Name: Linstillation trachéale directe des solutés dans les poumons de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Apprenez l'instillation trachéale directe chez la souris pour délivrer des solutés dans les poumons. Cette méthode cible les alvéoles et améliore la recherche en physiologie respiratoire et modèles animaux.

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Ce travail a été soutenu par le NIH K99 HL09222601 et le S &amp; R Fondation Ryaji Uneo Award décerné à MNH.

1. L'anesthésie <ol><li> Anesthésier les souris avec de l'isoflurane peut faciliter la manipulation des animaux et à la retenue avant d'administrer l'anesthésie intraperitaneally. En utilisant un anesthésique par inhalation peut être ou ne pas être approprié pour une étude particulière: d'abord déterminer l'impact de l'utilisation de l'isoflurane, ou tout autre anesthésique, sur l'étude des poumons proposé. </li><li> Anesthetize animaux à l'isoflurane. La vidéo montre l'utilisation d'une chambre d'isoflurane vaporisateur fixé à 2% d'isoflurane mélangé avec l'oxygène. Si vous n'avez pas une chambre de l'isoflurane, vous pouvez également utiliser des techniques standard de l'exposition ouverte à goutte. Joindre des rats dans une cloche de verre (ou d'autres non poreux contenant) avec un grillage monté sur le fond. Pour un tampon de gaze placée sous le treillis métallique, appliquez un mélange de 30% v / v isoflurane dans du propylène glycol. L'utilisation de la maille assure que l'animal ne vienne pas en contact avec le tampon imbibé d'isoflurane, ce qui pourrait causer des irritations de la peau et le surdosage potentiel. Après courte exposition à l'isoflurane, l'animal doit être anesthésié et ne répondra pas à un réflexe de redressement lorsque le pot est incliné et ne répondra pas, après pincement de l'orteil. </li><li> Souris plus calmes avec une injection intra-péritonéale d'un mélange de xylazine et de kétamine. (Il est de bonne pratique lors de la réalisation des injections intrapéritonéales de reculer pour s'assurer que des portions de l'intestin ou d'autres organes vitaux n'ont pas été pénétrés). Mélanger 150 uL xylazine (100 mg / mL) avec 1000 kétamine uL (100 mg / mL) en 8850 uL de phosphate stérile à 0,9% saline tamponnée (PBS). Pour les souris, la dose sera d'environ 80 pi par 10 g de poids corporel. Les concentrations finales sera de 10 mg / kg de xylazine et de 100 mg / kg de kétamine. Les animaux doivent être gardés au sec et isolés pour prévenir la perte excessive de chaleur corporelle. Pommade ophtalmique peut être appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée. </li></ol> 2. Préparation de la zone chirurgicale <ol><li> Rasage de la zone où l'incision chirurgicale sera faite empêche la contamination de la non-préparée domaines. Un rasoir électrique peut se raser de près la fourrure de l'animal. La zone rasée doit être plus grand que le site d'incision. </li><li> L'application ultérieure de crème dépilatoire, comme Nair, va supprimer toutes les fourrures restantes. Appliquer une couche épaisse de crème d'épilation à la zone chirurgicale et laisser agir pendant 3 minutes. Essuyer la fourrure et la crème d'épilation avec une serviette humide. Ne laissez pas la crème épilation au-delà de 10 minutes. </li><li> Utilisez de l'alcool à 70%, ou une solution gommage alternative, pour préparer la zone aseptique chirurgicale. </li></ol> 3. Procédure chirurgicale <ol><li> Position de l'animal anesthésié sur une planche inclinée chirurgicale, ou un support de retenue angulaires. </li><li> Faire une petite incision près de la face antérieure du cou (région de la gorge). </li><li> Disséquer loin le peaucier et antérieure muscles trachéaux, afin de visualiser et accéder aux anneaux de la trachée. </li><li> Typiquement, les volumes d'injection intratrachéale de 3 grammes ul par des poids (environ 30 à 75 volumes uL final). Administrer la quantité appropriée de l'aide d'une instillation sous-cutanée de 1 ml (sous-Q) seringue avec un calibre 30, l'aiguille 5/16-inch. Tenez le côté conique de seringues et parallèle à la trachée, et injecter le volume complet de instillation dans la trachée. </li><li> L'animal peut réagir en haletant après l'instillation de soluté dans les poumons. Présentation de l'air à travers la seringue et en observant si les poumons se dilatent confirmera également les techniques de l'intubation. </li><li> Retirez la seringue de la trachée. </li></ol> 4. Sutures. <ol><li> Saisir sertissage de l'aiguille (partie la plus épaisse de l'aiguille où le matériel de suture est ci-jointe) avec un porte-aiguille. </li><li> Pénètrent dans la peau avec la pointe de l'aiguille à 90 ° environ 1-3 mm Angle loin du bord de la plaie, en fonction de l'épaisseur de la peau. Saisir l'aiguille de quitter après un passage à travers le tissu. Points de suture simple, nouées individuellement, seront efficacement fermer la plaie. </li></ol> 5. Récupération des animaux <ol><li> Les animaux devraient se remettre complètement de l'anesthésie et l'intervention chirurgicale, après 3-24 heures. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Instillation intratrachéale de composé fluorescent, Cy5.5 conjugué à dextrane, montre l'instillation réussie de composé fluorescent dans B6 poumons de souris (figure 1). Le colorant fluorescent est principalement ciblée sur les poumons et est uniformément répartie. Signal fluorescent dans le tractus gastro-intestinal, immédiatement après la procédure indique que l'œsophage a été intubé par inadvertance lors de la procédure (figure 2). Les enquêteurs peuvent également vérifier la livraison ciblée de composés dans le poumon, et de vérifier la distribution de l'instillation, en suivant la procédure en gonflant les poumons et la préparation des tranches de tissu pulmonaire (2, 3) ou fixes histologique des échantillons. <img src="/files/ftp_upload/1941/1941fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Fluorescent Cy5.5 signal de co-enregistrées avec des rayons X dans les poumons de souris image de succès inculqué. 1,4 mg Cy5.5 Dextran (à une concentration de 10 ug / uL) a été instillée dans la trachée des poumons de souris B6. Cy5.5 signal n'a été détecté en utilisant un filtre d'excitation 675 nm et 695 nm d'un filtre d'émission. <img src="/files/ftp_upload/1941/1941fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Co-enregistrement de signal fluorescent montré avec X-ray superposition de souris mal inculquée. Intubation inapproprié de l'oesophage au cours trachéale des résultats du protocole d'instillation dans Cy5.5 livraison à l'intestin.

