Name: Établir intracrânienne xénogreffes tumorales du cerveau avec analyse ultérieure de la croissance tumorale et la réponse à la thérapie à laide dimagerie par bioluminescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-13T17:55:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Apprenez à établir des xénogreffes tumorales cérébrales intracrâniennes chez la souris athymique. Cette méthode permet de surveiller la croissance tumorale et la réponse thérapeutique par imagerie de bioluminescence.

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1. Préparation des cellules tumorales. Cellules pour xénogreffes de tumeurs humaines du cerveau peuvent être générés à partir de tumeurs propagées comme des excroissances sous-cutanée chez des souris athymiques, ou à partir de culture cellulaire. L'utilisation des deux sources de cellules est discutée ci-dessous, avec la démonstration d'une méthode d'implantation des cellules. Pour préparer les cellules de tumeurs sous-cutanées pour le transfert vers le compartiment intracrânienne, tumeurs flanc excisées sont placés dans des boîtes de culture, où le tissu est d'abord haché avec un scalpel puis mécaniquement perturbées par pipetage répétitifs pour créer une suspension totale des cellules 1. La suspension totale de cellules est ensuite passée à travers une maille de nylon filtre 70 uM pour produire une suspension cellulaire unique approprié pour l'injection intracrânienne. La suspension cellulaire est centrifugée à 1000 rpm pendant 10 minutes à 4 ° C, et le surnageant aspiré avant la remise en suspension du culot cellulaire dans un volume approprié de milieu sans sérum pour obtenir une concentration de travail finale (voir ci-dessous). Pour la préparation de lignées cellulaires établies pour l'implantation intracrânienne, les cellules sont récoltées par trypsinisation monocouches, ou par une collecte des cultures en suspension Neurosphère, puis centrifugation et remise en suspension des cellules, comme indiqué ci-dessus 2. Le nombre de cellules injectées est la variable dépendante sur l'emplacement de l'injection neuroanatomiques. Pour les injections nous avons l'habitude d'injecter supratentorielle 3-5 x 10 5 cellules dans 3 ul de milieu sans sérum (DMEM), tandis que pour les injections de 3 tronc cérébral, aussi peu que 5 x 10 4 cellules sont injectées dans 0,5 ul. L'injection de volumes plus importants que ceux recommandés peut entraîner le reflux des cellules tumorales dans le tractus aiguille, avec exophytiques résultante (figure 1), plutôt que la croissance des tumeurs intracrâniennes. Après le retrait de l'échantillon pour l'injection intracrânienne, la suspension de cellules restantes devraient être placés dans la glace, avec des contenus mixtes fréquemment pour maintenir la concentration appropriée tout en complétant l'établissement tumeur intracrânienne parmi les membres d'une série d'injection. 2. L'implantation des cellules tumorales Remarque, toutes les procédures décrites ci-dessous ont été examinés et approuvés par l'utilisation des animaux et du Comité institutionnel de soins à l'Université de Californie à San Francisco. <ol><li> La zone chirurgicale doit être préparé par pulvérisation toutes les surfaces avec un désinfectant, comme solution de chlorhexidine à 2%. Après l'utilisation du désinfectant, du matériel suivant doit être placé dans la zone chirurgicale: <ul><li> Coussin chauffant pour maintenir la température du corps de la souris </li><li> Deux petites boîtes de Pétri, l'un contenant du peroxyde d'hydrogène à 3%, et un contenant de la chlorhexidine à 2% </li><li> Tampons de gaze stérile et le coton </li><li> Stérile scalpels jetables </li><li> Autoclavés agrafeuse chirurgicale </li></ul></li><li> Pour l'anesthésie une anesthésie injectée doit être utilisée; typiquement un mélange kétamine-xylazine. </li><li> Une fois que la souris est anesthésiée, le cuir chevelu est préparé par écouvillonnage à plusieurs reprises avec un morceau de gaze stérile trempée dans la solution de chlorhexidine. Pommade ophtalmique doit être appliqué pour maintenir une humidité adéquate pendant la procédure. Avec un scalpel stérile, remplir une incision sagittale sur l'os pariéto-occipitale, environ 1 cm de long. La surface du crâne exposée est ensuite nettoyé avec un coton-tige trempé dans une solution de peroxyde d'hydrogène à 3%. Le bregma devrait être évident à ce stade (voir vidéo). </li><li> Les coordonnées pour l'injection de cellules tumorales varient selon l'endroit désiré pour l'établissement