Name: In vivo dembryons de drosophile Centrifugation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-23T16:55:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Découvrez la séparation d'organites par densité in vivo chez les embryons de Drosophila melanogaster. Cette méthode permet des expériences de colocalisation et des analyses biochimiques fiables sans artefacts de disruption cellulaire.

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Nous tenons à remercier Susan Gerbi, Heidi Smith, et ​​David Lambert pour la fourniture du matériel à tester in vivo centrifugation sur Sciara coprophila et Ilyanassa obsoleta, respectivement. Nous remercions les membres du laboratoire de Welte pour les commentaires sur la technique et du manuscrit. Développement et le raffinement de l&#39;essai de centrifugation in vivo a été soutenue par NIGMS octroi GM64687 au MAE. Les images montrées dans la Fig. 1 et Fig. 5E, F 2 ont déjà été publiés et sont reproduits ici avec sa permission.

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</ol>

Les étapes critiques Assurez-vous que la concentration en gélose est suffisamment élevée. Si elle est trop faible, l&#39;agar-agar va se désintégrer pendant la centrifugation, et les embryons vont éclater ou être orientés de manière aléatoire. Si la concentration en gélose est légèrement trop faible ou si l&#39;agar-agar est humide (retrait insuffisamment séchés ou insuffisante du TSS en excès dans l&#39;étape 4.3), les embryons va flotter hors de leurs trous pendant la centrifugation et de devenir mal orientées. Si l&#39;agar-agar est versé trop mince, il sera également l&#39;effondrement ou du crack pendant la centrifugation. Assurez-vous que les embryons n&#39;ont pas avancé au-delà stades cellularisation. Sinon, la séparation des organites ne fonctionnera pas (Fig. 5C) depuis organites deviendra séquestrées dans des milliers de cellules individuelles. Chez les jeunes embryons au stade une cellule, les organites sont libres de migrer de grandes distances et s&#39;accumulent en fonction de leur densité caractéristique. Pour éviter d&#39;analyser les embryons qui sont trop vieux, assurez-vous de (i) comprennent une collection pré-pour permettre aux femelles de pondre des œufs anciens (étape 2.4), (ii) percevoir des embryons pour 3 heures ou moins (étape 2.5), (iii) sélectionner visuellement les embryons avant les étapes cellularisation pour s&#39;intégrer dans la gélose (étape 4.2), (iv) tenir intégrant peu de temps pour empêcher le développement jusqu&#39;à la fin de cellularisation (étape 4.6), et (v) de jeter les embryons qui n&#39;ont pas la couche correctement (étape 5.6) . Ne lésinez pas sur le temps de centrifugation. Bien que certains des embryons montrera superposition belle même après seulement 10 minutes de centrifugation, la séparation est incompatible de l&#39;embryon à l&#39;embryon. 30 tours min donnent des résultats très cohérents. En outre, plus le temps de centrifugation, le plus les couches sont stables après la centrifugation est terminée. Ceci est important pour les applications où il faut du temps pour traiter les autres embryons avant de les utiliser (par exemple, s&#39;ils ont besoin d&#39;être traitées pour des expériences de transplantation ou montés pour l&#39;analyse confocale). D&#39;éventuelles modifications Collecte des oeufs et de chorion retrait de nombreux protocoles différents existent pour les étapes 2 et 3 1, 3, 9, et fonctionne aussi bien que celles décrites ici aussi longtemps que les embryons utilisés sont des jeunes, le rendement d&#39;oeuf est élevé, et la fraction de mal embryons en scène est minimisé. Antéro-postérieure d&#39;alignement Le protocole oriente tous les embryons de telle sorte que l&#39;extrémité postérieure est enterré dans la gélose et l&#39;extrémité antérieure est en haut (fig. 3). Cette orientation est bonne pour la cohérence, de sorte qu&#39;il est possible d&#39;utiliser le micropyle comme un repère qui bout pointu pendant la centrifugation (Fig. 1, 5). Cependant, avec la pratique, il est facile de repérer l&#39;orientation des embryons centrifugé par l&#39;apparition distincte du lipide-goutte et les couches de jaune lumineux par microscopie à champ. Alors il devient possible de monter des embryons avec soit finissent; cette flexibilité accélère le processus de montage. Centrifugation non orientés L&#39;aspect le plus-de temps et techniquement difficiles de ce protocole est de fixation