Name: Chargement du fret sur la kinésine Powered navettes moléculaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Découvrez l'assemblage d'un système de navettes moléculaires utilisant des microtubules fonctionnalisés glissant sur des protéines motrices kinesine. Cette méthode permet le chargement de nanosphères pour des applications de transport à l'échelle nanométrique.

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Nous sommes très reconnaissants à Jonathan Howard, dont le groupe a développé le protocole de base pour un test de mobilité par glissement qui a ensuite été adapté par nos soins. Le soutien financier de la NSF subvention DMR0645023 est grandement appréciée.

1.) Tampons et réactifs Ces solutions doivent être préparées à l'avance et stocké en aliquotes de taille pratique. Une aliquote doit contenir suffisamment de solution pour une expérience typique et une autre partie aliquote doit être utilisé pour chaque test de motilité. Les conditions de stockage et de tailles typiques aliquotes sont également mentionnées dans les protocoles suivants. 1. BRB80 tampon (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA dans désionisée distillée (dd) d'eau, le pH ajusté à 6,9 par KOH) <ul><li> Préparez une solution de 100 ml de bouillon de 0,5 M EGTA dans l'eau dd. Ajuster le pH à 7,0 en utilisant une solution de NaOH 2 M. </li><li> Préparez une solution de 100 ml de bouillon de 1 M MgCl 2 dans l'eau dd. Autoclaver la solution. </li><li> Ajouter 24,2 g de PIPES et 3,1 g de pastilles de KOH à environ 800 ml d'eau dd et mélanger pour dissoudre. Ajuster le pH à 6,9 avec 1 M de solution de KOH. Ajouter 2 ml d'une solution 0,5 M de stock EGTA et 1 ml de 1 M MgCl 2 SOLUTIsur. Montez le volume à 1000 ml avec de l'eau dd. </li><li> Aliquoter dans des tubes de 50 ml falcon et congeler à -20 ° C pour une utilisation future. Le tube BRB80 actuellement utilisé peut être conservé à 4 ° C ou à température ambiante. </li></ul> 2. Chlorure de magnésium MgCl 2 (100 mM dans l'eau dd) <ul><li> Diluer dans de l'eau dd pour obtenir une concentration finale de 100 mM. </li><li> Aliquote (10 uL de volume) dans 0,5 ml microtubes et conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure </li></ul> 3. Guanosine-5'-triphosphate, sel disodique, le GTP (25 mM dans de l'eau dd, pH ajusté à 7 par NaOH) <ul><li> Peser et dissoudre dans l'eau dd et ajuster le pH à 7 par une solution de NaOH 2 M. </li><li> Vérifiez la concentration en mesurant l'absorbance UV à 260 nm. (Utilisez un coefficient d'extinction de 11,7 x 103 M -1 cm -1). </li><li> Aliquote (10 uL de volume) dans 0,5 ml microtubes et conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </li> 4. Le diméthylsulfoxyde, DMSO <ul><li> Aliquote (10 uL de volume) dans 0,5 ml microtubes et conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ul> 5. Taxol (1 mM dans du DMSO) <ul><li> Peser et dissoudre dans du DMSO sous une hotte pour obtenir une concentration finale de 1 mM. </li><li> Aliquote (20 uL de volume) dans 0,5 ml microtubes et conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ul> 6. D-(+)-glucose, (2 M dans l'eau dd) <ul><li> Peser et dissoudre dans l'eau dd pour obtenir une concentration finale de 2 M. </li><li> Aliquote (20 uL de volume) dans 0,5 ml microtubes et conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ul> 7. Glucose oxydase, (2 mg / ml dans BRB80) <ul><li> Dissoudre dans BRB80 pour atteindre une concentration finale de 2 mg / mL. </li><li> Aliquote (20 uL de volume) dans 0,5 ml microtubes et conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ul><pclass dithiothr tnt m dans l dd><ul><li> Dissoudre dans l'eau dd sous une hotte pour obtenir une concentration finale de 1 M. </li><li> Aliquote (20 uL de volume) dans 0,5 ml microtubes et conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ul> 9. Catalase, (0,8 mg / ml dans BRB80) <ul><li> Dissoudre dans BRB80 en au moins 2 étapes pour atteindre une concentration finale de 0,8 mg / ml. Déterminer la concentration à chaque étape par mesure de l'absorbance UV à 276 nm et 406 nm (Utilisez un coefficient d'extinction de 3,1 x 10 5 M -1 cm -1 à 276 nm et 2,2 x 10 5 M -1 cm -1 à 406 nm et l'équation A = Cl). </li><li> Aliquote (20 uL de volume) dans 0,5 ml microtubes et conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ul> 10. Adénosine-5'-triphosphate, ATP (100 mM dans 100 mM de MgCl 2) <ul><li> Préparer une solution mère de 100 mM de MgCl2 jj water. Peser la poudre sèche et se dissolvent dans cette solution mère pour obtenir une concentration finale de 100 mM. </li><li> Vérifiez la concentration en mesurant l'absorbance UV à 260 nm. (Utilisez un coefficient d'extinction de 15,4 x 10 3 M -1 cm -1). </li><li> Aliquote (20 uL de volume) dans 0,5 ml microtubes et conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ul> 11. Caséine solution (20 mg / ml dans de la caséine BRB80) <ul><li> Ajouter environ 3 g de caséine à 30 ml d'eau dd dans un tube Falcon de 50 ml. Vortex pendant environ 1 heure jusqu'à ce que la solution se développe consistance épaisse. </li><li> Centrifuger à environ 15000 g pendant 30 minutes. Filtrer le surnageant à 0,5 um et 0,2 um filtres seringues. </li><li> Déterminer la concentration du surnageant en mesurant l'absorbance UV à 280 nm (Utilisez un coefficient d'extinction de 0,67 mg mL -1 -1 cm). Diluez à 20 mg / mL dans BRB80. </li><li> Aliquote (20 uL de volume) dans à 0,5 ml microtubes et conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ul> 2.) Solutions standard Ceux-ci sont préparés le jour même de l'expérience et doivent être jetés après l'expérience est terminée. Préparer 1 ml de chaque. 1. BRB80CS0.5 <ul><li> Diluer la solution de caséine dans BRB80 à une concentration finale de 0,5 mg / ml et de stocker plus de glace. Cette solution est introduite dans la cellule d'écoulement avant et permet de conserver la kinésine activité de kinésine, après l'adsorption en surface. </li></ul> 2. BRB80CA <ul><li> Préparer 0,2 mg / ml de caséine et 1 mM d'ATP dans BRB80 et de stocker plus de glace. Kinésine est encore diluée à l'aide de cette solution avant l'introduction dans la cellule d'écoulement. </li></ul> 3. BRB80T <ul><li> Diluer la solution taxol dans BRB80 à une concentration finale de 10 uM et conserver à température ambiante. Cette solution est utilisée pour stabiliser les microtubules. </li></ul>jove_step "&gt; 4. BRB80CT <ul><li> Préparer 10 uM de taxol et de 0,2 mg / ml de caséine dans BRB80 et stocker à température ambiante. Il est utilisé pour continuer à préparer le antifade et des solutions de microtubules. </li></ul> 5. BRB80AF <ul><li> Préparer 20 mM de D-glucose, 20 glucose oxydase pg / ml, 8 pg / ml de catalase, DTT 10 mM, et 20 uM d'ATP dans BRB80CT et stocker à température ambiante. Cette solution est utilisée pour diluer la streptavidine et des nanosphères et "laver" la streptavidine en excès dans la cellule d'écoulement. La vitesse de kinésine peut être contrôlée en ajustant la concentration d'ATP dans cette solution. </li></ul> 3). Préparation kinésine <ul><li> Exprimer une kinésine