des tumeurs. Ce qui suit représente la procédure que nous utilisons pour l'établissement des tumeurs intracérébrales 2 dans un endroit neuroanatomiques au cours de laquelle de nombreux patients atteints de tumeurs cérébrales expérience dans le développement tumoral. Autres lieux d'intérêt dans la recherche comprennent la tumeur au cerveau Pons, pour la modélisation anatomique du tronc cérébral des tumeurs 3, et les injections sous-dural pour la modélisation de la localisation des tumeurs méningées 4. Avant l'injection de cellules tumorales, utiliser une aiguille de calibre 25 stériles pointu pour perforer le crâne à 2 mm à la droite du bregma et 1 mm en avant de la suture coronale, créant ainsi une ouverture pour l'injection de cellules tumorales (voir vidéo). Cette procédure fonctionne bien pour les souris et les rats (22 aiguille de la jauge pour les rats). </li><li> Avant de dessiner des cellules dans la seringue, mélanger le contenu de la suspension cellulaire en tapotant avec le doigt. Charger la seringue avec la quantité désirée de cellules en suspension, en prenant soin d'éviter de créer des bulles d'air. L'extérieur de la seringue doit ensuite être nettoyé avec une compresse imbibée d'alcool pour nettoyer l'extérieur sans aucun cellules adhérentes, ce qui aidera à prévenir les tumeurs extracrâniennes création et la croissance (figure 1A). Afin de s'assurer que la profondeur d'injection approprié est atteint, utiliser un scalpel pour couper 3mm de l'extrémité pointue d'une pointe de P20 pipetteman. Cette section de la pointe peut être monté sur la seringue et agira pour limiter la profondeur d'injection, et sera en outre s'assurer que les tip de l'aiguille de la seringue est de 3 mm de la face inférieure du crâne. Placez la seringue perpendiculairement au crâne et dans le trou créé précédemment, et injecter lentement la suspension de cellules (une suspension 3μL doit être injecté sur une période de 1 minute). Un angle d'insertion inappropriée seringue peut conduire à une injection intraventriculaire de cellules et de la diffusion ultérieure vertébrale (Fig. 1B: Droit) Après avoir terminé l'injection, laissez l'aiguille en place pendant une minute, puis retirer lentement (voir vidéo): ces mesures contribueront à réduire le reflux des cellules tumorales. </li><li> Comme une alternative à l'approche sans assistance ou main libre pour l'implantation des cellules tumorales intracrâniennes 5, on peut utiliser un cadre stéréotaxique pour petits animaux (F panel d'aperçu schématique), qui favorise généralement l'emplacement d'injection plus cohérent, mais au détriment de quantités importantes de le temps de procédure. Dans notre expérience, deux membres du personnel chirurgical peut injecter jusqu'à 60 souris / heure lors de l'utilisation de l'approche main-libre, alors que le taux d'injection maximal avec un cadre stéréotaxique petit animal est d'environ 15 souris / heure. L'opportunisme de procédure est une considération importante lors de l'injection de grandes séries de souris, et aide à réduire le délai dans lequel les cellules tumorales, à injecter, sont laissés sur la glace. </li><li> Nettoyer le crâne avec du peroxyde d'hydrogène à 3% et sec à l'aide d'un écouvillon de coton stérile sec. Appliquez la cire d'os stérile pour le trou. En utilisant une pince, tirer sur le cuir chevelu ainsi que sur le crâne et l'agrafer à fermer. Pour une cicatrisation optimale, le cuir chevelu doit être agrafé avec le derme de chaque côté du crâne les uns contre les autres (face contre face). Le cuir chevelu agrafés doivent être nettoyés en utilisant une solution de chlorhexidine, et la buprénorphine alors administrée par injection sous-cutanée pour soulager la douleur post-opératoire. </li><li> Surveiller toutes les souris post-opératoire jusqu'à ce qu'ils deviennent ambulants et de conserver une activité normale. Typiquement, le temps de récupération est d'environ 30 minutes. </li></ol> 3. Surveillance bioluminescence de la croissance tumorale <ol><li> Contexte. L'imagerie par bioluminescence (BLI) est basé sur l'oxydation de la luciférine [D-(-) -2 - (60-hydroxy-20-benzothiazolyle)-thiazone-4-carboxylique] en présence d'oxygène et de l'adénosine triphosphate (ATP). Cette réaction est catalysée par l'enzyme luciférase, qui convertit l'énergie chimique en photons avec une émission résultante de la lumière. Les cellules humaines peuvent être modifiées pour exprimer la luciférase (voir ci-dessous), avec seulement luciférase exprimant des cellules capables d'émettre