Établir intracrânienne xénogreffes tumorales du cerveau avec analyse ultérieure de la croissance tumorale et la réponse à la thérapie à l'aide d'imagerie par bioluminescence

Pendant de nombreuses années, les modèles de transplantation utilisant des cellules tumorales cérébrales humaines ont principalement impliqué une injection sous-cutanée chez des souris immunodéprimées. Récemment, il y a eu une évolution vers l’injection dans la structure anatomique appropriée. Le cerveau.

Dans cet article vidéo, les tumeurs intracrâniennes sont établies chez la souris à l’aide d’une méthode d’injection dans laquelle un trou est créé dans le crâne et une aiguille est utilisée pour injecter des cellules tumorales modifiées pour l’imagerie par bioluminescence. Après la chirurgie, le taux de croissance tumorale et la réponse au traitement sont surveillés. À l’aide d’une station d’imagerie de bioluminescence, d’une analyse de survie et d’une analyse histopathologique et de l’expression des protéines, les données résultantes peuvent ensuite être utilisées pour évaluer l’efficacité des thérapies expérimentales contre les tumeurs cérébrales.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuro-oncologie, par exemple si l’agent antitumoral peut accéder au cerveau. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des tumeurs cérébrales chez les patients, car nous traitons des tumeurs cérébrales humaines qui sont cultivées chez un hôte animal. Préparez les cellules tumorales sous-cutanées pour le transfert dans le compartiment intracrânien.

Commencez par placer les tumeurs du flanc excisées dans des boîtes de culture tissulaire. À l’aide d’un scalpel, émincez le tissu. Ensuite, à l’aide d’un pipeteur, perturbez mécaniquement le tissu pour créer une suspension d’agrégats cellulaires.

Ensuite, passez la suspension d’agrégats cellulaires à travers une crépine avec un filtre à mailles en nylon de 70 micromètres et collectez-la dans un tube à fond rond. Répétez ce processus trois fois au total pour produire une suspension unicellulaire adaptée à l’injection intracrânienne. Centrifugeuse. La suspension à 1000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius après centrifugation, aspire le supnacent puis remet en suspension les pastilles cellulaires dans un volume approprié de milieu sérique libre pour obtenir une concentration de travail finale comme alternative à la désagrégation des tumeurs sous-cutanées.

Les cellules tumorales peuvent être récoltées à partir de cultures cellulaires contenant une tumeur cérébrale établie. Lignées cellulaires. Récoltez les cellules par trypsine en centrifugation.

Après la centrifugation Resus, suspendre les cellules dans le volume approprié de DMEM libre sérique pour les injections super tentorielles à main levée. Préparez trois à cinq fois 10 à cinq cellules dans trois microlitres. Désinfectez la zone chirurgicale en vaporisant toutes les surfaces avec de la chlorhexidine à 2 %.

Ensuite, placez les fournitures suivantes dans la zone chirurgicale. Un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle de la souris. Deux petites boîtes pétrologiques, l’une contenant 3 % de peroxyde d’hydrogène et l’autre contenant 2 % de chlorhexidine, des GRE stériles et des cotons-tiges, des scalpels stériles jetables et une agrafeuse chirurgicale autoclave.

Une fois que la souris a été anesthésiée avec un mélange de kétamine et de xylazine, échangez plusieurs fois la zone chirurgicale à l’aide de sangles stériles trempées dans de la chlorhexidine. Appliquer pour maintenir une humidité adéquate pendant la procédure. À l’aide d’un scalpel stérile, effectuez une incision sagittale sur l’os paroccipital, d’environ un centimètre de long.

À l’aide d’un coton-tige imbibé d’une solution de peroxyde d’hydrogène à 3 %, nettoyez la surface exposée du crâne. Le bgma doit être apparent à ce stade pour créer une ouverture pour l’injection de cellules tumorales. Utilisez une aiguille pointue stérile de calibre 25 pour percer le crâne.

Deux millimètres à droite de bgma et un millimètre en avant de la suture coronale. Mélangez le contenu de la suspension cellulaire en tapotant. Chargez la seringue avec la quantité souhaitée de suspension cellulaire.

Évitez de créer des bulles d’air. Nettoyez l’extérieur de la seringue avec un tampon imbibé d’alcool pour éliminer les cellules d’adhérence. Cela aidera à prévenir l’établissement et la croissance d’une tumeur crânienne supplémentaire, comme indiqué ici, pour s’assurer que la profondeur d’injection appropriée est atteinte.

Lorsque vous n’utilisez pas un appareil stéréotaxique pour petits animaux, utilisez un scalpel pour couper trois millimètres de l’extrémité pointue d’une pointe de pipette P 20. Placez la section de l’embout sur la seringue pour limiter la profondeur d’injection afin de vous assurer que l’extrémité de l’aiguille de la seringue sera à trois millimètres du dessous du crâne. Ainsi, l’étape suivante de la procédure est probablement l’aspect le plus difficile de toute la méthode lors de l’injection suivante, obtenir la mort appropriée et l’administration est d’une importance capitale afin de garantir que la tumeur est établie et se développe au bon endroit du cerveau.

Ensuite, placez une seringue perpendiculaire au crâne dans le trou et injectez lentement la suspension cellulaire. L’injection de volumes plus importants et recommandés peut entraîner un reflux des cellules tumorales à travers le tractus de l’aiguille, ce qui entraîne une croissance tumorale phytique plutôt qu’intracrânienne. Comme le montre ici, un angle d’insertion inapproprié de la seringue peut entraîner une injection intraventriculaire de cellules et une dissémination vertébrale ultérieure, comme illustré ici à la fin de l’injection.