des embryons dans l&#39;agar (étape 4). Elle exige de toucher chaque embryon (une fois pour l&#39;insérer dans le trou et une fois de récupérer l&#39;après centrifugation). Comme alternative, on peut transférer des embryons à l&#39;étape 4.1 dans des microtubes rempli de TSS. Lorsque ces tubes sont centrifugés dans une microcentrifugeuse (13.000 rpm, 10-30 min), les embryons seront aussi généralement couche bien 10-13. Cette variation permet de traiter des centaines d&#39;embryons dans le même temps très rapidement. Cependant, la superposition n&#39;est pas aussi cohérente, une fraction des embryons ne se développent pas de couches distinctes, malgré les forces de centrifugation beaucoup plus élevé (~ 16 000 g) que appliquée dans le protocole précédent. Plus difficile est le fait que l&#39;orientation de l&#39;embryon est variable, et on peut observer une séparation à différents angles à l&#39;axe de l&#39;embryon majeur. Cette variabilité impose à l&#39;expérimentateur de trier après la centrifugation comment un embryon particulier a été organisé dans le tube à centrifuger. Avec l&#39;utilisation de l&#39;autofluorescence jaune comme un marqueur de la partie la plus dense de-l&#39;embryon, ce qui est souvent possible, mais il exige beaucoup de pratique et plus de jugement pour le faire de manière fiable. S&#39;il ya des embryons suffisamment dans l&#39;échantillon, on peut être capable de trier les cas où les embryons se trouvait être disposés comme dans la Fig. 1. La centrifugation des embryons dans leur coquille d&#39;œuf, il est possible d&#39;intégrer des embryons dans l&#39;agar pour l&#39;étape 4 sans avoir à retirer le chorion 2 premiers. Dans cette approche, les embryons sur la plaque de collecte sont couverts avec de l&#39;huile d&#39;halocarbures au lieu d&#39;eau de Javel à 50% à l&#39;étape 3.2 (halocarbures tourne le chorion translucide). Les embryons de stades appropriés sont sélectionnés et transférés à une plaque de gélose nouvelle aide de pinces; en saisissant uniquement les filaments d&#39;oeuf avec la pince à épiler, des dommages auxle bon embryon est évitée. Les embryons sont intégrées comme dans l&#39;étape 4.4 à 4.8, avec les filaments d&#39;oeuf antérieure collant vers le haut du trou dans la gélose. La coquille d&#39;œuf est éliminé par traitement javel 50% après les embryons ont été centrifugés et creusé de l&#39;agar comme à l&#39;étape 5.4. La centrifugation en présence de la coquille d&#39;oeuf peut améliorer le taux de devitellinization après fixation (étape 6.2), mais la sélection des étapes correctes pour la centrifugation (étape 4.2) est plus difficile. Applications Centrifugation embryon est particulièrement utile pour des expériences de colocalisation, soit pour tester si une protéine particulière se localise dans une certaine organite majeur. Par exemple, la protéine est présente sur Klar début gouttelettes lipidiques embryonnaire, pourtant, cette localisation est difficile à démontrer dans les embryons intacts. En partie, cela est parce que les deux points lacrymaux et Klar gouttelettes lipidiques sont abondants dans la périphérie 10 embryons, ce qui rend difficile de colocalisation fallacieuses exclure. Toutefois, la centrifugation concentre gouttelettes lipidiques dans une couche distincte, et donc, colocalisation avec signal Klar devient évident 10. Une analyse similaire a démontré sans équivoque la localisation d&#39;autres protéines à 8 gouttelettes lipidiques, 13-15, y compris des exemples surprenants, comme les histones certains 2 et dans les cas où une protéine est présente de façon ubiquitaire, mais enrichi sur 8 gouttelettes lipidiques. Comme les embryons peuvent être sélectionnées visuellement par le stade de développement (étape 4.2), il est même possible de détecter le recrutement régulés par le développement de protéines à 8 gouttelettes lipidiques, 15. Test de colocalisation avec des gouttelettes lipidiques est particulièrement facile puisque gouttelettes lipidiques s&#39;accumulent dans un visuellement distincte &quot;bouchon&quot;, donc pas de marqueur supplémentaires ou de la teinture est nécessaire pour identifier cette couche. En fait, en raison de sa facilité et potentiellement frappante résultats visuels (Fig. 1, Fig. 5 D, E), notre laboratoire utilise cette technique maintenant couramment comme un premier test si une protéine candidate est localisée à gouttelettes lipidiques. En principe, les études de colocalisation similaires