de la lumière, en présence du substrat luciférine. Il ya de luminescence de fond minimal à partir d'animaux traités avec des hôtes luciférine, tel qu'il ya une très favorable signal-bruit pour détecter les émissions de luminescence de luciférase modifiée cellules tumorales, permettant un suivi très sensible de la croissance tumorale et la réponse au traitement in vivo. Par ailleurs, la luciférase et de son substrat, la luciférine, se sont avérés être non toxique pour les cellules de mammifères, et nous n'avons pas observé de différences fonctionnelles entre les cellules exprimant la luciférase relatives aux cellules non modifiées correspondantes. Luciférine traverse facilement les membranes cellulaires et la barrière hémato-encéphalique après administration intrapéritonéale (ip) ou intraveineuse (iv) l'injection chez la souris, permettant ainsi à l'imagerie de chaque compartiment qui contient la luciférase cellules modifiées. Le niveau d'émission de photons et le spectre de la lumière émise par la luciférase modifiée cellules est suffisante pour pénétrer les tissus des animaux de recherche de petites, comme les souris et les rats, et peut être détecté à l'extérieur avec des caméras d'imagerie de faible luminosité. Le caractère non invasif de l'imagerie par bioluminescence permet la surveillance répétée de la croissance tumorale et la réponse au traitement chez des sujets animaux individuels. </li><li> Sources de cellules implantées doivent être modifiés de façon stable pour Firefly expression de la luciférase. Ces sources de cellules peuvent être achetés ou produits dans des laboratoires différents utilisant des lentivirus qui ont été construites pour l'expression constitutive de la luciférase. Nous recommandons fortement l'utilisation de cellules modifiées avec des lentivirus encodage luciférase, plutôt que de plasmide, pour assurer la stabilité de l'expression cellulaire de la luciférase in vivo, ce qui est nécessaire pour l'imagerie de luminescence quantitatifs pour fournir une indication précise des changements dans la charge tumorale chez les sujets animaux individuels qui sont reprises imagés au cours d'une expérience. </li><li> Surveillance de BLI. Nous recommandons la réalisation d'imagerie par bioluminescence quantitatives (qBLI) 1x-2x par semaine, en commençant une semaine après l'injection de cellules tumorales. Notre qBLI est réalisé en utilisant l'imagerie IVIS Lumina gare (Caliper Life Sciences), et nos résultats indiquent des données similaires sont obtenus en utilisant la Lumina IVIS, l'IVIS 150, ou la station d'imagerie IVIS 200. En préparation pour l'imagerie, les souris sont simultanément anesthésiés avec kétamine / xylazine et administré luciférine (sel de potassium D-luciférine, 150 mg / kg, Caliper Life Sciences) par injection intrapéritonéale, aux souris imagé 12 minutes après l'injection. La pharmacocinétique de la luciférine indiquent que le temps entre les admitration de la luciférine et la détermination de la luminescence cellule devrait être entre 10-15 minutes après l'injection de luciférine, en vue d'obtenir émission de luminescence maximale et la plus grande sensibilité de détection. La longueur du temps choisi dans l'intervalle de 10-15 minutes de temps doit être maintenue aussi constante parmi les animaux qui sont imagés. Il est extrêmement important de maintenir la cohérence de la durée de temps entre l'injection de luciférine et obtenir des lectures de BLI. Régions d'intérêt englobant la région intracrânienne du signal sont définies en utilisant le logiciel image vivante (figure 2), et le photons/s/sr/cm2 total (photons par seconde et par stéradian par centimètre carré) sont enregistrées (voir vidéo). </li><li> L'analyse des données. Alors que la croissance tumorale et la réponse thérapeutique sont surveillés chez des animaux individuels, nous recommandons fortement les groupes de traitement d'au moins 8 pour augmenter la certitude statistique de conclusions concernant la réponse tumorale, ou son absence, à la thérapie. En ce qui concerne la présentation des résultats qBLI, des lectures de luminescence sont converties en valeurs normalisées en divisant la luminescence chaque souris s, obtenue pendant et après la réalisation de schéma thérapeutique, avec sa luminescence prétraitement correspondant maximale de lecture 6,7. Pour une analyse de survie, l'estimateur de Kaplan-Meier 8 est utilisé, et dont les courbes de survie sont générées, et les valeurs de survie médiane déterminée. Différences entre les courbes de survie sont comparées en utilisant un test du log-rank 9. </li><li> Récupération du cerveau pour une analyse ultérieure de la tumeur traitée et non traitée. Sur l'euthanasie des animaux, le cerveau de la souris doit être rapidement excisée (voir vidéo), et soit placé dans le formol pour analyse ultérieure de la morphologie de la tumeur et l'immunohistochimie, ou devrait être monté dans un PTOM, pour la congélation des échantillons. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Dans l'exemple illustré à la figure 3A, les souris recevant intracrânienne injection de cellules tumorales ont été suivis pour la luminescence intracrânienne jusqu'en valeurs successives de luminescence moyenne indiquée croissance tumorale progressive, et à laquelle une thérapie de temps a été lancé (début flèche grise au jour 34: l'erlotinib administré quotidiennement à 150 mg / kg jusqu'à l'euthanasie obligatoire). Les valeurs de luminescence pour chaque souris est fixé à une valeur normalisée de 1 au moment de l'instauration du traitement, avec des lectures ultérieures de luminescence pour chaque souris normalisée à sa valeur pré-traitement d'imagerie finale. À titre d'exemple, une souris avec une lecture de luminescence de pré-traitement final de 2,0 x 10 7 photons / sec à 34 jours, dont la luminescence était passé à 6,0 x 10 7 photons / sec à 38 jours, aurait un jour 38 la valeur de luminescence normalisées de 3,0. Moyenne normalisée de bioluminescence et correspondant d'erreur standard pour le contrôle et les groupes de traitement sont tracées pour chaque point de l'imagerie en temps. Dans cet exemple, une différence significative dans la luminescence moyenne normalisée est évident au point de l'imagerie en temps une première récidive à l'initiation du traitement (jour 38), à la différence de la luminescence moyenne du groupe montrant augmenter encore à des temps ultérieurs. Dans la plupart des cas, activité anti-tumorale de la thérapie, comme indiqué par qBLI, est accompagné par une différence significative de survie correspondantes (ie, p &lt;0,05), comme c'est le cas ici (figure 3B). Panneaux 3C et 3D montrent adjacentes hématoxyline &amp; éosine et anti-EGFR coupes colorées de cerveau de souris obtenues au moment de l'euthanasie, après le placement du cerveau réséqué dans de la paraffine-enrobage formol et ultérieures pour la coupe. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Indications d'erreurs d'injection intracrânienne. Une croissance) exophytique tumeur (extracrâniennes) (cercle rouge) peut être causée par un trop grand volume d'injection, suspension cellulaire résiduelle fixée à la seringue, ou de retirer la seringue trop rapidement après l'injection des cellules tumorales. B) injecter des cellules tumorales dans les ventricules peuvent causer la diffusion d'une tumeur vertébrale (souris vers la droite), contrairement à bien injecté des cellules tumorales, le signal pour qui reste localisée au site d'injection (souris vers la gauche). <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Représentations chaleur carte-image de l'intensité de bioluminescence pour les souris représentant de contrôle (à gauche) et traitement (droite) des groupes d'une expérience de la réponse thérapeutique. Le logiciel Image habitable peut être réglé afin de définir des régions d'intérêt (cercles rouges), ou les opérateurs instrument peut définir des régions d'intérêt manuellement. Pour utiliser des images comme celles-ci pour la construction de la figure, nous recommandons que l'opérateur de l'instrument montre des images carte de la chaleur en utilisant la gamme de bioluminescence même carte de chaleur (partie supérieure de la figure), pour fournir une représentation visuelle de l'étendue de la différence entre les sujets de bioluminescence des animaux. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Bioluminescence, la survie et l'analyse des tissus tumoraux à partir d'une expérience dans laquelle la réponse thérapeutique est évidente. A Plot) des lectures bioluminescence signifie pour le contrôle et la souris du groupe de traitement, avec une erreur standard indiqué pour chaque point de l'imagerie. B) parcelle de survie pour les mêmes souris, p-valeur déterminée par l'utilisation du log-rank test 7. C) l'article H &amp; E tachés de cerveau de souris ayant une tumeur. D) L'EGFR section tachés. E et F) des grossissements de zones indiquées par des panneaux C et D, respectivement, avec E panneau montrant une coloration négative protéine suppresseur de tumeur PTEN.

