Name: Lisolement de lhomme de lartère ombilicale cellules musculaires lisses (HUASMC) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Apprenez l'isolation de cellules musculaires lisses de l'artère ombilicale humaine par traitement enzymatique au collagénase. Cette méthode préserve la viabilité cellulaire pour des études en biologie cellulaire.

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Hôpital Amato Lusitano, Castelo Branco au Portugal. Hôpital Sousa Martins, Guarda au Portugal.

<ol><li> Les artères sont obtenus à partir de morceaux de 3-7 cm de l&#39;UC. </li><li> Gelée de Wharton qui entoure les artères a été soigneusement enlevé en le coupant avec des ciseaux. </li><li> Une aiguille à bout émoussé d&#39;un diamètre extérieur de 0,6-1mm a été inséré environ 7mm d&#39;une extrémité de l&#39;artère disséquée. </li><li> Pour retirer le sang restant à l&#39;intérieur des vaisseaux, les artères sont tenu verticalement et perfusés avec environ 20 à 40 ml, solution saline physiologique (PSS), en utilisant une seringue de 20 ml connecté à une aiguille. Si nécessaire, cette étape de lavage a été répété à plusieurs reprises. </li><li> La même procédure a été répétée en utilisant du RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS). </li><li> Une extrémité d&#39;un vaisseau sanguin a été fermé. Une seringue de 10 ml a été relié à l&#39;aiguille et perfusé avec 3 ml de collagénase de type I (800 unités / ml en solution saline tamponnée de Hank (HBSS)). Puis l&#39;autre extremityof le navire a également été fermée. </li><li> Le navire a été incubée avec une solution saline tamponnée de phosphate (PBS), pendant 15 min à 37 ° C avec agitation. </li><li> Après les extrémités du navire ont été coupés pour recueillir les SMC libre. Les artères ont été perfuser avec environ 20 à 40 mL de DMEM-F12 supplémenté avec 5% de FBS et des antibiotiques à un tube de 50 ml. </li><li> Le tube a été centrifugé à température ambiante (250 g, 8 min), et le culot cellulaire a été resuspendu dans 5 ml de DMEM-F12 supplémenté avec 5% de FBS. </li><li> La suspension cellulaire a été transféré à un revêtus de collagène de T-ballon et incubées à 37 ° C, sous une atmosphère de CO 2 5% humidifié. </li><li> Après 5 h 16, les cellules non-adhérentes et drebis cellulaires ont été enlevés, 5 ml de milieu de culture a été ajouté et les cellules ont été incubées à 37 ° C, sous une atmosphère de CO 2 5% humidifié. </li><li> Les milieux de culture cellulaire a été changé tous les 2 trois jours, jusqu&#39;à ce que SMC a atteint la confluence. </li><li> Après cellules atteint la confluence, ils ont été ensemencés dans deux ou trois de 25 cm 2 flacons T. </li></ol> Nettoyage <ol><li> Jeter les aiguilles dans le collecteur de déchets. </li><li> Disposez des seringues dans les containers prévus à grande. </li><li> Mettez tous les tissus dans un petit sac biohazard. Fermer le sac et congeler à -20 ° Celsius jusqu&#39;à l&#39;incinération. </li><li> Faire tremper les instruments dans virucide pour au moins 10 min. </li><li> Retour supports inutilisés au réfrigérateur. </li><li> Jeter les gants dans les déchets biologiques dangereux. </li></ol>

<ol><li>Van Rijen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+in+human+umbilical+cord+endothelial+cells+contain+multiple+connexins%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Gap junctions in human umbilical cord endothelial cells contain multiple connexins.</a> The American journal of physiology. 272 (1 PT 1), C117-C117 (1997).</li>
<li>Martín de Llano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+to+consistently+obtain+endothelial+and+smooth+muscle+cell+cultures+from+umbilical+cord+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Procedure to consistently obtain endothelial and smooth muscle cell cultures from umbilical cord vessels.</a> Translational Research. 149 (1), 1-9 (2007).</li>
<li>Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+endothelial+cells+derived+from+umbilical+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).</li>
<li>Cairrão, E., Santos-Silva, A., Alvarez, E., Correia, I., Verde, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+umbilical+artery+smooth+muscle+cells+expressing+functional+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology-Animal%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human umbilical artery smooth muscle cells expressing functional calcium channels.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 45 (3), 175-184 (2009).</li>
</ol>

Le SMC peut être utilisé en tant que modèles pour les essais futurs avec des médicaments constrictor, d&#39;isoler et de caractériser les canaux calciques structurellement de type L, d&#39;étudier les aspects cellulaires et moléculaires de la fonction vasculaire et de les utiliser dans l&#39;ingénierie tissulaire. SMC et ECS sont fondamentales pour le développement de nouveaux biomatériaux qui peuvent être utilisés dans la production de semi-synthèse des vaisseaux sanguins pour être utilisé chez l&#39;homme.