<ol><li>Driscoll, K. E., Costa, D. L., Hatch, G., Henderson, R., Oberdorster, G., Salem, H., Schlesinger, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratracheal+instillation+as+an+exposure+technique+for+the+evaluation+of+respiratory+tract+toxicity%3A+uses+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations.</a> Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).</li>
<li>Helms, M. N., Jain, L., Self, J. L., Eaton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+epithelial+sodium+channels+examined+in+alveolar+type+1+and+2+cells+patch-clamped+in+lung+slice+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of epithelial sodium channels examined in alveolar type 1 and 2 cells patch-clamped in lung slice tissue.</a> J Biol Chem. 283, 22875-22883 (2008).</li>
<li>Helms, M. N., Self, J., Bao, H. F., Job, L. C., Jain, L., Eaton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+activates+amiloride-sensitive+sodium+channels+in+alveolar+type+I+cells+in+lung+slice+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dopamine activates amiloride-sensitive sodium channels in alveolar type I cells in lung slice preparations.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291, L610-L618 (2006).</li>
<li>Iyer, S. S., Ramirez, A. M., Ritzenthaler, J. D., Torres-Gonzalez, E., Roser-Page, S., Mora, A. L., Brigham, K. L., Jones, D. P., Roman, J., Rojas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+extracellular+cysteine%2Fcystine+redox+state+in+bleomycin-induced+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Oxidation of extracellular cysteine/cystine redox state in bleomycin-induced lung fibrosis.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L37-L45 (2009).</li>
<li>Li, T., Folkesson, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+for+alpha-ENaC+inhibits+rat+lung+fluid+absorption+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNA interference for alpha-ENaC inhibits rat lung fluid absorption in vivo.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 290, L649-L660 (2006).</li>
<li>Sager, T., Porter, D., Robinson, V., Lindsley, W., Schwegler-Berry, D., Castranova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+to+disperse+nanoparticles+for+in+vitro+and+in+vivo+investigation+of+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicol%22%5BJournal%5D)">An improved method to disperse nanoparticles for in vitro and in vivo investigation of toxicity.</a> Nanotoxicol. 1, 118-129 (2007).</li>
<li>Xu, J., Gonzalez, E. T., Iyer, S. S., Mac, V., Mora, A. L., Sutliff, R. L., Reed, A., Brigham, K. L., Kelly, P., Rojas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+senescence-accelerated+mouse+model+in+bleomycin-induced+lung+injury+suggests+that+bone+marrow-derived+cells+can+alter+the+outcome+of+lung+injury+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Use of senescence-accelerated mouse model in bleomycin-induced lung injury suggests that bone marrow-derived cells can alter the outcome of lung injury in aged mice.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64, 731-739 (2009).</li>
<li>Yeh, T. F., Lin, H. C., Chang, C. H., Wu, T. S., Su, B. H., Li, T. C., Pyati, S., Tsai, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+intratracheal+instillation+of+budesonide+using+surfactant+as+a+vehicle+to+prevent+chronic+lung+disease+in+preterm+infants%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Early intratracheal instillation of budesonide using surfactant as a vehicle to prevent chronic lung disease in preterm infants: a pilot study.</a> Pediatrics. 121, e1310-e1318 (2008).</li>
</ol>

