Extraction d'ADN de l'microbes de l'intestin des termites (Zootermopsis Angusticollis) et Visualisation microbes de l'intestin

Ici, votre réaction à cet environnement n’est pas, n’est pas unique. La plupart des gens, même les non-scientifiques, sont assez époustouflés. oui. Par le, La diversité et la complexité.

Bonjour, je m’appelle Eric Matson et je suis postdoctorant au Département d’ingénierie environnementale et scientifique du California Institute of Technology. Mes travaux sous la direction du professeur Jared Ledbetter portent sur les interactions microbiennes et la diversité des espèces qui habitent l’intestin postérieur des termites. En particulier, nous nous intéressons à certaines des voies biochimiques qui se déroulent et nous nous intéressons particulièrement au processus d’agénésie de l’as, par lequel ces microbes consomment de l’hydrogène et du CO2 et les convertissent en acétate, qui est un nutriment clé du métabolisme énergétique de l’hôte termite.

D’autres membres du laboratoire et moi-même avons mis au point des ensembles d’amorces ciblés pour pouvoir évaluer les enzymes clés de cette voie. Mais pour ce faire, nous devons générer des échantillons d’ADN propre de la communauté communautaire, l’ADN, afin de les utiliser comme cibles pour ce processus. Aujourd’hui, je voulais donc montrer comment nous disséquons l’espèce de termite dont nous parlons, extrayons l’ADN de l’intestin postérieur, puis le purifions pour l’utiliser plus tard pour des investigations.

Aujourd’hui, nous allons nous concentrer sur une espèce de termite, en particulier appelée Zo Opsis Nevadensis. Il s’agit d’un termite de bois humide de Californie collecté localement ici, et c’est une espèce assez grande, ce qui rend assez facile de faire les dissections et les extractions. D’accord, donc aujourd’hui, j’ai déjà préparé certaines des fournitures dont nous aurons besoin pour la procédure.

L’une des premières choses dont nous avons besoin, c’est d’une certaine quantité de glace pour refroidir les insectes qui seront disséqués. J’ai également pré-refroidi un tampon TE, et celui-ci contient un composé qui aidera à stabiliser l’ADN une fois qu’il sera libéré des cellules ici. J’ai des flacons stériles préchargés de billes de zircon et de silicate de zircone.

Ce sont des perles de 0,1 millimètre et il y a environ un demi-gramme ici. C’est ce que nous allons faire en réalité, le cisaillement mécanique. Et puis j’ai quelques réactifs impliqués dans la procédure de lyse et de purification.

Ici, j’ai une bouteille contenant 1 % de polyvinyle PolyOne ou PVPP dans le tampon. Le PVPP est important pour éliminer les acides humiques des préparations d’ADN, ce qui peut inhiber notre analyse PCR des résultats. Et puis j’ai du sulfate de sodium ECCO, qui est un tensioactif que nous utiliserons pour aider à extraire et à perturber les cellules.

Et puis pour faire la dissection des termites, tout ce dont nous avons besoin, c’est de pinces stériles. Ceux-ci sont assez fins et c’est ce que nous utiliserons réellement pour enlever les traces intestinales. Et enfin, pour faire le cisaillement mécanique, nous avons ici un dispositif de battement d’abeilles qui tourne à, à, à des régimes très élevés et, avec les billes de silicate de zirconium zir, fera la perturbation mécanique des cellules.

Donc, après avoir collecté les termites sur le terrain, nous les ramenons ici au laboratoire. La plupart des termites de bois humide de Californie avec lesquels nous travaillons sont très sujets à la dessiccation. Ainsi, l’une des avancées que nous avons réalisées dans ce laboratoire est d’incorporer l’utilisation de chambres à humidité contrôlée, telles que ces aquariums de 10 gallons.

À l’intérieur, ici, nous recueillons les colonies individuelles et les gardons séparées dans celles-ci, dans ces boîtes. Et à la base du réservoir se trouvent essentiellement des conteneurs contenant différentes solutions de sel. Celui-ci contient une solution de phosphate de potassium, qui maintient l’humidité relative autour de 95 à 96 %, ce qui est parfait.

Et, et dans ces conditions, nous avons eu des termites qui se reproduisent en captivité, bien que, lorsque nous voulons mener une expérience, nous récoltons des déchets frais sur le terrain. Mais dans cette boîte, vous pouvez voir une partie du bois dont ils se nourrissent. Il s’agit simplement de Ponderosa ou de pin Jeffrey que nous recueillons sur le site du nid de termites.