<ol><li>Giannini, C., Sarkaria, J. N., Saito, A., Uhm, J. H., Galanis, E., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+Tumor+EGFR+and+PDGFRA+Gene+Amplifications+Retained+in+an+Invasive+Intracranial+Xenograft+Model+of+GBM%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient Tumor EGFR and PDGFRA Gene Amplifications Retained in an Invasive Intracranial Xenograft Model of GBM.</a> Neuro-Oncol. 7, 164-176 (2005).</li>
<li>Ozawa, T., Wang, J., Hu, L. J., Bollen, A. W., Lamborn, K. R., Deen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+human+glioblastomas+as+xenografts+in+the+brains+of+athymic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Growth of human glioblastomas as xenografts in the brains of athymic rats.</a> In Vivo. 1, 55-60 (2002).</li>
<li>Hashizume, R., Ozawa, T., Dinca, E. B., Banerjee, A., Prados, M. D., James, C. D., Gupta, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+brainstem+glioma+xenograft+model+enabled+for+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">A human brainstem glioma xenograft model enabled for bioluminescence imaging.</a> J Neurooncol. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Baia, G. S., Dinca, E. B., Ozawa, T., Kimura, E. T., McDermott, M. W., James, C. D., VandenBerg, S. R., Lal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+skull+base+model+of+malignant+meningioma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">An orthotopic skull base model of malignant meningioma.</a> Brain Pathol. 2, 172-179 (2007).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. Human Brain Tumor Cell and Tumor Tissue Transplantation Models. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOzawa%2C+T+%22CNS+Cancer%3A+Models%2C+Markers%2C+Prognostic+Factors%2C+Targets%2C+and+Therapeutic+Approaches%22">CNS Cancer: Models, Markers, Prognostic Factors, Targets, and Therapeutic Approaches</a>. Van Meir, E. , Humana Press-Springer. New York, NY. 147-162 (2009).</li>
<li>Sarkaria, J. N., Yang, L., Grogan, P. T., Kitange, G. J., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., Galanis, E., Giannini, C., Wu, W., Dinca, E. B., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Molecular+Characteristics+Correlated+with+Glioblastoma+Sensitivity+to+EGFR+Kinase+Inhibition+Through+Use+of+an+Intracranial+Xenograft+Test+Panel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of Molecular Characteristics Correlated with Glioblastoma Sensitivity to EGFR Kinase Inhibition Through Use of an Intracranial Xenograft Test Panel.</a> Mol. Cancer Ther. 6, 1167-1174 (2007).</li>
<li>Dinca, E. B., Sarkaria, J. N., Schroeder, M. A., Carlson, B. L., Voicu, R., Gupta, N., Berger, M. S., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Monitoring+of+Intracranial+Glioblastoma+Xenograft+Response+to+Primary+and+Salvage+Temozolomide+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy.</a> J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-parametric+estimation+from+incomplete+observations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Stat.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Non-parametric estimation from incomplete observations.</a> J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).</li>
<li>Peto, R., Peto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptotically+efficient+rank+invariant+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Stat.+Soc.+Ser.+A.+Stat.+Soc%22%5BJournal%5D)">Asymptotically efficient rank invariant procedures.</a> J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185-207 (1972).</li>
<li>Camphausen, K., Purow, B., Sproull, M., Scott, T., Ozawa, T., Deen, D. F., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+in+vivo+growth+on+human+glioma+cell+line+gene+expression%3A+convergent+profiles+under+orthotopic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A.%22%5BJournal%5D)">Influence of in vivo growth on human glioma cell line gene expression: convergent profiles under orthotopic conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8287-8292 (2005).</li>
</ol>

Orthotopique (intracrâniens) l&#39;établissement de xénogreffes de tumeurs cérébrales offre un microenvironnement approprié 10 pour la modélisation du cancer du SNC pour être testés pour la réponse thérapeutique. Ce type de modélisation fournit également des informations concernant l&#39;accès thérapeutiques au cerveau et tumeur au cerveau, ce qui est extrêmement important de déterminer si un agent expérimental devrait être avancée à l&#39;évaluation des essais cliniques chez les patients. Parce que la quantité de tumeur intracrânienne xénogreffe ne peut pas être mesurée directement, comme par des étriers, un suivi longitudinal de la croissance tumorale intracrânienne et la réponse au traitement nécessite l&#39;imagerie non invasive, l&#39;imagerie par bioluminescence avec nos expériences indiquant que l&#39;approche la plus pratique pour des expériences dont l&#39;objectif principal consiste à évaluer l&#39;étendue de la réponse tumorale au traitement. Lorsque les résultats de l&#39;imagerie par bioluminescence sont combinés avec une analyse de survie animal en question, les deux ensembles de données fournissent une approche puissante et fiable pour évaluer l&#39;efficacité thérapeutique expérimentale. Enfin, il est extrêmement important que intracrânienne xénogreffes tumorales du cerveau sont récoltées à partir de sujets animaux euthanasiés afin d&#39;évaluer les effets morphologiques et moléculaires de la thérapie, et pour ce que nous préférons une résection ensemble du cerveau au moment de l&#39;euthanasie, avec la préservation du cerveau réséqué pour une analyse ultérieure. Considérant que la présentation qui précède a été faite spécifiques à la recherche de tumeurs cérébrales, les concepts ne sont certainement généralisables à d&#39;autres cancers humains qui se prêtent à la modélisation orthotopique chez les rongeurs.

