Name: Léchelle du génome Analyse des aminoacylation (recharge) Niveaux dARNt utilisant des microarrays (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse des niveaux d'aminoacylation de l'ARNt chez Saccharomyces cerevisiae par microarray. Cette approche permet d'étudier les réponses cellulaires au stress.

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Le travail de la levure dans le laboratoire de Pan a été financé par une subvention de Ajinomoto, Inc au Japon et National Institutes of Health Training Grant T32GM007183-33. Nous remercions le Dr Ronald Wek à l&#39;École de médecine de l&#39;Université d&#39;Indiana pour la collaboration à long terme sur les projets de la levure. Nous remercions également le Dr Kimberly Dittmar pour développer l&#39;ARNt méthode de recharge de biopuces.

Partie 1: Isolement des ARNt chargés au total <ol><li> Pellet cellules dans une centrifugeuse de table à 2000 RFC pendant 5 minutes. L&#39;équivalent d&#39;une DO 600 de cellules devraient produire au moins 1 pg d&#39;ARN total et un minimum de 30 ug est recommandé pour la procédure. </li><li> Resuspendre les cellules dans une solution tampon de lyse composée de 0,3 M tamponné Na +-acétate (pH 4,5) et EDTA 10 mM. Vortex avec un volume égal de Na +-saturée d&#39;acétate de phénol / chloroforme (pH 4,5) à trois reprises pour chacun des 30 s. Soyez sûr de toujours garder des échantillons sur la glace entre les vortex. D&#39;acétate tamponné peuvent être préparés à partir de NaOAc et HOAc alors saturée d&#39;acétate de phénol / chloroforme peut être préparée en mélangeant 1 partie d&#39;acétate de 5 M tamponné (pH 4,5) avec 9 parties de phénol / chloroforme. Note: Le total isolement d&#39;ARN est réalisée dans des conditions légèrement acides et sur la glace pour éviter désacylation des ARNt chargés. </li><li> Centrifuger à 18600 RFC pendant 15 minutes à 4 ° C. Retirez la couche aqueuse et effectuer une autre extraction saturée d&#39;acétate de phénol / chloroforme. </li><li> Après la deuxième extraction précipiter l&#39;ARN en ajoutant des volumes 2.7x de l&#39;éthanol et centrifugation à 18 600 RFC pendant 30 minutes à 4 ° C. </li><li> Resuspendre culots d&#39;ARN en solution tampon de lyse puis précipité avec l&#39;éthanol une seconde fois. </li><li> Enfin, remettre en suspension les ARN dans une solution contenant 10 mM d&#39;acétate tamponné (pH 4,5) et EDTA 1 mM pour le traitement ultérieur. L&#39;échantillon peut être stocké de manière stable à -80 ° C pendant environ deux semaines. Un stockage prolongé n&#39;est pas recommandé car certains ARNt chargés vont commencer à deacylate. </li></ol> Partie 2: Préparation des étalons ARNt <ol><li> Chauffer E. coli normes ARNt à 10,5 uM à 85 ° C dans 45 mM de Tris-Cl pH 7,5 pendant 2 minutes. Prenez le tube et laisser à température ambiante pendant 3 minutes. </li><li> Ajouter MgCl 2 à une concentration finale de 20 mM et incuber à 37 ° C pendant 5 minutes. </li><li> Ajouter le mélange réactionnel synthétase sorte la réaction finale contient 5 uM, ARNt 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 12,5 mM de MgCl2, 10 mM de KCl, 3 mM de dithiothréitol, 1,5 mM d&#39;ATP, 1 mM de spermine, 1 mM de l&#39;respectifs acides aminés, et de 4,2 unités / ul E. mélangez synthétase coli aminoacyl-ARNt. Incuber à 37 ° C pendant 15 minutes. </li><li> Ajouter un volume égal de 0,5 M d&#39;acétate tamponné (pH 4,5) et l&#39;extrait avec de l&#39;acétate de phénol saturé / CHCl 3 à pH 4,5. </li><li> Précipiter les normes ARNt avec des volumes d&#39;éthanol