construire composé du type sauvage, pleine longueur de la chaîne Drosophila melanogaster kinésine lourd et un C-terminal His-tag dans Escherichia coli et purifier l'aide d'une colonne de Ni-NTA comme décrit en 6. </li><li> Assurez aliquotes (10 ul chacun) dans 0,5 ml microtubes et magasins à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. La concentration de la kinésine actif dans ces portions est d'environ 200 nM. 7 </li><li> Pour une expérience typique, diluer la solution kinésine 20 fois BRB80CA. Étiquetez le KIN20 solution et de stocker plus de glace. </li></ul> Préparation des microtubules 4.) <ul><li> Dans un tube à centrifuger de 0,5 mL, préparer 25 pi de solution de croissance: 4 mM de MgCl2, 1 mM de GTP et 5% de DMSO (v / v) dans un tampon BRB80. </li><li> Ajoutez 6,25 ul de cette solution à une aliquote de 20 ug de tubuline biotinylé lyophilisée. </li><li> Vortex, puis mettre dans un bain thermique à 37 ° C pendant 30 minutes à polymériser. Diluer 100 fois dans BRB80T et vortexer doucement. Étiquetez le MT100 solution et conserver à température ambiante. </li><li> Faire une dilution de 10 fois dans BRB80AF MT100. Étiquetez le MT1000 solution. </li></ul> 5.) Solution streptavidine et Nanosphère Préparer AlexaFluor568 la streptavidine marquée à une concentration de 100 nM dans BRB80AF. Étiqueter et stocker STV100 sur la glace. De même, diluer nanosphères 5000 fois en solution BRB80AF. Étiqueter NS5000 et de stocker plus de glace. 6.) Construction Cellule à circulation Construire une cuve à circulation à l'aide de deux lamelles de verre séparées par un adhésif double face. Cette cellule d'écoulement est d'environ 2 cm de long, 1 cm de large et 100 um de hauteur et a un volume d'environ 20 mL. Solutions sont introduites dans la cellule d'écoulement d'un côté à l'aide d'une pipette et sur méchant de l'autre à l'aide de papier filtre. 7.) Assemblée dosage inversé Surface de verre est d'abord revêtu avec de la caséine qui permet de conserver la kinésine sa fonctionnalité à adsorption. Après la kinésine est adsorbé, les microtubules sont introduites, qui sont détenus par la kinésine. Les microtubules sont ensuite revêtues de streptavidine fluorescente. Après lavage de la streptavidine excès, biotinylé polystyrène fluorescéine nanosphères (40 dia nmter) sont introduits. Surface adsorbés nanosphères fixes entrent en collision avec les microtubules en mouvement et se charger sur eux (figure 1). L'ordre du débit des solutions et des temps d'attente avant l'introduction de la solution suivante sont listés ci-dessous. <ul><li> BRB80CS0.5, 5 minutes </li><li> KIN20, 5 minutes </li><li> MT1000, 5 minutes </li><li> STV100, 5 minutes </li><li> BRB80AF, 3x </li><li> NS5000 </li></ul> 8.) Microscopie Montez la cellule d'écoulement sur la platine du microscope immédiatement après l'introduction de nanosphères. Dans cette expérience, une Eclipse TE2000-U microscope à fluorescence (Nikon, Melville, NY) équipé d'un objectif huile 100X (NA 1,45), un X-Cite 120 lampe (EXFO, Ontario, Canada) et un iXon EMCCD caméra (ANDOR, South Windsor, CT) a été utilisé. Un cube filtre FITC (# 48001) et un cube TRITC filtre (n ° 48002, Technologies Chroma, Rockingham, VT) ont été utilisés à des nanosphères d'image et microtubules respectivement sur la surface de fond de cellules d'écoulement. Le temps d'exposition est 0.2s, alors que le temps entre l'exposition est de 2 s. <img src="/files/ftp_upload/2006/2006fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Schéma des navettes moléculaires. </pclass></ul>