devraient travailler pour le autres organites Fig. 1, et probablement pour d&#39;autres (y compris les parasites intracellulaires) dont la distribution dans les embryons centrifugé n&#39;a pas encore été documentée. Depuis centrifugation concentre organites en bandes serrées, il facilite l&#39;isolement d&#39;une fraction enrichie dans ces organites. Cette approche a déjà été utilisé pour récupérer des gouttelettes lipidiques pour la transplantation en 2 embryons donateurs. Il peut également être possible d&#39;analyser biochimiquement la fraction enrichie (par exemple, en coupant les couches hors embryons après fixation 15). La méthode décrite ici a des applications au-delà des embryons de drosophile, comme la centrifugation peuvent être utilisées pour stratifier les œufs de différentes espèces (y compris les grenouilles, les nématodes, les tuniciers, les annélides, les oursins, les mollusques, et les cnidaires) 16. Dans notre propre laboratoire, nous avons utilisé le protocole ci-dessus pour les embryons de la mouche domestique Musca domestica 2 et ont eu recours à la centrifugation non orientés dans l&#39;analyse des embryons de la coprophila sciarides Sciara 17 et l&#39;escargot Ilyanassa obsoleta 17. Enfin, cette méthode n&#39;est pas limitée aux embryons: Centrifugation peut également être utile pour stratifier les autres grandes cellules, telles que des ovocytes (par exemple, chez la drosophile 2, 18 et l&#39;asclépiade bug Oncopeltus fasciatus 17). Pour obtenir un spécimen différent, les conditions de centrifugation exactes doivent être optimisés: Par exemple, 10 minutes à 3000 g est suffisant pour stratifier efficacement embryons de Musca domestica 2, et si centrifugé beaucoup plus long, les embryons ont tendance à se briser lors de la fixation et immunocoloration.

<table><tbody><tr><td>Boîtes de Pétri 60x15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>#35-1007</td><td>De Falcon</td></tr><tr><td>Grille métallique</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150</td><td>Acier inoxydable de type 304 ; taille de la maille #150 x150, diamètre du fil : 0,0026 pouces</td></tr><tr><td>Aiguilles en tungstène</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>0,25 mm</td></tr><tr><td>Support d'aiguille/épingle nickelé Moria</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Cages à mouches</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 ou 59-101</td><td>Pour boîtes de Pétri de 65 mm ou 100 mm de diamètre, respectivement</td></tr><tr><td>Huile d'halocarbone 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo d&#39;embryons de drosophile centrifugation

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Une stratégie importante pour purifier et d&#39;isoler les différents types d&#39;organites intracellulaires est de les séparer les uns des autres en fonction des différences dans la densité de flottaison. Toutefois, lorsque les cellules sont perturbés avant la centrifugation, les protéines et les organites dans cet environnement non indigènes souvent de manière inappropriée coller les unes aux autres. Nous décrivons ici une méthode pour séparer par des organites de densité dans intactes, des embryons de drosophile vivant. Embryons précoces, avant cellularisation sont récoltés dans des cages de la population, et leurs coquilles d&#39;œuf extérieures sont éliminés par traitement à l&#39;eau de Javel à 50%. Les embryons sont ensuite transférés à une plaque de gélose de petites et insérées, extrémité postérieure d&#39;abord, dans de petits trous verticaux dans la gélose. Les plaques contenant des embryons incorporés sont centrifugés pendant 30 min à 3000g. L&#39;agar soutient les embryons et les maintient dans une orientation définie. Ensuite, les embryons sont creusés dans la gélose avec une aiguille émoussée. La centrifugation sépare organites majeurs en couches distinctes, une stratification facilement visible par microscopie à champ lumineux. Un certain nombre de marqueurs fluorescents sont disponibles pour confirmer la stratification succès dans les embryons vivants. Protéines associées à certains organites sera enrichie d&#39;une couche particulière, démontrant colocalisation. Couches individuelles peuvent être récupérées pour analyse biochimique ou transplantation dans des oeufs de donneur. Cette technique est applicable pour la séparation des organites dans d&#39;autres grandes cellules, y compris les œufs et les ovocytes d&#39;espèces diverses.

