In vivo d'embryons de drosophile Centrifugation

La séparation des principaux organites à l’intérieur des œufs de mouches des fruits par densité commence par la récolte des embryons, qui ont moins de trois heures. Les coquilles d’œufs sont ensuite retirées par incubation dans 50 % d’eau de Javel après décoration. Les embryons ont des stades définis sont montés dans la gélose.

Comme dernière étape, les embryons sont centrifugés et récupérés, en examinant les embryons récupérés à l’aide d’une lumière vive et d’une fluorescence. La microscopie montre la localisation de protéines spécifiques dans certains organites. Une stratégie majeure pour purifier et isoler les organites intracellulaires consiste à les séparer de tous les autres composants cellulaires par leur densité, mais il y a un défi et les cellules sont perturbées avant la centrifugation des protéines et des organites qui sont généralement séparés.

Les Mays se collent les uns aux autres dans ces conditions in vitro non indigènes. À l’inverse, certaines protéines peuvent tomber des structures auxquelles elles se lient habituellement. Le principal avantage de la technique que nous allons décrire est qu’elle permet une séparation par densité in vivo.

Ainsi, il évite d’ouvrir les cellules et les artefacts qui l’accompagnent. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés de biologie cellulaire. Il rend les expériences de colocalisation très faciles et permet d’isoler des fractions organiques spécifiques pour les expériences de transplantation et pour l’analyse biochimique.

Dans cette procédure, un milieu gélosé à fort pourcentage contenant du jus de pomme est préparé et versé dans des plaques comme indiqué dans le protocole écrit ci-joint. Les plaques sont utilisées à la fois à l’étape de la ponte et pour l’enrobage et la centrifugation ultérieurs des embryons. Cette procédure commence par le début de la collecte des œufs.

Tout d’abord, préparez la pâte de levure en mélangeant de la levure sèche avec de l’eau au beurre de cacahuète. Consistance : recouvrez ensuite une partie d’une plaque de gélose au jus de pomme frais avec la pâte de levure. Les mouches adultes sont gardées dans des cages auxquelles des plaques de gélose sont fixées au fond.

Pour retirer la plaque actuelle, retournez la cage à mouches et frappez-la sur le plan de travail. Quelques fois, les mouches tombent au fond et sont brièvement désorientées dans cette très courte période. Remplacez rapidement l’ancienne plaque d’agar par l’assiette fraîche recouverte de pâte de levure.

La levure fournit des nutriments pour la production d’œufs et, avec le jus de pomme dans l’agar, elle induit la marcottage des œufs. Jetez les 30 à 60 premières minutes de collecte des œufs. Il produit une grande partie des embryons mal stabilisés, car ils ont été conservés par les femelles après la fécondation.

Les collections d’ovules subséquentes ont tendance à être dominées par les ovules déposés peu de temps après la fécondation. Prélevez les ovules jusqu’à trois heures, car le marcottage le plus constant est obtenu chez les jeunes embryons. Des temps de collecte plus courts d’une heure ou moins sont préférables.

Pour les expériences de routine, utilisez une pince à épiler pour enlever les mouches collées à la levure ou à la surface de la plaque de gélose. Après avoir collecté les œufs, procédez au retrait de l’œuf, de la coquille, placez la plaque de gélose sous un microscope de dissection et observez les embryons par transillumination. Assurez-vous d’identifier les filaments d’œuf pour retirer la coquille de l’œuf des embryons.

Versez 50 % d’eau de Javel sous la plaque de gélose, en couvrant les embryons et incubez pendant plusieurs minutes. Agitez la plaque de gélose de temps en temps pour faire tourbillonner les embryons dans l’eau de Javel. Examinez à nouveau les œufs au microscope.

Une fois que les filaments d’œufs ne sont plus visibles, le Corian a été éliminé avec succès. Cela nécessite généralement trois à cinq minutes d’incubation avec la solution d’eau de Javel. Ensuite, utilisez un panier en treillis métallique comme tamis pour séparer les embryons de l’eau de Javel.

Le panier est préparé à partir d’un carré de deux centimètres sur deux centimètres d’une feuille plate en treillis métallique dentelée au milieu. Saisissez le panier métallique à l’aide d’une pince à épiler et maintenez-le sur le couvercle inversé de la plaque de gélose. Versez l’eau de Javel et la bouillie d’embryons de la plaque de gélose à travers le treillis métallique qui s’écoule dans le couvercle de la plaque de gélose.

Si les embryons restent sur la plaque de gélose, versez de l’eau distillée sur la plaque pour les déloger et versez l’eau distillée et la bouillie embryonnaire à travers le grillage. Touchez le bas du treillis métallique à une serviette en papier pour éliminer tout excès de liquide. Ensuite, versez de l’eau distillée le long du périmètre du panier métallique pour rincer l’eau de Javel restante tout en minimisant la perte d’embryons.

