La différenciation des cellules souches embryonnaires en précurseurs d'oligodendrocytes

L'objectif général de l'expérience suivante est de générer des précurseurs d'oligodendrocytes à partir de cellules souches embryonnaires au moyen d'une série d'étapes de culture étalées sur 30 jours. Cela est réalisé en premier lieu en formant des corps embryonnaires à partir de cellules ES de souris afin d'initier la différenciation cellulaire. Dans un deuxième temps, les corps embryonnaires sont traités avec les petites molécules, l'acide rétinoïque et la morphine pure, qui induisent la différenciation dirigée des cellules en une lignée déterminée.

Précurseurs cytiques. Dans une troisième étape, les corps embryonnaires sont dissociés en cellules individuelles après 22 jours supplémentaires. En culture, environ 80 % des cellules sont des OPC.

Ensuite, les OPC dérivées de MESC sont transduites avec des virus bao porteurs de la sous-unité NAV 1.2 afin de générer des OPC générant des potentiels d'action. Les résultats obtenus montrent l'expression du marqueur des OPC et les propriétés électrogéniques de ces OPC dérivées de MESC, sur la base de microscopie à immunofluorescence et d'enregistrements électrophysiologiques. Bonjour, je suis Pong Chiang du laboratoire du Dr. Ing, du Département de biologie cellulaire et d'anatomie humaine de l'Université de Californie à Davis. Nous sommes également affiliés à l'Hôpital Shriners pour enfants de Californie du Nord.

Bonjour, je suis Vial Raj, également du laboratoire Deng. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de différencier des cellules souches embryonnaires de souris en cellules progénitrices de gènes. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les propriétés des progéniteurs d'oligodendrocytes dérivés de cellules souches embryonnaires afin de générer des cellules possédant un meilleur potentiel thérapeutique.

Commençons. Aujourd'hui, des cellules progénitrices d'oligodendrocytes, ou OPC, seront générées à partir de la lignée de cellules souches embryonnaires de souris OG deux GFP. Ces cellules souches embryonnaires doivent être repiquées tous les trois jours afin de maintenir leur bon état à une densité optimale et d'éviter toute différenciation spontanée. Repiquage.

Les cellules ESS, lorsqu'elles atteignent une confluence de 70 %, sont placées sous une hotte à flux laminaire. Retirer le milieu recouvrant la culture. Rincer avec du PBS et les yeux de trypsine avec deux millilitres de préchauffage.

Une centrifugation à une fois le volume de LE express pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Arrêter la réaction et resuspendre les cellules dans quatre millilitres de milieu cellulaire MES. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et former un culot par centrifugation à 1000 tr/min pendant cinq minutes.

Ressuspendre dans un milieu plaqué MESL, un dixième des cellules sur une couche confluente de cellules nourricières irradiées au méthanol dans un milieu pour cellules MES. Après trois jours, les cellules ES sont environ à 70 % confluentes et sont prêtes à être repiquées ou ressuspendues pour former des corps embryonnaires afin d'induire la formation de corps embryonnaires et amorcer la différenciation. Traiter les colonies de cellules ES murines au trypsine comme précédemment, puis ressuspendre les cellules dans un milieu contenant un substitut de sérum knockout ou milieu KSR. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, diluer la suspension dans le milieu KSR.

Plaquer 3 millilitres de milieu contenant de 15 000 cellules par millilitre dans chaque puits d'une plaque de culture à six puits à attachement ultrabas. Incuber les cellules en suspension à 37 degrés Celsius pendant quatre jours. Renouveler complètement le milieu tous les deux jours.

À partir du quatrième jour, remplacer le milieu quotidiennement à partir du quatrième jour. Supplémenter le KSR avec 0,2 micromolaire d'acide rétinoïque le cinquième jour, puis supplémenter avec l'acide rétinoïque et un micromolaire de primor famine les sixième et septième jours. Alimenter les corps embryonnaires avec deux milieux supplémentés de 0,2 micromolaire d'acide rétinoïque et d'un micromolaire de primor famine. Après huit jours en culture, la majorité des corps embryonnaires expriment la GFP et sont prêts à être dissociés à la trypsine, puis les cellules sont comptées comme précédemment.

Ensuite, resuspendre les cellules à une concentration de 3,5 × 10⁵ cellules par millilitre. Dans le milieu OPC, redistribuer trois millilitres de la suspension en milieu OPC. À l’aide de boîtes de 60 millimètres revêtues de polyornithine, environ toutes les semaines, les cellules deviendront confluentes et auront cet aspect. Passager les cellules comme précédemment avec une trypsination de trois minutes.

30 jours après la suspension initiale de ressuscitation. Dans le milieu KSR, les cellules présentent des caractéristiques de précurseurs d'oligodendrocytes capables de générer des OPC excitable. Utiliser des OPC dérivés de cellules souches embryonnaires de souris qui présentent une confluence comprise entre 50 et 70 %.

Remplacer le milieu par du XPBS pour rincer les cellules. Pour introduire le canal sodique voltage-dépendant, sous-unité alpha 1.2.

Nous utilisons le kit de canal sodique back MAM. Mélangez un millilitre du composant A du back MAM avec quatre millilitres de un XPBS. Éliminez le rinçage au PBS et ajoutez le composant dilué.

A incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Remplacer l'agent de mémoire arrière par le milieu OPC enrichi avec les composants B et C, comme décrit dans le kit. Incuber pendant deux heures supplémentaires à 37 degrés Celsius.

Après l'incubation, remplacer le milieu enrichi par du milieu OPC frais. Après une autre période de 24 heures de culture, les OPC dérivés des ESL peuvent être analysés pour leur activité de décharge à ce moment-là. Les EBS ne présentent aucune fluorescence GFP.

Les EBS présentent une forte expression de la GFP et sont prêts pour la culture par dissociation environ 30 jours après la suspension initiale de ressus. Dans le milieu KSR, la majorité des cellules sont immunopositives au marquage NG2, ce qui est conforme à l'expression de la GFP. Cependant, contrairement aux OPC cérébraux, ces OPC dérivés de cellules MES ne génèrent pas de potentiels d'action, même lorsque les cellules sont dépolarisées à zéro millivolt.

Après l'insertion de la sous-unité NAV 1.2 par transduction virale, ces OPC dérivés de cellules MES deviennent excitables et génèrent des potentiels d'action. Nous venons de vous montrer comment différencier des cellules souches embryonnaires de souris en OPC et produire des OPC générant des potentiels d'action par transduction virale. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien conserver l'acide rétinoïque, la morphine et le FGF deux correctement, d'utiliser toujours des aliquots fraîches et de jeter tout excès d'acide rétinoïque après usage.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.