<ol><li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li>
<li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li>
<li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li>
<li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li>
<li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li>
<li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li>
<li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li>
<li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li>
<li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li>
</ol>

Avec des modifications mineures, ce protocole a été utilisé avec succès par une variété de groupes d&#39;assembler kinésine-microtubules tests de motilité base. 10 mM de DTT dans la solution finale motilité peut être remplacé par 0,5% β-mercaptoéthanol. Solutions standard (BRB80AF, KIN20 et MT1000) plus de 2 heures ne doit pas utilisé. Toute solution contenant du taxol microtubules et surtout ne doit jamais être placé sur la glace. Une exposition excessive de la cellule d&#39;écoulement aux UV des résultats de lumière d...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd"><html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en"><div><table border="1"><thead><tr><th> Nom du produit </th><th> Type </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commenter </th></tr></thead><tbody><tr><td> Adénosine-5&#39;-triphosphate (ATP) </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> A1049 </td><td></td><tr><td> Tubuline biotine </td><td></td><td> Cytosquelette Inc </td><td> T333 </td><td></td><tr><td> Caséine </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-0376 </td><td></td><tr><td> Catalase </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-9322 </td><td></td><tr><td> D-(+)-glucose </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-7528 </td><td></td><tr><td> Diméthylsulfoxyde (DMSO) </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-8779 </td><td> &amp;nbsp; </td><tr><td> Dithiotréitol (TNT) </td><td></td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0610 </td><td></td><tr><td> L&#39;acide N, N, N &#39;, N&#39;-tétraacétique (EGTA) - éthylène glycol-bis (2-aminoéthyléther) </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E-4378 </td><td></td><tr><td> FluoSpheres biotinylé microsphères, 40 nm, jaune-vert fluorescent (505/515) </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> F-8766 </td><td></td><tr><td> La glucose oxydase </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-7016 </td><td></td><tr><td> Guanosine-5&#39;-triphosphate (GTP) </td><td></td><td> Roche Diagnostic </td><td> 106399 </td><td></td><tr><td> Du chlorure de magnésium (MgCl 2) </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 63069 </td><td></td><tr><td> Le paclitaxel (Taxol) </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1912 </td><td></td><tr><td> 1,4-Piperazinediethanesulfonic acide pipérazine-1 ,4-bis (2-éthanesulfonique), Ppipérazine-N, N&#39;-bis (2-éthanesulfonique) (PIPES) </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-6757 </td><td></td><tr><td> L&#39;hydroxyde de potassium (KOH) </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-6310 </td><td></td><tr><td> L&#39;hydroxyde de sodium (NaOH) </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 480878 </td><td></td><tr><td> Streptavidine conjugué Alexa Fluor 568 </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> S11226 </td><td></td></tbody></table></div>

chargement du fret sur la kinésine powered navettes moléculaires

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Les cellules ont évolué sophistiqué machinerie moléculaire, tels que les protéines motrices kinésine microtubules et de filaments, pour soutenir le transport intracellulaire actif de la cargaison. Alors que kinésines queue domaine se lie à une variété de cargaisons, domaines kinésines tête d&#39;utiliser l&#39;énergie chimique stockée dans les molécules d&#39;ATP à l&#39;étape le long du réseau de microtubules. Les longs microtubules raides servir de pistes pour le transport longue distance intracellulaire. Ces moteurs et des filaments peut également être utilisé dans des environnements synthétiques microfabriqués en tant que composants de navettes moléculaires 1. Dans un motif fréquemment utilisés, les moteurs kinésine sont ancrées à la surface de la piste par le biais de leur queue, et microtubules fonctionnalisés servir éléments de transport de marchandise, qui sont propulsés par ces moteurs. Ces navettes peuvent être chargés de marchandises en utilisant la liaison forte et sélective entre la biotine et la streptavidine. Les composants clés (tubuline biotinylé, streptavidine et biotinylated fret) sont disponibles dans le commerce. En s&#39;appuyant sur ​​le test de motilité inversé classique 2, la construction de navettes moléculaires est détaillée ici. Kinésine protéines motrices sont adsorbés sur une surface préalablement enduite avec de la caséine; microtubules sont polymérisés à partir de tubuline biotinylé, adhéré à la kinésine et ensuite revêtus avec de la rhodamine-streptavidine marquée. La concentration d&#39;ATP est maintenue à une concentration subsaturating pour obtenir une vitesse de glissement des microtubules optimale pour le chargement 3. Enfin, biotinylé marqué à la fluorescéine nanosphères sont ajoutés en tant que cargaison. Nanosphères joindre aux microtubules du fait de collisions entre des microtubules de glisse et des nanosphères adhérant à la surface. Le protocole peut être facilement modifié pour charger une variété de marchandises telles que l&#39;ADN biotinylé 4, 5 ou points quantiques d&#39;une grande variété d&#39;antigènes au moyen d&#39;anticorps biotinylés 4-6.