<table><tbody><tr><td>Lames jetables</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td>2975</td><td>No.21</td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td></td></tr><tr><td>Compresse de gaze</td><td>Fisher Scientific</td><td>22028563</td><td></td></tr><tr><td>Bâtonnets de coton</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidine à 2 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9756995</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d'hydrogène à 3 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>H312P-4</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de 25 g</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Seringue microfocale aiguë de 10 µl, Hamilton</td><td>Hamilton Co</td><td>20734</td><td></td></tr><tr><td>Appareil à agrafes chirurgicales et agrafes</td><td>Stoelting Co.</td><td>59020</td><td></td></tr><tr><td>Châssis stéréotaxique</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Living Image</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Living%20Image%20Software" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-luciférine</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1G</td><td>Sel de potassium</td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Établir intracrânienne xénogreffes tumorales du cerveau avec analyse ultérieure de la croissance tumorale et la réponse à la thérapie à l&#39;aide d&#39;imagerie par bioluminescence

Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Transplantation des modèles utilisant des cellules tumorales humaines du cerveau ont servi une fonction essentielle dans la neuro-oncologie de recherche depuis de nombreuses années. Dans le passé, la procédure la plus couramment utilisée pour l&#39;établissement de xénogreffes de tumeurs humaines se composait de la collection de cellules provenant de flacons de culture, suivie par l&#39;injection sous-cutanée des cellules recueillies dans des souris immunodéprimées. Considérant que cette approche voit encore un usage fréquent dans de nombreux laboratoires, il ya eu un changement important dans l&#39;accent au cours de la dernière décennie vers l&#39;établissement de xénogreffes orthotopique, ce qui, dans le cas de tumeurs cérébrales, nécessite l&#39;injection de cellules tumorales dans des structures appropriées neuroanatomiques. Parce que l&#39;établissement de xénogreffes intracrânienne élimine la possibilité de surveiller la croissance tumorale par mesure directe, comme par l&#39;utilisation d&#39;étriers, la réorientation vers des modèles de xénogreffes de tumeurs cérébrales orthotopique a nécessité l&#39;utilisation de l&#39;imagerie non invasive pour évaluer la charge tumorale chez les animaux hôtes. Parmi les méthodes d&#39;imagerie actuellement disponibles, la surveillance est généralement considéré comme la bioluminescence pour offrir la meilleure combinaison de sensibilité, de l&#39;opportunisme, et le coût. Ici, nous allons démontrer les procédures de création de tumeur cérébrale orthotopique, et pour le suivi la croissance tumorale et la réponse au traitement lors du test de thérapies expérimentales.

Luciférase modifiée xénogreffes de tumeurs humaines du cerveau peut être établie par voie intracrânienne chez des souris athymiques, avec un suivi ultérieur de la croissance tumorale et la réponse au traitement en utilisant l&#39;imagerie par bioluminescence. En combinaison avec une analyse de survie, de surveillance bioluminescence est un outil de recherche indispensable pour les essais pré-cliniques de thérapies envisagées pour le traitement des tumeurs cérébrales.

Les modèles de transplantation utilisant des cellules de tumeurs cérébrales humaines ont joué un rôle essentiel dans la recherche en neuro-oncologie pendant de nombreuses années. Par le passé, les plus...

Pendant de nombreuses années, les modèles de transplantation utilisant des cellules de tumeur cérébrale humaine ont principalement impliqué une injection sous-cutanée chez des souris immunodéprimées. Récemment, on observe un passage vers l'injection dans la structure anatomique appropriée : le cerveau.Dans cet article vidéo, des tumeurs intracrâniennes sont induites chez des souris à l'aide d'une méthode d'injection au cours de laquelle un trou est pratiqué dans le crâne, et une aiguille est utilisée pour injecter des cellules tumorales modifiées afin d'être détectées par imagerie bioluminescente. Après la chirurgie, la croissance tumorale et la réponse au traitement sont surveillées. À l'aide d'une station d'imagerie bioluminescente, d'une analyse de survie ainsi que d'analyses histopathologiques et d'expression protéique, les données obtenues peuvent ensuite être utilisées pour évaluer l'efficacité de thérapies expérimentales contre les tumeurs cérébrales.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuro-oncologie, comme de savoir si l'agent anti-tumoral peut accéder au cerveau. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie des tumeurs cérébrales chez les patients, car nous traitons des tumeurs cérébrales humaines développées dans un hôte animal. Travailler sous une hotte de culture tissulaire. Préparer les cellules tumorales sous-cutanées en vue de leur transfert dans le compartiment intracrânien.Commencez par placer les tumeurs prélevées au niveau de la hanche dans des boîtes de culture tissulaire. À l’aide d’un scalpel, hachez finement le tissu. Ensuite, à l’aide d’une pipette, dispersez mécaniquement le tissu afin d’obtenir une suspension d’agrégats cellulaires.Ensuite, faites passer la suspension d'agrégats cellulaires à travers un tamis muni d'un filtre en nylon de 70 micromètres et recueillez-la dans un tube à fond rond. Répétez ce processus un total de trois fois afin d'obtenir une suspension monocellulaire adaptée à une injection intracrânienne. Centrifugez la suspension à 1000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, aspirez le surnageant, puis resuspendez les culots cellulaires dans un volume approprié de milieu sans sérum pour obtenir une concentration finale de travail, en alternative à la dissociation de tumeurs sous-cutanées.Les cellules tumorales peuvent être récoltées à partir de cultures cellulaires contenant des lignées établies de tumeurs cérébrales. Récoltez les cellules par trypsine lors d'une centrifugation.Après la centrifugation Resus, resuspendre les cellules dans le volume approprié de DMEM sans sérum pour des injections sus-tentorielles à la main. Préparer trois à cinq fois 10 à la puissance 5 cellules dans trois microlitres. Désinfecter la zone chirurgicale en vaporisant toutes les surfaces avec de la chlorhexidine à 2 %.Placez ensuite les fournitures suivantes dans la zone chirurgicale : une plaque chauffante pour maintenir la température corporelle de la souris, deux petites boîtes de Pétri, l'une contenant du peroxyde d'hydrogène à 3 % et l'autre de la chlorhexidine à 2 %, des champs stériles, des cotons-tiges, des lames de scalpel jetables stériles et un agrafeuse chirurgicale stérilisée au autoclave.Une fois que la souris a été anesthésiée avec un mélange de kétamine et de xylazine, désinfectez la zone chirurgicale plusieurs fois à l’aide de compresses stériles imbibées de chlorhexidine. Appliquez un produit pour maintenir une hydratation adéquate pendant l’intervention. À l’aide d’un scalpel stérile, pratiquez une incision sagittale au-dessus de l’os pariétal occipital, d’environ un centimètre de longueur.À l’aide d’un coton-tige imbibé d’une solution de peroxyde d’hydrogène à 3 %, nettoyer la surface du crâne exposée. À ce stade, le bgma devrait être visible afin de créer une ouverture pour l’injection des cellules tumorales. Utiliser une aiguille stérile aiguë de calibre 25 pour percer le crâne.Deux millimètres à droite de bgma et un millimètre en avant de la suture coronale. Mélanger le contenu de la suspension cellulaire en tapotant. Charger la seringue avec la quantité souhaitée de suspension cellulaire.Évitez de créer des bulles d'air. Nettoyez l'extérieur de la seringue avec un tampon imbibé d'alcool afin d'éliminer toute cellule adhérente. Cela aidera à prévenir l'établissement et la croissance de tumeurs extra-crâniennes, comme illustré ici, pour garantir que la profondeur d'injection appropriée est atteinte.Lorsqu'un appareil stéréotaxique pour petits animaux n'est pas utilisé, couper trois millimètres de l'extrémité effilée d'une pipette P20 à l'aide d'un scalpel. Placer la section coupée sur la seringue afin de limiter la profondeur d'injection, de sorte que l'extrémité de l'aiguille de la seringue se trouve à trois millimètres de la face inférieure du crâne. Ainsi, l'étape suivante de la procédure est probablement l'aspect le plus difficile de l'ensemble de la méthode lors de l'injection suivante : obtenir une mortalité appropriée, et la livraison est d'une importance capitale afin de garantir que la tumeur s'établisse et se développe au bon emplacement dans le cerveau.Placez ensuite une seringue perpendiculairement au crâne dans le trou et injectez lentement la suspension cellulaire. L'injection de volumes plus grands que recommandé peut entraîner un reflux des cellules tumorales par le trajet de l'aiguille, conduisant à une croissance tumorale ectopique plutôt qu'intracrânienne. Comme illustré ici, un angle d'insertion inapproprié de la seringue peut entraîner une injection intraventriculaire des cellules et une dissémination spinale ultérieure, comme montré ici à l'issue de l'injection.Laissez l'aiguille en place pendant une minute supplémentaire, puis retirez-la lentement. Ces étapes permettront de prévenir le reflux tumoral. Nettoyez le crâne avec du peroxyde d'hydrogène à 3 % et séchez.