Épongez fréquemment l’excès de liquide. Répétez l’étape de lavage cinq à 10 fois jusqu’à ce que tout l’eau de Javel ait été éliminée. Si le panier en fil de fer sent toujours l’eau de Javel, continuez à laver les embryons.

Une fois que les embryons sont suffisamment lavés, ils peuvent être montés dans de l’agar. Lavez les embryons hors du panier métallique. Avec le SCT dans une boîte de Pétri vide, l’embryon doit couler au fond.

Sur une lunette de dissection, observez les embryons par éclairage trans. Des étapes spécifiques peuvent être facilement reconnues visuellement. À l’aide d’une pipette P 200, sélectionnez les embryons des stades souhaités et transférez-les dans une petite plaque de gélose.

Agir rapidement car les embryons vieillissent et prolongent l’immersion de plus de 30 minutes, dans le SCT peut affecter le développement à l’aide d’une pipette. Sous Kim essuyer. Retirez la majeure partie des MES.

La surface de la gélose doit être légèrement humide, ce qui facilite la poussée des embryons. Cependant, il ne doit pas y avoir de flaques de liquide sur la plaque, car l’excès de liquide pendant la centrifugation fera glisser les embryons hors des trous. L’aspect le plus difficile de cette procédure est le montage des embryons et de la tarière.

C’est particulièrement difficile car les embryons sont délicats et peuvent facilement être détruits et manipulés brutalement. Pour éviter cela, l’aiguille doit être déplacée lentement, délibérément et par petits incréments. La pratique est le meilleur moyen d’apprendre exactement combien de contact et de pression l’embryon peut supporter Montez une langue et une aiguille à l’envers dans un porte-aiguille afin que l’extrémité émoussée dépasse pendant l’observation.

Sous le microscope, utilisez l’aiguille pour percer des trous verticaux dans la gélose près de chaque embryon afin de pouvoir regarder simultanément sous le microscope tout en enfonçant le trou dans la gélose, l’aiguille est tenue à un angle. Il est donc difficile de percer des trous à une verticale parfaite. Cependant, l’inclinaison mineure de l’aiguille crée une légère dépression ou rainure d’un côté du trou, de sorte que l’embryon glisse facilement le long de celui-ci et dans le trou.

Ensuite, identifiez les extrémités antérieure et postérieure des embryons allongés, car l’embryon doit être poussé dans les trous dans une orientation cohérente. Généralement, avec l’extrémité antérieure vers le haut, la membrane ign à l’extrémité antérieure est caractérisée par une structure spécialisée. Le micro-tas, à l’aide de l’extrémité émoussée de l’aiguille, pousse l’embryon pour le déplacer le long de la gélose et pour orienter et manœuvrer son extrémité postérieure vers un trou perforé

Poussez ensuite l’extrémité antérieure vers le trou. L’embryon doit glisser facilement dans le trou le long de la légère dépression générée lors de la ponction. Au fur et à mesure que l’embryon s’incline vers le haut, enfoncez-le plus profondément dans le trou.

La gélose est suffisamment molle pour qu’une fois qu’un embryon est partiellement inséré dans un trou percé, il puisse être enfoncé plus loin sans dommage. Lorsqu’il est complètement enfoncé, l’embryon est généralement déjà assez vertical. Si nous n’alignons pas l’embryon inséré plus verticalement, nous poussons dessus sur le côté.

Si le trou n’est pas trop grand, la position de l’embryon sera maintenue de manière stable par la gélose tout au long de la centrifugation. Avec de la pratique, il est possible d’intégrer 100 à 250 embryons par plaque. Le nombre d’embryons requis dépend de l’application en aval.

Gardez le temps de montage court. Si un stade de développement étroit est souhaité puisque les embryons continuent de se développer pendant le montage, retirez les embryons inutilisés restants avec une brosse humide et anti-mouches. Ensuite, les embryons sont montés dans une gélose une centrifugeuse.

Transférez les plaques contenant les embryons de mouches dans les seaux oscillants de la gélose centrifugeuse côté vers le bas. Assurez-vous que la centrifugeuse est équilibrée uniformément et centrifugez les plaques à 4 000 rotations par minute pendant 30 minutes à une température de quatre à 10 degrés Celsius. Après la centrifugation, placez la plaque de gélose sous le microscope de dissection et recouvrez-la d’une couche de MES à l’aide de l’extrémité émoussée de l’aiguille.

Creusez les embryons de leurs trous. Les embryons flottent dans le TSS mais restent immergés. Les embryons apparaissent manifestement stratifiés avec une calotte brune à l’extrémité antérieure, une région médiane claire et une zone gris foncé à l’extrémité postérieure.