Instillations intra-trachéale ont été utilisées dans plusieurs études différentes pour évaluer la toxicité des composés d&#39;essai (6), induisent des lésions pulmonaires alvéolaires (4, 7), remplacer les tensioactifs (8), ainsi que de modifier l&#39;expression des gènes via la livraison de petits oligonucleotides directement dans le poumon (5). Nous explorons actuellement l&#39;utilisation d&#39;instiller 1) fluorescentes redox matériau sensible dans les poumons afin de mesurer le stress oxydatif in vivo dans des condi...

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Webster Veterinary</td><td>14043-220-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd, Inc.</td><td></td><td>Dossier de médicament vétérinaire autorisé n°139-236</td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Bioniche Pharma</td><td>67457-001-10</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td></td><td></td><td>Disponible en pharmacie</td></tr><tr><td>Seringue sous-cutanée de 1 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td>26 5/8 G</td></tr><tr><td>Filet de suture en nylon 4-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td>1894G.S30</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;instillation trachéale directe des solutés dans les poumons de souris

Direct Tracheal Instillation of Solutes into Mouse Lung

Instillations intratrachéale offrir solutés directement dans les poumons. Cette procédure vise la livraison de l&#39;instillation dans les régions distales du poumon, et est donc souvent incorporées dans des études visant à étudier les alvéoles. Nous fournissons un protocole de survie détaillées pour effectuer des instillations intra-trachéale chez les souris. En utilisant cette approche, on peut cibler la livraison des solutés de test ou des solides (comme les traitements du poumon, tensioactifs, les virus et les oligonucléotides de petite taille) dans le poumon distal. Instillations trachéales peut être la méthode privilégiée, sur les protocoles d&#39;inhalation qui peut ciblent principalement les voies respiratoires supérieures et peut exposer le chercheur à des substances potentiellement dangereuses. En outre, en utilisant le protocole d&#39;instillation trachéale, les animaux peuvent se remettre complètement de la procédure non-invasive. Cela permet de faire suite des mesures physiologiques sur les animaux d&#39;essai, ou à la réinstallation en utilisant le même animal. Le montant de l&#39;instillation introduit dans les poumons doit être soigneusement déterminé et osmotiquement équilibrée pour assurer la récupération des animaux. Typiquement, le volume de 30 à 75 uL instillation peuvent être introduits dans des poumons de souris.

Instillations intratrachéale offrir solutés directement dans les poumons. Cette procédure vise la livraison de l&#39;instillation dans les régions distales du poumon, et est donc souvent incorporées dans des études visant à étudier les alvéoles. Nous fournissons un protocole de survie détaillées pour effectuer des instillations intra-trachéale chez les souris.

L&#39;instillation trachéale directe des solutés dans les poumons de souris

Les instillations intratrachéales permettent d'administrer des solutés directement dans les poumons. Cette procédure vise à acheminer le produit d'instillation vers les régions distales des...