Nous décrivons une méthode d&#39;organites séparés par la densité dans la vie<em&gt; Drosophile</em&gt; Embryons. Les embryons sont intégrés dans l&#39;agar et centrifugé. Cette technique donne une séparation reproductible des organites majeurs long de l&#39;axe antéro-postérieure d&#39;embryon. Cette méthode facilite les expériences de colocalisation et les rendements des fractions organite pour l&#39;analyse biochimique et des expériences de transplantation.

In vivo d&#39;embryons de drosophile Centrifugation

Une stratégie majeure pour purifier et isoler différents types d'organites intracellulaires consiste à les séparer les uns des autres en se basant sur des différences de...

La séparation des principaux organites à l'intérieur des œufs de drosophile par densité commence par la récolte d'embryons âgés de moins de trois heures. Les coquilles d'œufs sont ensuite éliminées par une incubation dans de l'eau de Javel à 50 % après déchorionation. Les embryons, qui présentent des stades bien définis, sont montés dans de l'agar.En dernière étape, les embryons sont centrifugés et récupérés, puis examinés à l'aide d'une lumière vive et de la fluorescence. La microscopie montre la localisation de protéines spécifiques vers certains organites. Une stratégie majeure pour purifier et isoler les organites intracellulaires consiste à les séparer de tous les autres composants cellulaires par densité, mais un défi existe : les cellules sont rompues avant la centrifugation, ce qui mélange les protéines et les organites normalement séparés.Les maïs s'agglutinent sous ces conditions in vitro non naturelles. Inversement, certaines protéines pourraient se détacher des structures auxquelles elles se lient habituellement. Le principal avantage de la technique que nous allons décrire est qu'elle permet une séparation par densité in vivo.Ainsi, elle évite de rompre les cellules et les artefacts qui y sont associés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire. Elle rend les expériences de colocalisation très simples et permet l'isolement de fractions organellaires spécifiques pour des expériences de transplantation et pour des analyses biochimiques.Dans cette procédure, un milieu d'agar à forte concentration contenant du jus de pomme est préparé et versé dans des boîtes selon les instructions détaillées dans le protocole écrit joint. Les boîtes sont utilisées à la fois lors de l'étape de ponte et pour l'incorporation ultérieure ainsi que pour la centrifugation des embryons. Cette procédure commence par le début de la collecte des œufs.Tout d'abord, préparez une pâte de levure en mélangeant de la levure sèche avec de l'eau jusqu'à obtenir une consistance similaire à celle du beurre d'arachide. Ensuite, recouvrez une partie d'une plaque d'agar au jus de pomme fraîchement préparée avec la pâte de levure. Les mouches adultes sont maintenues dans des cages auxquelles des plaques d'agar sont fixées sur le dessous.Pour retirer la plaque actuelle, retournez la cage à mouches et frappez-la contre le plan de travail. À plusieurs reprises, les mouches tombent au fond et sont brièvement désorientées pendant cette très courte période. Remplacez rapidement l'ancienne plaque d'agar par une plaque fraîche recouverte de pâte de levure.La levure fournit la nutrition nécessaire à la production d'œufs, et, conjointement avec le jus de pomme présent dans l'agar, elle induit la ponte. Jetez la première récolte d'œufs, effectuée durant les 30 à 60 premières minutes, car elle fournit une grande proportion d'embryons mal stagés, ayant été retenus par les femelles après la fécondation.Les récoltes d'œufs ultérieures ont tendance à être dominées par des œufs déposés peu de temps après la fécondation. Récoltez les œufs pendant un maximum de trois heures, car la stratification la plus constante est obtenue chez les embryons jeunes. Des durées de récolte plus courtes, d'une heure ou moins, sont préférables.Pour