et 2,7 x centrifugation à 18600 RFC pendant 30 minutes à 4 ° C. </li><li> Resuspendre les normes dans 50 mM d&#39;acétate tamponné (pH 4,5) avec 1 mM d&#39;EDTA et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à un mois. </li></ol> Partie 3: Cy3/Cy5 étiquetage des ARNt <ol><li> Pour l&#39;échantillon ARNt chargés incuber l&#39;ARN total à une concentration de 0,1 pg / pl avec 0,066 uM de chaque E. coli normes ARNt (c&#39;est à dire 0,67 pmoles de chaque norme par ug d&#39;ARN totaux) et 100 mM d&#39;acétate tamponné (pH 4,5), en présence de 50 mM NaIO4 pendant 30 minutes à température ambiante. Pour le contrôle total de l&#39;utilisation de l&#39;échantillon ARNt 50 mM de NaCl à la place de NaIO4. N&#39;oubliez pas de diluer l&#39;ARN uniquement avec des solutions tamponnées à préserver la charge. </li><li> Pour arrêter la réaction ajouter du glucose à 100 mm et incuber à température ambiante pendant 5 minutes. </li><li> Afin de supprimer tout NaIO4 reste de l&#39;échantillon effectuer un échange de tampon en utilisant une colonne spin G25. Pour de meilleurs résultats s&#39;équilibrent la première colonne en exécutant 200 mM de tampon acétate tamponné (pH 4,5) à travers elle avant d&#39;appliquer votre échantillon. </li><li> Précipiter l&#39;échantillon par addition d&#39;acétate tamponné (pH 4,5) à une concentration finale de 133 mM de NaCl et à une concentration finale de 66 mM et 2,7 x le volume d&#39;éthanol. Occasionnellement, une deuxième précipitation peut être nécessaire pour les échantillons oxydés. Cela est nécessaire seulement si le culot ressemble sensiblement différente de celle du culot de contrôle du même échantillon. Par exemple, une beaucoup plus grande ou plus diffus à granulés. Si une seconde précipitation à l&#39;éthanol est nécessaire Resuspendre le culot dans 50 mM d&#39;acétate de tampon pH 4,5 et 200 mM de NaCl, avant l&#39;addition d&#39;éthanol. </li><li> Pour les échantillons désacylation ARNt sont remis en suspension dans 50 mM Tris-HCl (pH 9) et incubées à 37 ° C pendant 30 min. La réaction est neutralisée par l&#39;addition d&#39;un volume égal de 50 mM d&#39;acétate tamponné (pH 4,5) et NaCl 100 mM. Précipiter avec des volumes d&#39;éthanol 2.7x. Après la précipitation, l&#39;ARN est remis en suspension dans l&#39;eau à ~ 1 ug / ul. Tant le contrôle et les échantillons oxydés doit être exécuté sur des gels d&#39;agarose pour vérifier la qualité de l&#39;ARN. </li><li> Pour fixer les balises oligo fluorescent sur l&#39;ARNt 0,1 pg / pl désacylé ARN est incubé dans 1x tampon ligase, 15% de DMSO, 4 uM Cy3 ou Cy5 contenant des oligonucléotides, 0,5 unités / ul ADN ligase de T4, et la levure exo-phosphatase (5000 unités / ul) à 16 ° C pendant la nuit (plus de 16 h). L&#39;exo-phosphatase est nécessaire seulement pour les échantillons obtenus à partir de la levure et peut être omitteD Si ce protocole est utilisé pour E. coli ou d&#39;échantillons humains. </li><li> Après la ligature des échantillons sont mélangés avec 4 volumes de 50 mM KOAc (pH 7), 200 mM de KCl, puis extraite avec un volume égal de phénol / chloroforme. Après extraction de la phase aqueuse, des préparations d&#39;ARN sont précipités à l&#39;éthanol et resuspendu dans de l&#39;eau à environ 0,1 pg / pl. </li><li> Ligature d&#39;efficacité peut être évaluée en exécutant 5-10% des échantillons sur gels de polyacrylamide 12% contenant de l&#39;urée 7M et visualisées avec un scanner de gel fluorescent. Cette analyse PAGE est également utile pour déterminer le montant des échantillons