Navettes moléculaires constitués de microtubules fonctionnalisés glissant sur la surface collée protéines motrices kinésine peut servir de système de transport nanométrique. Ici, le montage d&#39;un système de navette typique est décrit.

Chargement du fret sur la kinésine Powered navettes moléculaires

Les cellules ont développé une machinerie moléculaire sophistiquée, telle que les protéines motrices kinésines et les filaments de microtubules, pour assurer le transport intracellulaire actif...

L'objectif général de cette procédure est de fixer des nanosphères sur des microtubules qui glissent sur une surface recouverte de kinésine sous forme de moteurs. Cette étape est réalisée en premier lieu en recouvrant la surface d'une chambre à écoulement en verre avec une solution de caséine. La deuxième étape de la procédure consiste à absorber des protéines motrices de kinésine sur la surface de la chambre à écoulement.La troisième étape de la procédure consiste à ajouter les microtubules. La dernière étape de la procédure consiste à ajouter les molécules de strept haver, qui se lieront aux microtubules, puis à ajouter les nanosphères. Les nanosphères s'attachent à la surface de la chambre d'écoulement, où elles peuvent être capturées par les microtubules.En fin de compte, on peut observer comment les nanosphères sont captées par les microtubules et transportées à travers la surface à l'aide de la microscopie à fluorescence. Bonjour, je suis Elaine Jen Smith du laboratoire du Dr Henry Hess et du Département des sciences et génie des matériaux de l'Université de Floride. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour le test de mobilité inversé.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le chargement de cargaisons sur les microtubules et le déplacement des transporteurs moléculaires. Commençons donc. Avant le début de cette procédure, préparez fraîchement toutes les solutions mères comme décrit dans la partie écrite de cette vidéo.Une fois les solutions mères préparées, commencez la préparation des microtubules en pipetant 25 microlitres de solution de croissance dans un tube microcentrifuge de 0,65 millilitre. Ajoutez ensuite 6,25 microlitres de la solution de croissance à 20 microgrammes de tubuline biotinylée lyophilisée. Vortexez la solution et placez-la dans un bain thermostaté à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes afin de permettre la polymérisation. Après incubation, diluez la solution 100 fois dans du tampon Taxol et vortexez délicatement.Cette solution permet de stabiliser les microtubules. Étiquetez la solution comme étant vide 100 et conservez-la à température ambiante. Ensuite, préparez une dilution au dixième de MT 100 dans du tampon anti-fade et étiquetez cette solution comme MT 1000.Préparez ensuite les moteurs kinésine en diluant la solution de kinésine 20 fois dans un tampon TP. Étiquetez la solution comme « kinase 20 » et conservez-la sur de la glace. Enfin, préparez les solutions de streptavidine et de nanosphères.Tout d'abord, ajoutez de la streptavidine marquée Alexa Fluor 568 à une concentration de 100 nanomolaires dans du tampon Antifa. Étiquetez la solution STV 100, puis diluez les nanosphères 5 000 fois dans le tampon Antifa et étiquetez ce mélange NS 5 000. Conservez ces deux solutions sur de la glace.Après la préparation des solutions pour le test de chargement de la cargaison, construisez une cellule d'écoulement en utilisant une lame porteuse et une lamelle en verre séparées par du ruban adhésif double face. Fixez d'abord deux bandes de ruban adhésif double face sur les bords d'une lame porteuse, en laissant un espace d'environ un centimètre entre les bandes. Puis placez une lamelle par-dessus le ruban.Appliquez une pression sur la lame à couvrir en utilisant le bord plat d'une pince pour former un joint. La cellule d'écoulement construite mesure environ deux centimètres de long, un centimètre de large et 100 microns de haut, et possède un volume d'environ 20 microlitres. Pour commencer l'assemblage de l'essai inversé.Placer l'extrémité de la pipette entre la lame et la lamelle. Ensuite, injecter une solution de caséine à 0,5 milligramme par millilitre dans la cellule d'écoulement. Ce revêtement de la cellule d'écoulement permettra à la kinésine de conserver sa fonctionnalité après absorption.Attendre cinq minutes pour que la solution de caséine recouvre la surface. Ensuite, fixer la kinésine sur la chambre d'écoulement en introduisant la kinase dans une solution 20. Les solutions sont introduites dans les chambres d'écoulement en plaçant la pointe de la pipette entre la lame et la lamelle. La solution est alors injectée dans la chambre d'écoulement d'un côté, tout en étant simultanément évacuée par capillarité de l'autre côté.