À l’aide d’un coton-tige stérile. Appliquez de la cire osseuse stérile sur le trou à l’aide de pinces. Rapprochez les lambeaux de cuir chevelu sur le crâne de manière à ce que les dermes des deux côtés soient pressés l’un contre l’autre, face interne contre face interne, puis agrafez.Ensuite, nettoyer le cuir chevelu à l'aide de chlorhexidine. Administrer de la buprénorphine par injection sous-cutanée pour soulager la douleur postopératoire. Bien que cela ne soit pas montré ici, la buprénorphine est rapidement absorbée.Passez à l'injection de souris supplémentaires. Veillez à bien mélanger les cellules entre chaque injection afin de maintenir une concentration appropriée au sein des membres d'une série d'injections. Des groupes de traitement d'au moins huit individus sont recommandés afin de garantir des résultats statistiquement significatifs.Surveiller tous les souris en postopératoire jusqu'à ce qu'elles deviennent ambulatoires et retrouvent une activité normale. Le temps de récupération est généralement d'environ 30 minutes, commençant une semaine après l'injection des cellules tumorales. Une imagerie quantitative de bioluminescence ou QBLI doit être effectuée une ou deux fois par semaine. Ici.La QBLI est réalisée à l'aide de la station de visualisation IVIS Lumina et du logiciel Living Image version 3.2. À partir du menu Démarrer de Windows, sélectionnez le programme du logiciel Living Image. Une fois le programme ouvert, cliquez sur le bouton du système IVIS initialisé dans le panneau de contrôle de la caméra.Après l'initialisation, la boîte indiquant l'état de la température doit être verte, ce qui signifie que la caméra CCD est suffisamment refroidie. Placez la souris anesthésiée injectée avec de la luciférine sur la platine de la chambre d'imagerie. Ouvrez l'un des fichiers enregistrés de votre session d'imagerie et modifiez l'affichage des données d'image de « counts » en « photons ». Pour déterminer le nombre de photons par seconde du signal cible, sélectionnez l'icône de cercle dans le menu déroulant des régions d'intérêt (ROI).Une région d’intérêt marquée ROI doit apparaître autour du signal cible. Le signal doit être saisi dans un fichier Excel dans lequel le numéro de l’animal et le jour de l’imagerie sont indiqués. Répétez cette séquence pour tous les animaux analysés au cours de votre séance d’imagerie.Une fois que les comptages de photons ont été déterminés pour chaque souris ayant fait l'objet d'une imagerie et que les valeurs de photons ont été transférées dans un fichier Excel, convertir les mesures de luminiscence en valeurs normalisées en divisant la luminiscence de chaque souris obtenue pendant et après l'achèvement du traitement par sa luminiscence maximale prétraitement correspondante. Pour effectuer une analyse de survie à l'aide du logiciel Prism, utiliser l'estimateur de KAPLAN-Meier afin de générer des courbes de survie et d'estimer les valeurs médianes de survie.Les différences entre les courbes de survie sont comparées à l'aide d'un test de log-rank. L'euthanasie de l'animal doit être réalisée si celui-ci présente un déclin significatif de son état de santé, en particulier en cas de perte de poids supérieure à 20 % du poids maximal. Prélevez rapidement le cerveau de la souris euthanasiée, puis placez le cerveau dans du formol en vue de l'analyse ultérieure de la morphologie tumorale et de l'immunohistochimie.Cet exemple montre les valeurs moyennes de luminescence normalisée pour des souris ayant reçu une thérapie par injection intracrânienne de cellules tumorales, avec une initiation de l’érilotinib au jour 34. Les barres d’erreur indiquent l’erreur standard. Une différence significative de luminescence normalisée moyenne est apparente au premier point temporel d’imagerie suivant le début du traitement. La différence de luminescence moyenne entre les groupes augmente davantage aux points temporels ultérieurs dans la plupart des cas.L'activité anti-tumorale induite par le traitement, indiquée par QBLI, s'accompagne d'une différence significative correspondante en termes de survie. Comme c'est le cas ici, les colorations HEMMAT et ÉOSINE de coupes de cerveau de souris incluses dans la paraffine montrent le schéma de distribution des cellules tumorales. La protéine P 10 est un marqueur fréquemment associé à la réponse tumorale à l'inhibition du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR). Ici.On observe que les otins de cellules tumorales traitées sont dépourvus d'expression de P 10, comme en témoigne l'absence de coloration brune. Ici, une section du cerveau de souris incluse dans la paraffine est présentée. Les cellules tumorales cérébrales sensibles aux inhibiteurs d'EGFR peuvent être identifiées par la coloration brune d'EGFR.Comme vous l'avez vu, l'aspect le plus délicat de cette procédure est l'injection adéquate des cellules tumorales. Quelle est l'expérience supplémentaire la plus pertinente pouvant être réalisée à l'aide de cette approche, par exemple l'étude des effets sur la croissance induits par des modifications génétiques des cellules tumorales ? Voilà donc tout. J'espère que cette présentation vous a été utile. Bonne chance avec vos expériences.

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