oxydés et de contrôle nécessaires pour l&#39;hybridation de biopuces. Un résultat ligature doit montrer une bonne ~ 10% ou plus de l&#39;oligonucléotide contenant Cy3/Cy5 être ligaturé à l&#39;ARNt. Pour les échantillons dont l&#39;efficacité en matière d&#39;étiquetage, 0,1 à 0.5 mg d&#39;ARN total par échantillon est utilisé pour l&#39;hybridation tableau. </li></ol> Partie 4: Hybridation et analyse des biopuces <ol><li> Avant de diapositives puces d&#39;hybridation sont cuites à l&#39;eau distillée pendant 1-2 minutes pour enlever les oligonucléotides non consolidés. </li><li> Cy3/Cy5 échantillons étiquetés sont combinés avec 140 ul de tampon d&#39;hybridation et de l&#39;ADN de sperme de saumon à une concentration finale de 140 pg / ml et de poly (A) à une concentration finale de 70 pg / ml. </li><li> Un programme d&#39;hybridation, (tableau 1), est exécuté sur une large hybrideur automatique. Pour les travaux d&#39;ARNt, il est fortement recommandé que l&#39;hybridation d&#39;une machine automatique être utilisée car l&#39;hybridation manuelle produit de fond élevé. </li><li> Après que le programme est terminé manuellement laver les lames avec une solution 3 Laver au moins deux fois en agitant dans un tube conique de 50 ml pendant 3-5 minutes. </li><li> Les diapositives peuvent être séchées par centrifugation à basse vitesse, moins de 200 RFC, pendant 5-10 minutes. Il est important de garder la glisse hors de la lumière depuis l&#39;exposition à la lumière va blanchir les fluorophores. </li><li> Après les lames sont sèches, elles doivent être scannés immédiatement pour des résultats optimaux, si nécessaire, ils peuvent être sauvegardées pour plusieurs jours dans un endroit sec, sombre à la température ambiante. Les diapositives peuvent être scannées 2-3 fois sans dégradation notable de la qualité d&#39;image. </li></ol> Partie 5: Résultats Représentant Lorsqu&#39;elle est isolée correctement l&#39;échantillon d&#39;ARN totaux devraient produire un spectre très propre avec une 260 OD: DO 280 ratio de près de 2. Il devrait y avoir aucune protéine détectable ou de contamination de phénol. Lorsqu&#39;il est exécuté sur 1% des gels d&#39;agarose, une forte bande ARNt doivent être observées avec d&#39;autres groupes possibles acide nucléique variant entre organismes. Après l&#39;oxydation d&#39;une bande propre ARNt doit être observé. Si un échantillon est sensiblement plus faible que d&#39;autres échantillons ou des traînées est observé, les échantillons ne doivent pas être utilisés pour les microarrays. Microarrays devrait avoir de fond très bas, qui est un ordre de grandeur plus faible que les plus faibles de sonde ARNt. Bruit de fond élevé est généralement dû à des problèmes lors des étapes de lavage. Ceci peut habituellement être fixé par la préparation de solutions de lavage fraîche et bien laver tous les équipements et les tubes pour éliminer les résidus et les SDS précipité. <table border="1"><tbody><tr><td> Étape </td><td> Détails </td></tr><tr><td> Torique de conditionnement </td><td> 75 ° C, 2 min </td></tr><tr><td> Présentez l&#39;échantillon </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> Exemple Dénaturer </td><td> 90 ° C, 5 min </td></tr><tr><td> Hybridation </td><td> 60 ° C, 16h </td></tr><tr><td> Lavez 1 </td><td> 50 ° C, 10s 20s flux de maintenir </td></tr><tr><td> Lavez 2 </td><td> 42 ° C, 10s 20s flux de maintenir </td></tr><tr><td> Lavez 3 </td><td> 42 ° C, 10s 20s flux de maintenir </td></tr></tbody></table> Tableau 1: protocole d&#39;hybridation