Jetez les embryons qui ne présentent pas de stratification distincte pour une observation directe par microscopie à fond clair ou à épifluorescence. À l’aide d’une pipette P 200, transférez les embryons bien stratifiés dans le SCT dans un microtube à centrifuger. Transférez ensuite les embryons en tampon sur une lame de verre, un support comme décrit dans le protocole écrit d’accompagnement.

Si les embryons doivent être fixés, à l’aide d’une pipette P 200, transférez les embryons bien stratifiés dans le TSS dans un flacon à scintillation. Fixer les embryons à l’aide de techniques de fixation standard. Étant donné que pour les embryons de centrifugeuse, l’efficacité de l’étape de dévitalisation est faible.

Commencez avec autant d’embryons que possible. Si les embryons doivent être utilisés dans des expériences de transplantation, transférez-les sur des plaques de gélose et montez-les sur des lamelles. En utilisant les procédures standard de manipulation des embryons, les références à ces procédures peuvent être trouvées dans le protocole écrit.

Le marcottage induit par la centrifugation est stable pendant des dizaines de minutes. Voici des images en lumière vive d’embryons d’oph vivants avant la centrifugation montrées avec l’extrémité antérieure à gauche et l’extrémité postérieure du côté dorsal droit. Les embryons au stade de clivage vers le haut et ventral vers le bas apparaissent uniformément.

Les stades bruns comme celui-ci sont idéaux pour la centrifugation in vivo. Les embryons de Blaster derm ont un bord transparent qui semble similaire de tous les côtés. Cette périphérie claire s’étend jusqu’à la fin de la période écoulée.

Les embryons peuvent encore être stratifiés avec succès par centrifugation jusqu’à la fin de la maturation. La stratification de l’empiècement et des noyaux n’est pas aussi constante que dans les stades de clivage. Une fois que les embryons cellulaires apparaissent asymétriques, les ventrales dorsale et ventrale deviennent distinctes et divers plis se développent.

L’embryon montré est en extension précoce de la bande germinale. Dans ces stades, la centrifugation n’est plus efficace pour stratifier les principaux organites. L’embryogenèse est un continuum.

Par conséquent, ces étapes ne sont pas des entités distinctes, mais elles se transforment les unes dans les autres au fur et à mesure du développement. Ce film en accéléré capture quatre heures de genèse embryonnaire à partir des stades de clivage. L’extension de la bande germinale, elle est accélérée 720 fois.

Voici des images d’embryons de centrifugeuse prises à l’aide d’une trans-illumination. L’embryon de gauche s’est bien stratifié. Les gouttelettes lipidiques de faible densité forment une coiffe lipidique à l’extrémité la plus antérieure.

Les véhicules vitellins à haute densité s’accumulent sous la forme d’une zone gris foncé à l’extrémité postérieure. Ces deux couches sont séparées par un large espace clair qui représente d’autres organites et le cytoplasme. L’embryon de droite a été centrifugé après l’isation.

La stratification est minime si un microscope à épifluorescence est disponible. Ces embryons centrifuges vivants peuvent être examinés sous excitation UV où le jaune présente une fluorescence intense de l’eau bleue. Une couche compacte de matériau autofluorescent au pôle postérieur indique une centrifugation réussie et sert de marqueur pour l’extrémité postérieure.

L’apparence des couches change radicalement si les embryons sont fixés. Les gouttelettes lipidiques deviennent translucides et la couche lipidique apparaît blanchâtre et duveteuse à la microscopie à lumière vive plutôt que brun foncé. La fluorescence yo corso est partiellement ou complètement détruite par la fixation, devenant beaucoup moins intense voire indétectable.

Sur cette image, les organites sont marqués avec des marqueurs fluorescents et les marqueurs accumulent des positions caractéristiques le long de l’axe antérieur postérieur. Certaines protéines de fusion d’histones localisées à la fois dans les gouttelettes lipidiques et les noyaux, peuvent donc être utilisées pour marquer ces compartiments cellulaires ainsi que pour surveiller le stade de l’embryon par le nombre de noyaux marqués. Comme vous venez de le voir, l’un des aspects les plus difficiles de cette procédure est l’intégration des embryons dans la tarière.

Mais avec un peu de pratique, vous serez en mesure de le faire rapidement et efficacement. Une fois maîtrisé. Cette technique rend très faciles les expériences de colocalisation, autrement fastidieuses.

Par exemple, notre laboratoire utilise régulièrement cette technique pour tester par microscopie à fluorescence si une protéine d’intérêt se localise dans un organite majeur spécifique. De plus, des couches individuelles peuvent être récupérées à partir des embryons de la centrifugeuse pour des analyses biochimiques ou des expériences de transplantation. Cette technique n’est pas seulement utile pour les embryons de mouches des fruits.

La centrifugation sépare également les organites en fonction de leur densité dans les œufs d’autres espèces et dans d’autres types de grandes cellules telles que les cytes.