À l’aide d’un papier filtre, laissez cinq minutes pour permettre à la kinase d’absorber. Ensuite, introduisez les microtubules dans la chambre d’écoulement en pipetant la solution MT 1000 dans la chambre. Laissez cinq minutes pour que les microtubules se déposent et s’attachent aux moteurs de kinase après l’attachement des microtubules aux moteurs de kinase.Recouvrir les microtubules avec du strep TTR fluorescent en introduisant la solution STV 100 dans la chambre d'écoulement. Laisser cinq minutes pour que les molécules de strep TTR se lient aux microtubules. Éliminer l'excès de strep TTR par trois lavages de 30 microlitres de solution Antifa introduits dans la chambre d'écoulement.Enfin, introduisez les nanosphères de polystyrène biotinylées marquées par la fluorescéine en pipetant la solution NS 5 000 dans la cellule d'écoulement. La surface absorbe de manière stationnaire. Les nanosphères entreront en collision avec les microtubules en mouvement et s'y fixeront.Dans cette expérience, un microscope à fluorescence Eclipse TE 2000 U équipé d'un objectif à immersion huile de 100 x et de X site, d'une lampe 20 et d'une caméra Exon E-M-C-C-D est utilisé. Appliquez d'abord une goutte d'huile à immersion sur l'objectif. Ensuite, fixez la cellule d'écoulement sur la platine du microscope à l'aide du cube de filtres trixy.Mettez les microtubules au point, puis passez au cube de filtre fitzy pour observer les nanosphères. Ensuite, ouvrez le programme and or I exon et réglez le mode d'acquisition sur cinétique. Utilisez un temps d'exposition de 0,5 seconde, une durée de série cinétique de 20 et un temps de cycle cinétique de six secondes.Passer du microscope à l’oculaire à la caméra et commencer à acquérir des images. Pour les quatre premières images, utiliser le cube trixi pour imager les microtubules. Pour les 12 images suivantes, passer au cube de filtre Fitz afin d’acquérir des images des nanosphères.Ensuite, revenir au cube de filtres trixi. Pour les quatre dernières images permettant d'observer les microtubules, ces derniers sont visualisés à l'aide du cube de filtres Trissy ; le cube de filtres est alors basculé vers fite. Pour visualiser les nanosphères ici, les nanosphères transportées par les microtubules sont indiquées par des flèches. Toutes les nanosphères n'ont pas été captées par les microtubules.La position des nanosphères est maintenant montrée 36 secondes plus tard, révélant que celles-ci se sont déplacées. Lorsque les microtubules sont à nouveau imagés, il devient évident qu'ils se sont également déplacés à travers le champ de vision. Ces images démontrent que les nanosphères ont été déplacées en raison du transport par les microtubules.Nous venons de vous montrer comment réaliser le test de mobilité inversé. Lors de cette procédure, il est important de penser à changer les cubes de filtres pendant l'acquisition des images afin de visualiser à la fois les microtubules et les nanosphères. Voilà, c'est terminé.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Microscopie à molécule unique Approche fourni de nouvelles connaissances sur le transport nucléaire.

Molécules simples à l&#39;imagerie du transport nucléaire

Le transport intracellulaire des cargaisons, telles que les vésicules ou les organites, est effectué par des protéines motrices moléculaires qui suivent les microtubules polarisés. Ce protocole décrit la corrélation entre la directionnalité du transport des particules de cargaison individuelles se déplaçant à l’intérieur des neurones et la quantité relative et le type de protéines motrices associées.