<ol><li>Zaborske, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li>
<li>Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histidyl-tRNA+synthetase-related+sequence+in+the+eIF-2+alpha+protein+kinase+GCN2+interacts+with+tRNA+and+is+required+for+activation+in+response+to+starvation+for+different+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids.</a> Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).</li>
<li>Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Regulation+of+GCN4+and+the+General+Amino+Acid+Control+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast.</a> Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).</li>
<li>Braeken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+horizons+for+%28p%29ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li>
<li>Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncharged+tRNA+Activates+GCN2+by+Displacing+the+Protein+Kinase+Moiety+from+a+Bipartite+tRNA-Binding+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain.</a> Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).</li>
<li>Cashel, M. The Stringent Response. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCashel%2C+M+%22Escherichia+coli+and+Salmonella%3A+cellular+and+molecular+biology%22">Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology</a>. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).</li>
<li>Dittmar, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+tRNA+abundance+and+alteration+of+tRNA+charging+by+bortezomib+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).</li>
</ol>

Nous présentons une méthode pour déterminer simultanément les niveaux relatifs de chargement de tous les ARNt à l&#39;échelle génomique. Le protocole présenté ici a été optimisé pour S. cerevisiae, et il a aussi été utilisée avec succès pour mesurer les profils de charge ARNt dans E. coli et de cultures de cellules humaines. Il peut être modifié pour accommoder tout organisme avec des séquences du génome connu (permettant l&#39;annotation de tous les gènes d&#39;ARNt) tant que le total ARNt chargés peuvent être obtenues.

<table><tbody><tr><td>Colonnes Microspin G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>25-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; ARNt&lt;sup&gt;Phe&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3143</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; ARNt&lt;sup&gt;Tyr&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0258</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; ARNt&lt;sup&gt;Lys&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6018</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; aminoacyl-ARNt synthétases</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3646</td><td></td></tr><tr><td>Ligase T4 de l'ADN</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>70042X</td><td></td></tr><tr><td>PerfectHyb Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-7033</td><td></td></tr><tr><td>Station Hyb4</td><td>Digilab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanner GenePix 4000B</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenePix 6.0</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;échelle du génome analyse des aminoacylation (recharge) niveaux d&#39;arnt utilisant des microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

aminoacylation d&#39;ARNt, ou de chargement, les niveaux peuvent changer rapidement dans une cellule en réponse à l&#39;environnement [1]. Les changements dans les niveaux de charge ARNt dans les cellules procaryotes et eucaryotes conduire à une réglementation translationnelle qui est un mécanisme cellulaire majeur de la réponse au stress. Exemples familiers sont la réponse strictes<em&gt; E. coli</em&gt; Et la voie GCN2 réponse au stress chez la levure ([2-6]). Des travaux récents dans<em&gt; E. coli</em&gt; Et<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Ont montré que les modèles ARNt chargement sont très dynamiques et dépend du type de stress vécu par les cellules [1, 6, 7]. La très dynamique, la nature variable des ARNt chargement, il est essentiel de déterminer les changements dans les niveaux de charge ARNt à l&#39;échelle génomique, afin d&#39;élucider totalement la réponse cellulaire aux variations environnementales. Dans cette revue, nous présentons une méthode pour mesurer simultanément le niveau relatif de chargement de tous les ARNt dans les<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;. Alors que le protocole présenté ici est pour la levure, ce protocole a été appliqué avec succès pour déterminer les niveaux relatifs de charge dans une grande variété d&#39;organismes, y compris<em&gt; E. coli</em&gt; Et cultures de cellules humaines [7, 8].