<table><tbody><tr><td>DMEM-F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>095K8311</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Biochrom AG</td><td>0117T</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>3103806</td><td></td></tr><tr><td>Collagène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>067K2302</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique</td><td></td><td></td><td>10 &amp;#x03BC;L/ 1 mL de milieu</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td></td><td></td><td>Stérilisés</td></tr><tr><td>Aiguille</td><td></td><td></td><td>Diamètre de 0,6-1 mm</td></tr><tr><td>Seringue</td><td></td><td></td><td>10 - 20 mL</td></tr><tr><td>Solution saline physiologique (PSS)</td><td></td><td></td><td>20-40 mL par artère</td></tr><tr><td>Collagénase de type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>047K1052</td><td>3 mL par artère</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée de Hank&amp;rsquo;s (HBSS)</td><td></td><td></td><td>Collagénase diluée</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td></td><td></td><td>Chauffée à 37&amp;#x00B0;C</td></tr></tbody></table>

l&#39;isolement de l&#39;homme de l&#39;artère ombilicale cellules musculaires lisses (huasmc)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Le cordon ombilical humain (UC) est un échantillon biologique qui peut être facilement obtenue juste après la naissance. Cet échantillon biologique est, la plupart du temps, mis au rebut et leur collection ne signifie pas que tout risque ajoutée à la santé maternelle et néonatale ou la mère s. En outre, aucune des préoccupations éthiques sont soulevées. L&#39;UC est composé d&#39;une veine et deux artères à partir de laquelle les deux cellules endothéliales (CE)<sup&gt; 1</supCellules musculaires&gt; et lisse (SMC)<sup&gt; 2</sup&gt;, Deux des principaux composants cellulaires des vaisseaux sanguins, peut être isolé. Dans ce projet, le SMC ont été obtenues après traitement enzymatique des artères UC conséquence la procédure expérimentale décrite précédemment par Jaffe<em&gt; Et al</em<sup&gt; 3</sup&gt;. Après isolement des cellules qu&#39;ils ont été conservés dans le T-Flash avec du DMEM-F12 supplémenté avec 5% de sérum de veau fœtal et ont été cultivées pendant plusieurs passages. Les cellules ont conservé leur morphologie et d&#39;autres caractéristiques phénotypiques dans les différentes générations. Le but de cette étude était d&#39;isoler les cellules musculaires lisses afin de les utiliser comme modèles pour les essais futurs avec des médicaments constrictor, d&#39;isoler et de caractériser structurellement canaux calciques de type L, d&#39;étudier les aspects cellulaires et moléculaires de la fonction vasculaire<sup&gt; 4</sup&gt; Et de les utiliser dans l&#39;ingénierie tissulaire.

Le cordon ombilical sont utilisées pour isoler des cellules musculaires lisses de différentes façons. Dans ce travail nous avons utilisé le traitement enzymatique de cellules musculaires lisses isolées.

L&#39;isolement de l&#39;homme de l&#39;artère ombilicale cellules musculaires lisses (HUASMC)

Le cordon ombilical humain (CO) est un échantillon biologique pouvant être facilement obtenu juste après la naissance. Cet échantillon biologique est, la plupart du temps, jeté...

Pour isoler les cellules musculaires lisses artérielles ombilicales humaines, j'ai utilisé les solutions suivantes : PSS (solution saline physiologique), FBS (sérum bovin fœtal), sérum inactivé, AB (antibiotique et antimycotique), PBS (solution saline tamponnée au phosphate), DMEM/F12, collagénase et HBSS (solution saline équilibrée de Hank) pour dissoudre la collagénase de type I.En ce qui concerne la manipulation des échantillons, l'ensemble du processus est effectué dans une cabine de flux laminaire. Le cartilage amical est découpé en petits morceaux de trois à sept centimètres. Ensuite, les morceaux sont placés dans un récipient plus grand contenant un antibiotique PSS, un antimycosique et des antiprotéases afin d'éviter toute détérioration ou perte de viabilité cellulaire.L'isolement est effectué à une température de quatre degrés Celsius. Le chercheur indique maintenant la veine et les artères présentes dans le cordon ombilical. La gelée de Wharton qui entoure les artères est soigneusement retirée par incision.Nous utilisons des ciseaux pour retirer la double couche du reste à l'intérieur des vaisseaux. Les artères sont maintenues verticalement et perfusées avec du PSS à l’ai

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Ce protocole vidéo illustre l'isolement et la culture de cellules humaines endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) de cordon ombilical humain. Une fois isolé ces cellules peuvent être utilisées pour des dosages angiogenèse in vitro comme le dosage optimisé fibrine billes de gel a également démontré par le laboratoire de M. Hughes.