les expériences de routine, utilisez une pince pour retirer les mouches collées à la levure ou à la surface de la boîte de gélose. Après avoir collecté les œufs, procédez au retrait de la coquille, placez la boîte de gélose sous un microscope stéréoscopique et observez les embryons par transillumination. Assurez-vous d'identifier les filaments de l'œuf afin de retirer la coquille des embryons.Projeter de l'eau de Javel à 50 % sous la boîte de gélose, en recouvrant les embryons, et incuber pendant plusieurs minutes. Agiter occasionnellement la boîte de gélose pour faire circuler les embryons dans l'eau de Javel. Examiner à nouveau les œufs au microscope.Une fois que les filaments d'œufs ne sont plus visibles, le Corian a été correctement éliminé. Cela nécessite généralement une incubation de trois à cinq minutes avec la solution d'eau de Javel. Ensuite, utilisez un panier en treillis métallique comme tamis pour séparer les embryons de l'eau de Javel.Le panier est préparé à partir d'un carré de deux centimètres sur deux centimètres d'une feuille plate en treillis métallique, indentée au milieu. Saisissez le panier métallique avec des pinces et tenez-le au-dessus du couvercle inversé de la boîte de gélose. Versez le mélange d'embryons et d'eau de Javel de la boîte de gélose à travers le treillis métallique, en laissant s'écouler dans le couvercle de la boîte de gélose.Si des embryons restent sur la plaque d'agar, projetez de l'eau distillée sur la plaque pour les détacher, puis versez le mélange d'eau distillée et d'embryons à travers la passoire en treillis métallique. Touchez le fond de la passoire en treillis métallique avec une serviette en papier pour absorber tout excès de liquide. Ensuite, projetez de l'eau distillée le long du périmètre du panier métallique pour rincer le résidu d'eau de Javel tout en minimisant la perte d'embryons.Éliminer fréquemment l'excès de liquide. Répéter l'étape de lavage de cinq à dix fois jusqu'à ce que tout l'eau de Javel ait été éliminée. Si le panier en fil métallique sent encore l'eau de Javel, continuer à laver les embryons.Une fois que les embryons sont suffisamment lavés, ils peuvent être montés dans de l'agar. Lavez les embryons hors du panier métallique. Avec du TSS dans une boîte de Pétri vide, l'embryon doit couler au fond.Sous un microscope stéréo, observer les embryons en transillumination. Les stades spécifiques peuvent être facilement reconnus visuellement. À l’aide d’une pipette P200, sélectionner les embryons aux stades souhaités et les transférer sur une petite boîte de gélose.Travaillez rapidement car les embryons vieillissent et une immersion prolongée de plus de 30 minutes dans le TSS peut affecter le développement, en utilisant une pipette. Sous un essuie-Kim. Éliminez la majeure partie du TSS.La surface de l'agar doit être légèrement humide, ce qui facilite le déplacement des embryons. Toutefois, il ne doit subsister aucune flaque de liquide sur la plaque, car un excès de liquide pendant la centrifugation provoquerait le glissement des embryons hors des trous. L'aspect le plus difficile de cette procédure est le montage des embryons et de la tarière.Cela est particulièrement difficile car les embryons sont délicats et peuvent facilement être endommagés ou manipulés de manière trop brutale. Pour éviter cela, l’aiguille doit être déplacée lentement, avec précaution et par petits incréments. La pratique est la meilleure façon d’apprendre précisément quelle quantité de contact et de pression l’embryon peut supporter. Monter une lame et une aiguille en sens inverse dans un porte-aiguille afin que l’extrémité émoussée dépasse, tout en observant.Sous le microscope, utilisez l'aiguille pour percer des trous verticaux dans l'agar près de chaque embryon afin de pouvoir observer simultanément au microscope tout en perçant le trou dans l'agar. L'aiguille est tenue selon un angle, ce qui rend difficile le perçage de trous parfaitement