Caractériser la composition de moteurs moléculaires sur les moyens axonale Cargo Utilisation de l&#39;analyse &quot;Cargo Mapping&quot;

Ici, un protocole est présenté pour identifier Kinesin-1 cargaisons. Un mutant sans moteur du Kinesin-1 chaîne lourde (KIF5B) agrège dans le cytoplasme et induit une agrégation de ses cargaisons. Les deux granulats sont détectés au microscope à fluorescence. Une stratégie similaire peut être utilisée pour identifier d'autres protéines cargos à moteur.

Identification des Kinesin-1 Cargos utilisant microscopie à fluorescence

Nous présentons un protocole pour construire des navettes moléculaires, où les protéines motrices kinésine adhère à la surface de propulsent marqué au colorant de microtubules. Les interactions faibles des kinésines avec la surface permet leur fixation réversible pour elle. Cela crée un système d’échelle nanométrique qui présente l’assembly dynamique et le démontage de ses composants tout en conservant sa fonctionnalité.

Assemblage des navettes moléculaires propulsés par réversiblement attaché kinésines

L'objectif de ce protocole est de former des ensembles de moteurs moléculaires sur les nanostructures d'origami d'ADN et d'observer la motilité d'ensemble en utilisant la microscopie interne totale de fluorescence de réflexion.

Production d'ensembles moteurs d'adn et de kinésine sur des nanostructures d'origami d'ADN pour l'observation d'une seule molécule

La kinésine mitotique bidirectionnelle-5 Cin8 s’accumule en grappes qui se divisent et fusionnent au cours de leur motilité. L’accumulation en amas modifie également la vitesse et la directionnalité de Cin8. Ici, un protocole pour les tests de motilité avec Cin8-GFP purifié et l’analyse des propriétés mobiles de molécules uniques et de grappes de Cin8 est décrit.

Motilité de molécules uniques et d’amas de kinésine-5 Cin8 bidirectionnelle purifiée à partir de cellules de S. cerevisiae

Cette étude détaille la purification de KIF1A (1-393LZ), un membre de la famille des kinésines-3, à l’aide du système d’expression du baculovirus Sf9. L’analyse in vitro de glissement monomoléculaire et multimoteur de ces moteurs purifiés a montré des propriétés de motilité robustes comparables à celles des moteurs du lysat de cellules de mammifères. Ainsi, le système Sf9-baculovirus est susceptible d’exprimer et de purifier la protéine motrice d’intérêt.

Analyse à molécule unique de moteurs de la famille Sf9 superprocessive kinésine-3 purifiée

Un nouveau système in vitro pour charger simultanément quatre tendons dans la culture est décrite.

Ex vivo Chargement mécanique du tendon

Le calcium est un messager omniprésent dans le système nerveux, indispensable pour déclencher la libération des neurotransmetteurs et des changements dans la force synaptique. Ici nous démontrons une technique pour le chargement de Ca 2 +-indicateurs dans les terminaisons nerveuses chez la drosophile. Nous démontrons également la fabrication de l'appareillage nécessaire et de souligner les points critiques pour le succès de la technique.

Terminaux de chargement nerveuse chez la drosophile avec des indicateurs de calcium

Nous rapportons ici la génération de Tre recombinase travers dirigé, l'évolution moléculaire. Tre recombinase reconnaît une séquence cible pré-définie dans les séquences LTR du provirus VIH-1, résultant en l'excision et l'éradication du provirus de cellules humaines infectées. Alors qu'il était encore à ses balbutiements, l'évolution moléculaire dirigée va permettre la création d'enzymes personnalisées qui serviront d'outils moléculaires de la chirurgie et la médecine moléculaire.

Molecular Evolution de la recombinase Tre

Découvrez l'assemblage d'un système de navettes moléculaires utilisant des microtubules fonctionnalisés glissant sur des protéines motrices kinesine. Cette méthode permet le chargement de nanosphères pour des applications de transport à l'échelle nanométrique.

Chargement du fret sur la kinésine Powered navettes moléculaires

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