections séries de 5 à 10 micromètres à partir de tranches de cerveau de 400 micromètres d'épaisseur.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Histologie
- Traitement des tissus
Contexte
- La microtomie au cryostat est essentielle pour l'étude de petits échantillons de tissus.
- La manipulation de biopsies de petite taille et de tranches de cerveau peut présenter des difficultés techniques.
- Les méthodes classiques peuvent ne pas produire des résultats reproductibles.
- Des techniques améliorées peuvent accroître la qualité des coupes tissulaires.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour la coupe de petits échantillons de tissus.
- Faciliter la manipulation de fragments de tissus difficiles à gérer.
- Produire des coupes sériées uniformes et de haute qualité.
Méthodes utilisées
- Utilisation d'un plateau de congélation en aluminium.
- Cryostat standard pour la sectionnement.
- Production de sections de 5 à 10 micromètres.
- Préparation de tranches de cerveau de 400 micromètres d'épaisseur.
Résultats principaux
- Sectonnage réussi d'échantillons de tissus de petite taille.
- Reproductibilité de l'épaisseur des coupes.
- Amélioration de la manipulation des types de tissus difficiles.
- Production constante de coupes sérielles pour l'analyse.
Conclusions
- La méthode améliore la capacité à étudier de petits échantillons de tissus.
- Elle offre une approche fiable aux chercheurs en neurosciences.
- Des applications futures pourraient inclure divers types d'analyses de tissus.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Cette méthode répond au défi de la manipulation d'échantillons tissulaires petits et fragiles en recherche neuroscientifique, en permettant un découpage en sections minces reproductible pour des analyses immunohistochimiques ultérieures. Elle permet la validation de cibles et la réduction des risques mécanistiques en fournissant des résultats histologiques cohérents à partir de régions cérébrales caractérisées par électrophysiologie. L'approche renforce la fiabilité prédictive des modèles précliniques en améliorant la qualité des données obtenues à partir d'entrées tissulaires limitées.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à l'analyse cytoarchitecturale de régions cérébrales enregistrées.
- Valeur opérationnelle : Fournit une préparation reproductible des tissus pour la coloration immunohistochimique de cibles canaux ioniques ou récepteurs.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans la cible en associant des données fonctionnelles d'électrophysiologie à une validation structurelle.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour le criblage basé sur les anticorps et la détection de biomarqueurs.
- Valeur opérationnelle : Garantit une épaisseur uniforme des sections (5-10 µm) pour une intensité de coloration reproductible et une quantification fiable.
- Valeur de la plateforme : Permet la sectionnement en série à partir de préparations de tranches archivées pour des flux de travail de coloration à haut débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Préserve la pertinence pathologique en maintenant les régions tissulaires définies par électrophysiologie pour la corrélation histologique.
- Valeur opérationnelle : Facilite la continuité entre la découverte fonctionnelle et la validation structurelle dans les modèles précliniques.
- Atténuation des risques : Réduit les faux négatifs dans les études d'engagement ciblé grâce à un découpage et une coloration fiables.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte en permettant une confirmation histologique après un criblage fonctionnel sur des préparations de tranches cérébrales.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en permettant la validation structurale des régions électrophysiologiquement actives.
- Tri : Fournit des sections de tissu prêtes à l'analyse, d'épaisseur constante, pour des tests d'immunohistochimie et d'hybridation in situ.
- Analytique : Génère des données morphologiques quantitatives qui aident à comparer les effets de traitements selon différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Relie la découverte fonctionnelle à la continuité préclinique par l'alignement cytoarchitectural des sites enregistrés.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité réutilisable pour le traitement d'échantillons de tissus dérivés de l'électrophysiologie dans divers projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant la variabilité de la préparation des tissus pour l'analyse immunohistochimique.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité des coupes entre les utilisateurs et les séances.
- Valeur stratégique : Renforce les décisions d'aller/arrêt en fournissant des données structurales fiables pour compléter les résultats fonctionnels.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque grâce à des données de validation ciblée plus fiables.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des tissus, le fonctionnement du cryostat et les protocoles de coloration immunohistochimique.
- Dépend de l'accès à un cryostat, aux composants du dispositif de congélation et au composé OCT pour l'encapsulation des tissus.
- Exige une standardisation des procédures de congélation et de sectionnement entre laboratoires afin d'obtenir des résultats cohérents.
- Implique des adaptations selon les types de tissus, au-delà des tranches de cerveau, comme les biopsies ou les organoïdes.
- Est limité par la nécessité d'avoir utilisé préalablement les tranches en électrophysiologie, ce qui peut restreindre le débit dans les flux de travail d'histologie autonomes.