verticaux. Toutefois, l'inclinaison mineure de l'aiguille crée une légère dépression ou rainure sur un côté du trou, permettant ainsi à l'embryon de glisser facilement le long de celle-ci et de pénétrer dans le trou.Ensuite, identifiez les extrémités antérieure et postérieure des embryons allongés, car l'embryon doit être introduit dans les trous selon une orientation constante. Généralement, avec l'extrémité antérieure vers le haut, la membrane ign à l'extrémité antérieure présente une structure spécialisée. À l’aide de la pointe émoussée de l’aiguille, poussez l’embryon pour le déplacer le long de l’agar et orienter son extrémité postérieure vers un trou perforé.Ensuite, pousser l'extrémité antérieure vers le trou. L'embryon doit glisser facilement dans le trou le long de la légère dépression créée lors de la perforation. Lorsque l'embryon s'incline vers le haut, le pousser plus profondément dans le trou.L'agar est suffisamment mou pour que, une fois qu'un embryon est partiellement inséré dans un trou percé, on puisse le pousser davantage sans l'endommager. Lorsqu'il est complètement enfoncé, l'embryon est généralement déjà assez vertical. Sinon, on aligne l'embryon inséré plus verticalement en exerçant une pression latérale.Si le trou n'est pas trop grand, la position de l'embryon sera maintenue de façon stable par l'agar tout au long de la centrifugation. Avec de la pratique, il est possible d'incorporer de 100 à 250 embryons par boîte. Le nombre d'embryons nécessaires dépend de l'application en aval.Réduisez au minimum la durée du montage. Si un stade de développement précis est souhaité, car les embryons continuent de se développer pendant le montage, retirez les embryons non utilisés à l’aide d’un pinceau humide et propre. Ensuite, placez les embryons montés dans l’agar dans une centrifugeuse.Transférez les plaques contenant les embryons de drosophile dans les godets tournants de la centrifugeuse, côté gélose vers le bas. Assurez-vous que la centrifugeuse est parfaitement équilibrée, puis centrifugez les plaques à 4 000 tours par minute pendant 30 minutes à une température comprise entre 4 et 10 degrés Celsius. Après la centrifugation, placez la plaque de gélose sous le microscope stéréoscopique et recouvrez-la d'une couche de TSS à l'aide de l'extrémité émoussée de l'aiguille.Extraire les embryons de leurs alvéoles. Les embryons flottent dans le TSS mais restent immergés. Les embryons présentent une stratification nette, avec un capuchon brun à l'extrémité antérieure, une région médiane transparente et une zone gris foncé à l'extrémité postérieure.Jetez les embryons qui ne présentent pas une stratification nette permettant une observation directe par microscopie en champ clair ou en microscopie à épifluorescence. Utilisez une pipette P200 pour transférer les embryons bien stratifiés dans du TSS vers un tube microcentrifuge. Transférez ensuite les embryons en tampon sur une lame de verre et montez-les comme décrit dans le protocole écrit accompagnant.Si les embryons doivent être fixés, utilisez une pipette P200 pour transférer les embryons bien stratifiés en TSS dans un flacon de scintillation. Fixez les embryons en utilisant des techniques de fixation standard. En effet, pour les embryons centrifugés, l'efficacité de l'étape de dévitalisation est faible.Commencez avec autant d'embryons que possible selon les contraintes pratiques. Si les embryons doivent être utilisés dans des expériences de transplantation, transférez-les sur des boîtes de gélose et montez-les sur des lamelles. En suivant les procédures standard de manipulation des embryons, des références à ces procédures sont disponibles dans le protocole écrit.La stratification induite par la centrifugation est stable pendant plusieurs dizaines de minutes. Voici des images en lumière vive d'embryons vivants d'oph avant la centrifugation, présentées avec l'extrémité antérieure à gauche et l'extrémité postérieure