Laissez l’aiguille en place pendant encore une minute, puis retirez-la lentement. Ces étapes aideront à prévenir le reflux tumoral. Nettoyez le crâne avec du peroxyde d’hydrogène à 3 % et séchez.

À l’aide d’un coton-tige stérile. Appliquez de la cire d’os stérile dans le trou à l’aide d’une pince. Rassemblez le cuir chevelu sur le crâne avec le derme de chaque côté, pressé l’un contre l’autre, dessous contre dessous et agrafez.

Nettoyez ensuite le cuir chevelu à l’aide de chlorhexidine. Administrer la buprénorphine par injection sous-cutanée pour soulager la douleur postopératoire. Bien qu’elle ne soit pas représentée ici, la buprénorphine est rapidement absorbée.

Procédez à l’injection de souris supplémentaires. Assurez-vous de mélanger les cellules entre les injections pour maintenir une concentration appropriée parmi les membres d’une série d’injections. Des groupes de traitement d’au moins huit personnes sont recommandés pour garantir des résultats statistiquement significatifs.

Surveillez toutes les souris après l’opération jusqu’à ce qu’elles deviennent ambulatoires et retrouvent une activité normale. En règle générale, le temps de récupération est d’environ 30 minutes, commençant une semaine après l’injection de cellules tumorales. L’imagerie quantitative par bioluminescence ou QBLI doit être réalisée une à deux fois par semaine. Ici.

Le QBLI est réalisé à l’aide de la station IVIS Lumina Imaging et de la version 3.2 du logiciel d’image vivante. Dans le menu Démarrer de Windows, sélectionnez le logiciel d’image animée. Une fois le programme ouvert, cliquez sur le bouton du système IVIS initialisé dans le panneau de configuration de la caméra.

Après l’initialisation, la boîte d’état de la température doit être verte, indiquant que la caméra CCD est correctement appelée placer la souris injectée luciférienne anesthésiée. Sur la scène de la chambre d’imagerie, ouvrez l’un des fichiers enregistrés de votre session d’imagerie et modifiez l’affichage des données d’image du nombre de photons à l’affichage des photons. Pour déterminer le nombre de photons par seconde du signal cible, sélectionnez l’icône en forme de cercle dans le menu déroulant ROI.

Une région d’intérêt étiquetée ROI doit apparaître autour du signal cible. Le signal doit être saisi dans un fichier Excel dans lequel le numéro de l’animal et le jour de l’imagerie sont indiqués. Répétez cette séquence pour tous les animaux analysés lors de votre séance d’imagerie.

Une fois que le nombre de photons a été déterminé pour chaque souris imagée et que les valeurs des photons ont été transférées dans un fichier Excel. Convertissez les lectures de luminescence pour normaliser les valeurs en divisant la luminescence de chaque souris obtenue pendant et après la fin du régime thérapeutique par sa luminescence maximale correspondante avant le traitement. Pour effectuer une analyse de survie à l’aide d’un logiciel de prisme, utilisez l’estimateur KAPLAN Mere pour générer des graphiques de survie et estimer les valeurs médianes de survie.

Les différences entre les courbes de survie sont comparées à l’aide d’un test de rang logarithmique. L’euthanasie de l’animal doit être pratiquée si l’animal présente un déclin significatif de son état de santé, en particulier s’il y a une perte de poids supérieure à 20 % du poids maximum. Clic rapide, le cerveau de la souris de la souris euthanasiée, puis placez le cerveau dans de la formine pour une analyse ultérieure de la morphologie tumorale et de l’immunohistochimie.

Cet exemple montre les valeurs moyennes de luminescence normalisée chez les souris recevant une injection intracrânienne de cellules tumorales avec de l’erlotinib a été initiée au jour 34. Les barres d’erreur indiquent une erreur-type, Une différence significative dans la luminescence normalisée moyenne est apparente au premier point temporel de l’imagerie après le début du traitement. La différence de luminescence moyenne du groupe montre une nouvelle augmentation aux points temporels suivants dans la plupart des cas.

L’activité antitumorale induite par le traitement telle qu’indiquée par le QBLI s’accompagne d’une différence significative correspondante de survie. Comme c’est le cas ici, les sections de coloration hemmat et EOSIN du cerveau de souris inclus dans la paraffine montrent le modèle de distribution des cellules tumorales. P 10 est un marqueur qui est fréquemment associé à la réponse tumorale à l’inhibition de l’EGFR. Ici.

L’otine des cellules tumorales traitées est dépourvue d’expression de P 10, comme l’indique l’absence de coloration brune. Ici, une section du cerveau de souris inclus dans la paraffine est montrée. Les cellules tumorales cérébrales sensibles aux inhibiteurs de l’EGFR peuvent être identifiées par la coloration brune de l’EGFR.

Comme vous l’avez vu, l’aspect le plus difficile de cette procédure est l’injection correcte des cellules tumorales. Quelle est l’expérience la plus poussée qui puisse être réalisée en utilisant cette approche, comme l’étude des effets de croissance des modifications génétiques sur les cellules tumorales ? Donc c’est tout.

J’espère que vous avez trouvé cet exposé utile. Bonne chance dans vos expériences.