Et il existe un certain nombre de moulages de termites différents, y compris les reproducteurs mâles et femelles. La plupart de la colonie est composée de termites ouvriers avec le nombre de, de moulages de soldats également. Il est intéressant de noter que les soldats ont des mandibules buccales conçues pour défendre la colonie plutôt que pour manger le bois.

Et donc ils dépendent des termites ouvriers pour les nourrir aussi. Et donc vous pouvez voir dans cette boîte à la fois des ouvrières et des termites soldats ainsi que des jeunes qui ont récemment éclos d’œufs. Bien en captivité ici.

J’ai donc sélectionné cinq termites ouvriers dans le groupe que je viens de vous montrer. Et j’ai commencé par les refroidir sur de la glace ici. Pour me préparer à la dissection, je vais utiliser ces pinces et travailler à l’aide d’une lunette de dissection, et j’espère que vous pourrez voir le grand volume intestinal que nous pourrons retirer, de chacune de ces personnes.

Il suffit de retourner le termite sur le dos et avec une pince, vous tenez la tête et avec l’autre, tout ce que vous faites est de pincer. Juste à l’extrémité de l’abdomen ici. Et avec un pôle, vous devriez voir le tractus intestinal être retiré de l’organisme. D’accord.

Et vous pouvez voir que le grand volume, environ 30 % 40 % du poids de l’insecte est en fait, est en fait contenu dans cet environnement. Et vous pouvez voir qu’il est divisé en plusieurs sections. Nous avons les quatre intestins, puis l’intestin moyen, puis ce poinçon de l’intestin arrière, qui est la très grande chambre qui contient la majeure partie, la majeure partie de la communauté microbienne qui effectue les fermentations.

Donc, ici, j’ai enlevé les tripes de cinq termites ouvriers. Et maintenant, la prochaine étape consiste à stabiliser les acides nucléiques qui sont contenus dans la communauté ici dans une solution de tampon glacée. À ce stade, ils peuvent être congelés à moins 20 degrés Celsius si vous travaillez sur le terrain.

Ou nous pouvons continuer directement avec la procédure d’extraction. Mais toutes les cellules et l’ADN sont toujours contenus dans l’intestin. Et je vais juste les mettre dans 100 microlitres de tampon.

D’accord, avant de commencer l’extraction des échantillons intestinaux, je dois préparer le tampon que je vais utiliser pour perturber les cellules et les tissus. Donc, à ce tube où j’ai déjà environ un demi-gramme de billes de zircon, je vais ajouter du PVPP 700 microlitres de celui-ci. Il s’agit du tampon de 1 % et de 50 microlitres d’une solution de 20 % de SDS.

Il est important de remettre en suspension le PVPP avant de l’ajouter, car il est insoluble dans les tampons aqueux. À ce stade, nous sommes prêts à ajouter le phénol à l’échantillon, je vais donc utiliser une pipette pour ajouter environ 500 microlitres. D’accord. Et sur ce, nous sommes prêts à commencer l’extraction. oui.

Avec le phénol ajouté, nous sommes prêts à ajouter l’échantillon d’intestin que nous avons disséqué du termite plus tôt, ce qui aide à faire macérer un peu les tissus. Cela a tendance à rendre le transfert un peu plus facile. Et maintenant, avec le phénol ajouté, nous sommes prêts à commencer la perturbation mécanique avec le dispositif de perlage de billes.

La technique que nous allons utiliser est de trois cycles à pleine vitesse, 30 secondes, suivis de 30 secondes sur la glace. Il est important d’incorporer le pas sur la glace pour refroidir l’échantillon car il a tendance à chauffer à cause de la friction. Je vais donc simplement insérer l’échantillon dans le dispositif de perlage de perles ici, et je vais y aller pendant 30 secondes. D’accord.

À la fin de l’intervention, vous devriez voir que la plupart des tissus ont été homogénéisés. Il devrait rester très peu de touffes, et vous verrez que c’est, ça a une sorte d’apparence savonneuse, probablement à cause du SDS là-dedans. À ce stade, nous sommes prêts à centrifuger, puis à commencer l’extraction proprement dite de la purification de l’ADN lui-même à partir de cet échantillon.

Maintenant que nous avons perturbé mécaniquement les cellules, nous allons centrifuger le matériau insoluble. Pour ce faire, nous mettrons la centrifugeuse dans la centrifugeuse et utiliserons 8 000 fois la gravité pendant une minute. Et maintenant, ce que nous nous attendons à voir, c’est la plupart des matériaux solubles collectés près du fond du tube.