à droite, le côté dorsal vers le haut et le côté ventral vers le bas. Les embryons au stade de segmentation apparaissent uniformes.Les stades bruns comme celui-ci sont idéaux pour la centrifugation in vivo. Les embryons Blaster derm présentent un bord net qui apparaît similaire de tous les côtés. Cette périphérie claire s'étend jusqu'à la fin de la ization.Les embryons peuvent encore être correctement stratifiés par centrifugation jusqu'à la fin de la fécondation. La stratification du vitellus et des noyaux n'est pas aussi constante que durant les stades de segmentation. Une fois que les embryons cellulaires apparaissent asymétriques, les régions dorsale et ventrale deviennent distinctes et divers plis se développent.L'embryon illustré se trouve en phase précoce d'extension de la bande germinative. À ces stades, la centrifugation n'est plus efficace pour stratifier les principaux organites. L'embryogenèse est un continuum.Par conséquent, ces stades ne sont pas des entités distinctes, mais se transforment les uns en les autres au fur et à mesure du développement. Ce film accéléré montre quatre heures de genèse embryonnaire à partir des stades de segmentation. L'extension de la bande germinative est accélérée 720 fois.Voici des images d'embryons centrifugés prises en trans-illumination. L'embryon de gauche s'est bien stratifié. Les gouttelettes lipidiques de faible densité forment un bouchon lipidique à l'extrémité antérieure la plus distale.Les véhicules de jaune d'œuf à haute densité s'accumulent sous forme d'une zone gris foncé à l'extrémité postérieure. Ces deux couches sont séparées par une large zone claire représentant d'autres organites et le cytoplasme. L'embryon situé à droite a été centrifugé après la fécondation.La stratification est minimale si un microscope à fluorescence épiscopique est disponible. Ces embryons vivants centrifugés peuvent être observés sous excitation UV, où le vitellus présente une forte fluorescence bleue due à l'eau. Une couche compacte de matériau autofluorescent au pôle postérieur indique une centrifugation réussie et sert de marqueur pour l'extrémité postérieure.L'apparence des couches change considérablement si les embryons sont fixés. Les gouttelettes lipidiques deviennent translucides et la couche lipidique apparaît blanchâtre et duveteuse en microscopie à lumière vive, plutôt que brun foncé. La fluorescence de Yo corso est partiellement ou complètement détruite par la fixation, devenant beaucoup moins intense ou même indétectable.Dans cette image, les organites sont marqués par des marqueurs fluorescents et ces marqueurs s'accumulent à des positions caractéristiques le long de l'axe antéro-postérieur. Certaines protéines de fusion d'histone se localisent à la fois dans les gouttelettes lipidiques et les noyaux, et peuvent donc être utilisées pour marquer ces compartiments cellulaires ainsi que pour surveiller le stade de l'embryon en fonction du nombre de noyaux marqués. Comme vous venez de le voir, l'un des aspects les plus délicats de cette procédure consiste à inclure les embryons dans la vis sans fin.Mais avec un peu d'entraînement, vous serez en mesure d'effectuer cela rapidement et efficacement. Une fois maîtrisée, cette technique rend très facile des expériences de colocalisation autrement fastidieuses.Par exemple, notre laboratoire utilise couramment cette technique pour tester par microscopie de fluorescence si une protéine d'intérêt se localise dans un organite majeur spécifique. De plus, des couches individuelles peuvent être récupérées à partir des embryons centrifugés pour des analyses biochimiques ou des expériences de transplantation. Cette technique n'est pas uniquement utile pour les embryons de drosophile.La centrifugation sépare également les organites par densité dans les œufs d'autres espèces et dans d'autres types cellulaires volumineux tels que les cytes.

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