Chargement du fret sur la kinésine Powered navettes moléculaires

L'objectif général de cette procédure est de fixer des nanosphères sur des microtubules qui glissent sur une surface recouverte de kinésine sous forme de moteurs. Cette opération s'effectue en deux étapes : premièrement, on recouvre la surface d'une chambre à écoulement en verre avec une solution de caséine. La deuxième étape consiste à absorber des protéines motrices de kinésine sur la surface de la chambre à écoulement.

La troisième étape de la procédure consiste à ajouter les microtubules. La dernière étape de la procédure consiste à ajouter les molécules de strept haver, qui se lieront aux microtubules, puis à ajouter les nanosphères. Les nanosphères se lient à la surface de la chambre d'écoulement, où elles peuvent être capturées par les microtubules.

En fin de compte, on peut observer comment les nanosphères sont captées par les microtubules et transportées à travers la surface à l’aide de la microscopie à fluorescence. Bonjour, je suis Elaine Jen Smith du laboratoire du Dr Henry Hess et du Département des sciences et génie des matériaux de l’Université de Floride. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour le test de mobilité inversé.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le chargement de cargaisons sur les microtubules et le déplacement des transporteurs moléculaires. Commençons donc. Avant le début de cette procédure, préparez fraîchement toutes les solutions mères comme décrit dans la partie écrite de cette vidéo.

Une fois les solutions mères préparées, commencez la préparation des microtubules en pipetant 25 microlitres de solution de croissance dans un tube de microcentrifugation de 0,65 millilitre. Ajoutez ensuite 6,25 microlitres de la solution de croissance à 20 microgrammes de tubuline biotinylée lyophilisée. Vortexez la solution et placez-la dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour polymériser. Après incubation, diluez la solution 100 fois dans du tampon Taxol et vortexez délicatement.

Cette solution permet de stabiliser les microtubules. Étiquetez la solution comme étant vide 100 et conservez-la à température ambiante. Ensuite, effectuez une dilution au dixième de MT 100 dans du tampon anti-fade et étiquetez cette solution comme MT 1000.

Préparez ensuite les moteurs kinésine en diluant la solution de kinésine 20 fois dans un tampon TP. Étiquetez la solution comme « kinase 20 » et conservez-la sur de la glace. Enfin, préparez les solutions de streptavidine et de nanosphères.

Tout d'abord, ajouter de la streptavidine marquée Alexa Fluor 568 à une concentration de 100 nanomolaires dans du tampon Antifa. Étiqueter la solution comme STV 100, puis diluer les nanosphères 5 000 fois dans le tampon Antifa et étiqueter ce mélange comme NS 5 000. Conserver ces deux solutions sur de la glace.

Après la préparation de la solution pour le test de chargement de la cargaison, construisez une cellule d'écoulement en utilisant une lame porteuse et une lamelle en verre séparées par du ruban adhésif double face. Fixez d'abord deux bandes de ruban adhésif double face sur les bords d'une lame porteuse, en laissant un espace d'environ un centimètre entre les bandes. Puis placez une lamelle par-dessus le ruban.

Appliquez une pression sur la lame en utilisant le bord plat d'une pince pour former un joint. La cellule d'écoulement construite mesure environ deux centimètres de long, un centimètre de large et 100 microns de haut, et possède un volume d'environ 20 microlitres. Pour commencer l'assemblage de l'essai inversé.

Placer la pointe de la pipette entre la lamelle et la lame. Ensuite, injecter une solution de caséine à 0,5 milligramme par millilitre dans la cellule d'écoulement. Ce revêtement de la cellule d'écoulement permettra à la kinésine de conserver sa fonctionnalité après absorption.

Attendre cinq minutes pour que la solution de caséine recouvre la surface. Ensuite, fixer la kinésine sur la chambre d'écoulement en introduisant la kinase dans la solution 20. Les solutions sont introduites dans les chambres d'écoulement en plaçant la pointe de la pipette entre la lame couvre-objet et la lame porte-objet. La solution est alors injectée dans la chambre d'écoulement par un côté, tout en étant simultanément évacuée par l'autre côté par capillarité.

À l’aide d’un papier filtre, laissez cinq minutes pour permettre à la kinase de s’absorber. Ensuite, introduisez les microtubules dans la chambre d’écoulement en pipetant la solution MT 1000 dans la chambre. Laissez cinq minutes pour que les microtubules se déposent et s’attachent aux moteurs de kinase in suite à l’attachement des microtubules aux moteurs de kinase in.

Recouvrir les microtubules avec du strep TTR fluorescent en introduisant la solution STV 100 dans la chambre d'écoulement. Laisser cinq minutes pour que les molécules de strep TTR se lient aux microtubules. Éliminer l'excès de strep TTR par trois lavages de 30 microlitres de solution Antifa introduits dans la chambre d'écoulement.

Enfin, introduisez les nanosphères fluorescentes de polystyrène biotinylées en pipetant la solution NS 5 000 dans la cellule d'écoulement. La surface absorbe de manière stationnaire. Les nanosphères entreront en collision avec les microtubules en mouvement et s'y fixeront.

Dans cette expérience, un microscope à fluorescence Eclipse TE 2000 U équipé d'un objectif à immersion huile de 100 x et de X site, d'une lampe 20 et d'une caméra Exon E-M-C-C-D est utilisé. Appliquez d'abord une goutte d'huile à immersion sur l'objectif. Ensuite, fixez la cellule d'écoulement sur la platine du microscope à l'aide du cube de filtres trixy.

Mettez les microtubules au point, puis passez au cube de filtre fitzy pour observer les nanosphères. Ensuite, ouvrez le programme and or I exon et réglez le mode d'acquisition sur cinétique. Utilisez un temps d'exposition de 0,5 seconde, une durée de série cinétique de 20 et un temps de cycle cinétique de six secondes.

Passer du microscope à l'oculaire à la caméra et commencer à acquérir des images. Pour les quatre premières images, utiliser le cube trixi pour imager les microtubules. Pour les 12 images suivantes, passer au cube de filtre Fitz afin d'acquérir des images des nanosphères.

Ensuite, revenir au cube de filtres trixi. Pour les quatre dernières images permettant de visualiser les microtubules, ces derniers sont observés à l’aide du cube de filtres Trissy ; le cube de filtres est alors basculé sur fite. Pour visualiser les nanosphères ici, les nanosphères transportées par les microtubules sont indiquées par des flèches. Toutes les nanosphères n’ont pas été captées par les microtubules.

Maintenant, l'emplacement des nanosphères est montré 36 secondes plus tard, révélant que les nanosphères se sont déplacées. Lorsque les microtubules sont à nouveau imagés, il devient évident qu'ils se sont également déplacés à travers le champ de vision. Ces images démontrent que les nanosphères ont été déplacées en raison du transport par les microtubules.

Nous venons de vous montrer comment réaliser le test de mobilité inversé. Lors de cette procédure, il est important de penser à changer les cubes de filtres pendant l'acquisition des images afin de visualiser à la fois les microtubules et les nanosphères. Voilà, c'est terminé.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.