Dans cette procédure, les solutés peuvent être directement administrés dans les poumons. Insufflez d'abord dans la trachée. Retirez le pelage du petit rongeur et pratiquez une petite incision près de l'aspect antérieur du cou.Exposer la trachée. Utiliser une aiguille sous-cutanée d'un millilitre pour instiller trois microlitres de solution par gramme de poids corporel par voie trachéale. Retirer la seringue et suturer la plaie.Bonjour, je suis le Dr Ma Helms du Département de physiologie de l'Université Emory. Bonjour, je suis le Dr Mauricio Rojas du Département de médecine de l'Université Emory. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d'instiller directement des solutés dans les parties distales du poumon.Nous utilisons couramment cette procédure dans mon laboratoire pour étudier l'élimination du liquide pulmonaire en réponse à l'instillation de divers composés, et nous employons cette technique dans mon laboratoire pour administrer du bli. Création d'un modèle murin mâle de lésion pulmonaire. L'instillation directe de solutés dans les poumons de petits rongeurs pourrait s'avérer utile dans vos études.Commençons. En préparation de la chirurgie, la souris est d'abord anesthésiée à l'isoflurane, puis davantage sédatée par une injection intrapéritonéale d'un mélange de xylazine et de kétamine. Effectuez une pression sur l'orteil pour confirmer que l'animal est complètement anesthésié.Ensuite, utilisez un rasoir électrique pour raser le pelage de la zone chirurgicale. Pour éliminer les poils résiduels, appliquez une couche épaisse de crème dépilatoire sur la zone chirurgicale. Laissez la crème dépilatoire agir pendant trois minutes, puis essuyez les poils et la crème avec une serviette humide.Nettoyez la zone chirurgicale avec de l'alcool à 70 %, puis avec une solution antiseptique à la Bétadine. Préparez l'animal de manière aseptique. L'animal est maintenant prêt pour l'intervention chirurgicale.Pour commencer la procédure d'installation intratrachéale, placer l'animal anesthésié sur une planche chirurgicale inclinée. Réaliser une petite incision près de la partie antérieure du cou ou de la région du larynx. Utiliser une pince pour écarter le platysme, puis effectuer une incision sur les muscles trachéaux antérieurs.Cela vous permettra de visualiser et d'accéder aux anneaux trachéaux. Une fois la trachée exposée, administrez la quantité appropriée d'installate à l'aide d'une aiguille et d'une seringue sous-cutanées d'un millilitre. Tenez la seringue avec le biseau orienté vers le haut et parallèlement à la trachée, puis injectez tout le volume d'installate dans la trachée.Un volume typique d'injection intratrachéale est de trois microlitres par gramme de poids corporel. Retirer la seringue de la trachée. L'animal peut réagir par une respiration saccadée après l'instillation de la solution dans les poumons.Introduire de l'air à l'aide de la seringue et observer si les poumons se dilatent permet également de confirmer que l'intubation a été réussie. Fermer l'incision à l'aide de quatre points de suture en nylon 4-0. Saisir l'aiguille en pincant la partie la plus épaisse de l'aiguille, là où le fil de suture est fixé, à l'aide d'un porte-aiguille, puis pénétrer la peau avec la pointe de l'aiguille perpendiculairement, selon un angle de 90 degrés, à environ un à trois millimètres du bord de la plaie.En fonction de l'épaisseur de la peau, saisissez l'aiguille en sortie après un seul passage à travers le tissu. Des points simples, noués individuellement, permettront de fermer efficacement la plaie. Voici quelques résultats représentatifs d'installations intratrachéales. Cette première image montre une installation réussie d'un composé fluorescent, le sci-fi 0,5 conjugué à la dextrine, dans un poumon de souris black six.La co-localisation du signal SCI 5,5 avec l'image aux rayons X confirme que le colorant fluorescent est principalement ciblé vers le poumon et qu'il est uniformément distribué immédiatement après l'instillation. En revanche, cette seconde image montre le résultat obtenu chez une souris mal instillée. La présence du signal fluorescent dans le tube digestif immédiatement après la procédure indique que l'œsophage a été intubé par erreur durant l'intervention.Nous venons de vous montrer comment instiller directement des solutés dans les parties distales du poumon. Lorsque vous effectuez cette manipulation ou toute autre procédure, il est important de suivre les directives de votre propre établissement concernant l'utilisation des animaux en recherche. Voilà donc ce qu'il faut retenir.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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