Et ce qui nous intéresse, c’est la solution aqueuse en haut. Et c’est ce que nous allons en fait ajouter au kit d’extraction d’ADN KaiGen en suivant la procédure pour le lysat brut. Maintenant que nous avons notre centrifugeuse d’échantillons, nous allons prendre 200 microlitres par préparation du surnageant, et nous allons extraire l’ADN simplement à l’aide du kit A-D-N-E-Z KaiGen en utilisant le protocole indiqué pour le lysat brut.

Nous avons maintenant les 200 microlitres d’échantillon d’intestin, et je vais procéder à l’utilisation du kit kyogen d easy en utilisant le protocole indiqué pour le lysat brut. Chaque fois que nous effectuons une extraction intestinale, c’est toujours une bonne idée de vérifier l’état du contenu de l’intestin. Nous le faisons donc en disséquant un termite et en nous assurant qu’il est représentatif des choses que nous avons vues dans le passé.

Nous allons le faire visuellement en regardant les cellules de cette communauté microbienne. Juste à l’extrémité de l’abdomen ici. Et avec un pôle, vous devriez voir le tractus intestinal.

Il ne s’agit donc que d’une solution saline tamponnée qui correspond très étroitement à la composition du liquide intestinal réel du termite. Et je vais juste faire macérer cela un peu, puis je l’ajouterai à la lame de microscope et nous jetterons un coup d’œil. D’accord, nous sommes maintenant prêts à regarder cela au microscope.

Oui, ça a l’air vraiment bien. Boyau de termite. Il y a des représentants des trois domaines reconnus de la vie.

Il y a des protozoaires eucaryotes, il y a des organismes méthamphétamines, et puis il y a aussi des bactéries. Et notre laboratoire s’intéresse principalement à la population bactérienne dans cet environnement. À savoir, les kes SPI dans ce type particulier de pousse, les keets sont parmi les membres bactériens les plus dominants de la communauté.

Et nos recherches actuelles montrent qu’en fait, ils s’engagent dans une large mesure dans une cétogenèse réductrice de CO2. Il ne s’agit donc que de différents types de protozoaires, et on pense qu’ils participent, à savoir à la, à la, à la, à la décomposition primaire du bois. On pense donc qu’ils contiennent des AE de xine et de la cellulase qui permettent à leurs enzymes d’accéder à ces polymères du bois.

Et, et puis ils, ils les fermentent en monomères de sucre monomères et, et, et, et , et des polymères qui sont ensuite décomposés par d’autres membres de la communauté. Et ces protozoaires produisent également de l’acétate eux-mêmes, mais, mais l’un de leurs sous-produits est l’hydrogène et le CO2 et cet hydrogène et ce CO2 sont encore une fois, c’est ce qui est utilisé ou consommé par les populations d’acéto dans cet environnement. Et ici, vous pouvez juste voir un essaim de, d’organismes protozoaires probablement juste à côté d’une très grande espèce de, de trick et infa là-bas.

C’est l’un des plus grands organismes de l’intestin des termites. En descendant et en regardant les zones qui ne contiennent pas ces grandes cellules de protozoaires, vous verrez que l’arrière-plan est ce type de liquide interstitiel qui est, est également chargé de spi, de poussins et d’autres cellules bactériennes. Et donc, vous savez, la complexité n’en devient pas moindre, même dans ces espaces.

L’une des choses que je dois souligner, c’est que le volume typique du poinçon de l’intestin postérieur, comme celui que nous avons examiné ici, est de deux à cinq microlitres selon la taille du termite. Et donc, la préparation du montage humide que j’ai faite ici représente vraiment au moins une dilution de un à 20 de cet environnement. Et donc c’est en fait que ces espèces sont, sont entassées beaucoup, beaucoup plus densément dans l’intestin intact que ce qui est représenté ici.

Cela vous donne une idée de la densité et de la diversité de la vie dans cet environnement. Aujourd’hui, je vous ai montré comment nous isolons l’ADN de l’intestin des termites avec ces échantillons purifiés. Nous allons maintenant pouvoir appliquer les ensembles d’apprêts ciblés spécifiques.

À savoir, nous allons examiner les gènes pour former une déshydrogénase, une monomyoxyde de carbone déshydrogénase et une synthèse formelle de tétrahydro-folate, qui sont trois des ensembles d’amorces que notre laboratoire a développés. Nous nous intéressons à l’étude de la diversité et des caractéristiques spécifiques des séquences d’un certain nombre de ces différents gènes pour cet environnement. Il s’agira donc d’amplifier les différents gènes, de les cloner, de les séquencer et de constituer des inventaires de gènes.

Sur la base des résultats, nous pouvons en apprendre quelque chose sur la nature de certaines de ces interactions et plus particulièrement sur la façon dont ces voies sont construites dans ces différents micro-organismes par le biais de ce processus.