La différenciation des cellules souches embryonnaires en précurseurs d'oligodendrocytes

L’objectif global de l’expérience suivante est de générer des précurseurs d’oligodendrocytes à partir de cellules souches embryonnaires via une série d’étapes de culture sur 30 jours. Ceci est réalisé en générant d’abord des corps embryonnaires à partir de cellules ES de souris pour initier la différenciation cellulaire. Dans un deuxième temps, les corps embryonnaires sont traités avec de petites molécules, l’acide rétinoïque et la morphine pure, qui induisent la différenciation dirigée des cellules en une ligadienne.

Précurseurs cytaires. Dans un troisième temps, les corps embryonnaires sont désagrégés en cellules uniques après 22 jours supplémentaires. En culture, environ 80 % des cellules sont des OPC.

Ensuite, les OPC dérivés de MESC sont transduits avec des virus bao porteurs de la sous-unité NAV 1.2 afin de générer des OPC de dopage Des résultats sont obtenus qui montrent l’expression du marqueur OPC et les propriétés de dopage de ces OBC dérivés de MESC sur la base de la microscopie d’immunofluorescence et d’enregistrements électrophysiologiques. Bonjour, je suis Pong Chiang du laboratoire du Dr.Ing au Département de biologie cellulaire et d’anatomie humaine de l’Université de Californie à Davis. Nous sommes également affiliés à l’Hôpital Shriners pour enfants de Californie du Nord.

Bonjour, je suis Vial Raj, également du laboratoire Deng. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de différenciation des cellules souches d’emron de souris en cellules précurseurs du génocide. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les propriétés des précurseurs d’oligodendrocytes des cellules souches embryonnaires afin de générer des cellules ayant un meilleur potentiel thérapeutique.

Alors commençons. Aujourd’hui, des cellules précurseurs d’oligodendrocytes ou OPC seront générées à partir de la lignée de cellules souches embryonnaires embryonnaires de souris OG deux GFP. Ces cellules souches embryonnaires doivent être passées tous les trois jours pour les maintenir en bonne santé à une densité optimale et pour éviter la différenciation spontanée. Passage.

Les cellules ESS lorsqu’elles sont à 70 % de confluence sous une hotte à flux laminaire. Retirer le milieu sur la culture. Rincer avec du PBS et de la trypsine pour les yeux avec deux millilitres de préchauffage.

Un x trajet LE express pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Arrêtez la réaction et remettez les cellules en suspension dans quatre millilitres de milieu cellulaire MES. Transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et granulez-les à 1000 RP pendant cinq minutes.

Remettre en suspension dans une plaque de milieu MESL, un dixième des cellules au-dessus d’une couche confluente de mangeurs de méthamphétamine irradiés dans un milieu cellulaire MES. Après trois jours, les cellules ES sont confluentes à environ 70 % et sont prêtes à être passées ou suspendues pour former des corps embryonnaires afin d’induire des corps embryonnaires et de commencer la différenciation des colonies de cellules ES de souris trypsine comme auparavant, puis de remettre les cellules en suspension dans un milieu de remplacement sérique knock-out ou KSR. Comptez les cellules sur un TER hémo, diluez la suspension dans KSR.

Moyenne à 15 000 cellules par millilitre : plaquez trois millilitres dans chaque puits d’une culture sur plaque à six puits à très faible attache. Les cellules ont été suspendues à 37 degrés Celsius pendant quatre jours. Changez complètement de milieu tous les deux jours.

À partir du quatrième jour, remplacez le milieu quotidien le quatrième jour Complétez le KSR avec 0,2 acide rétinoïque micromolaire le cinquième jour avec de l’acide rétinoïque et une famine de primor micromolaire les sixième et septième jours. Nourrissez les corps embryonnaires dans deux milieux, complétés par 0,2 acide rétinoïque micromolaire et une famine de primeur micromolaire. Après huit jours de culture, la majorité des corps embryonnaires expriment la GFP et sont prêts à être désagrégés dans les yeux de trypsine et à compter les cellules comme auparavant.

Ensuite, mettez-les en suspension à 3,5 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre. Dans le milieu OPC, reflater trois millilitres de la suspension dans le milieu OPC. À l’aide de plats de 60 millimètres enrobés de polyornithine environ une fois par semaine, les cellules deviendront confluentes et ressembleront à ce passage pour les cellules comme avant avec une trypsinisation de trois minutes.

30 jours après la suspension initiale de la réanimation. Dans le milieu KSR, les cellules présentent les caractéristiques des cellules précurseurs d’oligodendrocytes pour générer des OPC de pointe. Utilisez des OPC dérivés de l’EEG de souris qui sont entre 50 et 70 % de confluent.

Remplacez le milieu par un XPBS pour rincer les cellules. Pour introduire du sodium voltage-dépendant. Sous-unité alpha du canal 1.2.

Nous utilisons le kit de canaux sodiques MAM arrière. Mélangez un millilitre du composant A de MAM dorsal avec quatre millilitres d’un XPBS. Retirez le rinçage PBS et ajoutez le composant dilué.

Une incubation à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Remplacez l’agent de mémoire arrière par un support OPC amélioré avec les composants B et C, comme décrit dans le kit. Instructions d’incuber pendant deux heures supplémentaires à 37 degrés Celsius.

Après l’incubation, remplacer le milieu amélioré par du milieu OPC frais. Après 24 heures supplémentaires de culture, les OPC dérivés de l’ESL peuvent être analysés pour le dopage à ce moment-là. Les EBS ne montrent pas de fluorescence GFP.

Les EBS montrent une forte expression de GFP et sont prêts pour la culture de désagrégation pendant environ 30 jours après la suspension initiale de resus. Dans le milieu KSR, la majorité des cellules sont immuno-positives pour la coloration NG deux, ce qui est cohérent avec l’expression de la GFP. Cependant, contrairement aux OPC cérébraux, ces OPC dérivés des cellules MES ne parviennent pas à déclencher des potentiels d’action même lorsque les cellules étaient dépolarisées à zéro millivolts.

Après avoir introduit la sous-unité NAV 1.2 par transduction virale, ces OPC dérivés des cellules MES obtiennent des potentiels d’action excités et déclenchent. Nous venons de vous montrer comment différencier les cellules souches embryonnaires de souris en OPC et générer des OPC par transduction virale. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de stocker correctement l’acide rétinoïde par morphine et FGF deux et de toujours utiliser des aliquotes fraîches, de jeter tout acide rétinoïde t supplémentaire après utilisation.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.