Isolement de cellules humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC)

Nous avons développé une nouvelle technique et reproductible pour isoler les cultures primaires de cellules musculaires lisses de l'artère pulmonaire (PASMC) de souris dès l'âge de P7, ce qui permet une meilleure étude des voies de signalisation impliquées dans la contraction des cellules musculaires lisses néonatale et de détente.

Isolement de l&#39;artère pulmonaire cellules musculaires lisses de souris néonatales

Les vaisseaux sanguins à l'intérieur du squelette port musculaire plusieurs populations de précurseurs multi-lignée humaine qui sont idéales pour les applications de régénération. Cette méthode permet l'isolement de purification simultanée de trois populations de cellules précurseurs pluripotentes respectivement à partir de trois couches de structure des vaisseaux sanguins: les cellules myogéniques endotheliales de l'intima, média de péricytes et les cellules de l'adventice de l'adventice.

Isolement des vaisseaux sanguins dérivés multipotentes précurseurs du muscle squelettique humain

Le but de ce protocole est de démontrer les techniques d'isolement et de culture de cellules murines primaires musculaires lisses vasculaires (CMLV) de la circulation coronaire. Une fois que les CMLV ont été isolés, ils peuvent être utilisés pour de nombreuses techniques de culture standard.

Isolement de murin coronaire vasculaires cellules de muscle lisse

cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) proviennent de (hemogenic) des cellules endothéliales spécialisées au cours du développement, mais on sait peu sur le processus par lequel certaines cellules endothéliales spécifient pour devenir la formation du sang. Nous démontrons une méthode basée sur la cytométrie de flux permettant l'isolement simultané des cellules endothéliales hemogenic et HSPC de tissus embryonnaires murines.

Isolement des cellules embryonnaires murines Hemogenic endothéliales

Cet article décrit une méthode basée sur la culture d’explants pour l’isolement et la culture de cellules musculaires lisses aortiques humaines primaires spécifiques au patient et de fibroblastes dermiques. En outre, une nouvelle méthode est présentée pour mesurer la contraction cellulaire et l’analyse ultérieure, qui peut être utilisée pour étudier les différences spécifiques au patient dans ces cellules.

Isolement des cellules musculaires lisses aortiques primaires spécifiques au patient et mesures semi-quantitatives de contraction en temps réel in vitro

Le protocole décrit l’isolement, la culture et le profilage des cellules endothéliales de l’artère mésentérique humaine. En outre, une méthode est fournie pour préparer l’artère humaine à la transcriptomique spatiale. La protéomique, la transcriptomique et les tests fonctionnels peuvent être effectués sur des cellules isolées. Ce protocole peut être réutilisé pour n’importe quelle artère de taille moyenne ou grande.

Isolement et profilage des cellules endothéliales artérielles mésentériques primaires humaines au niveau du transcriptome

Cette étude présente une procédure unique de dissection contondante pour préserver l’intégrité de la gelée de Wharton (WJ), ce qui permet d’obtenir moins de WJ endommagés et une plus grande quantité et viabilité des cellules souches mésenchymateuses (CSM) récoltées. La méthode démontre un rendement et une capacité de prolifération supérieurs par rapport aux méthodes conventionnelles de dissection tranchante.

Isolement de cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical à haut rendement et à faible dommage

L’isolementdes CSM BAMBIà hauteMFGE8, l’un des trois principaux sous-groupes constituant les CSM-UC humaines hétérogènes, est utile pour bien comprendre les caractéristiques et les fonctions de ce sous-type en vue de son application future pour améliorer l’efficacité clinique dans des maladies spécifiques. Nous présentons ici une méthode de tri des UC-MSCBAMBI highMFGE8.

Isolement de cellules stromales mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical BAMBIhumain

Détails des méthodes à haute résolution...

Ca focale 2 + Détection de transitoires dans le muscle lisse

Apprenez l'isolation de cellules musculaires lisses de l'artère ombilicale humaine par traitement enzymatique au collagénase. Cette méthode préserve la viabilité cellulaire pour des études en biologie cellulaire.

L'isolement de l'homme de l'artère ombilicale cellules musculaires lisses (HUASMC)

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