Nous décrivons une méthode pour l&#39;analyse des microréseaux pour déterminer les niveaux relatifs de tous aminoacylation ARNt partir<em&gt; S. cerivisiae.</em

L&#39;échelle du génome Analyse des aminoacylation (recharge) Niveaux d&#39;ARNt utilisant des microarrays

Les niveaux d'aminoacylation, ou de chargement, des ARNt peuvent changer rapidement au sein d'une cellule en réponse à l'environnement[1]. Des modifications des niveaux de chargement des ARNt, tant dans...

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer les variations relatives des niveaux de chargement des ARNt. Cette détermination est réalisée en isolant l'ARN à un pH bas avant et après traitement, afin d'obtenir des ARNt dont les niveaux de chargement sont intacts. Dans une deuxième étape, l'ARN est soumis à un traitement d'oxydation par l'iodate, qui permet de mesurer les niveaux de chargement relatifs.Ensuite, liger les échantillons à un oligonucléotide fluorescent et les hybridiser sur une puces à ADN afin de mesurer les variations des niveaux de ligation dues à la chargement en ARNt ; les résultats sont obtenus. Les modifications au niveau génomique de CHO dans le chargement des ARNt sont basées sur la technologie des puces à ARNt. Bonjour, je suis John Zai du laboratoire de DRT Pan du département de biochimie et biologie moléculaire de l'Université de Chicago.Aujourd'hui, je vais vous montrer une procédure permettant d'isoler et de mesurer le taux de chargement des ARNt au niveau génomique. Nous utilisons cette méthode pour mesurer les variations du chargement des ARNt pendant les stress appliqués dans notre laboratoire. Commençons donc.Pour isoler la charge totale en ARNt, commencez par cultiver un minimum l'équivalent de 30 OD 600 de cellules de levure, ce qui devrait produire 30 microgrammes d'ARN total. Pelletez les cellules dans une centrifugeuse de table. Resuspendez les cellules dans une solution tampon de lyse. Ajoutez un volume égal d'acétate de sodium, de phényl chloroforme saturé et vortexez pendant 30 secondes, puis placez sur glace pendant au moins 30 secondes.Répétez le vortexage et le hachage deux fois supplémentaires. Centrifugez l'échantillon à 18 600 RFC pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, retirez la couche aqueuse et effectuez une autre extraction au phényl chloroforme saturé d'acétate après la deuxième extraction.Précipitez l'ARN en ajoutant 2,7 volumes d'éthanol et en centrifugeant à 18 600 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Resuspendez les culots d'ARN dans une solution tampon de lyse, puis précipitez à nouveau à l'aide d'éthanol. Enfin, resuspendez l'ARN dans une solution contenant 10 millimolaire d'acétate tamponné et 1 millimolaire d'EDTA pour un traitement ultérieur.L'échantillon peut être conservé de manière stable à moins 80 degrés Celsius pendant environ deux semaines supplémentaires. Le stockage n'est pas recommandé, car certains ARNt chargés commenceront à se décharger avant l'étiquetage avec les sondes oligonucléotidiques fluorescentes S3 ou SCI5. L'ARNt total est soumis à un traitement d'oxydation en une journée, ce qui permet de déterminer les niveaux relatifs de chargement. Mélanger l'ARN total avec 0,066 micromolaire de chaque étalon d'ecoiRNA et 100 millimolaire d'acétate tamponné, en présence de 50 millimolaire de parahydroxybenzoate de sodium. Pour l'échantillon d'ARNt témoin qui ne sera pas oxydé, utiliser 50 millimolaire de chlorure de sodium à la place du parahydroxybenzoate de sodium.Incuber les réactions pendant 30 minutes à température ambiante ; après 30 minutes, arrêter la réaction en ajoutant du glucose à une concentration finale de 100 millimolaire et en incubant à température ambiante pendant cinq minutes. Une fois la réaction arrêtée, effectuer un échange de tampon à l’aide d’une colonne G 25 par centrifugation pour éliminer tout le sodium proraté restant des échantillons. Précipiter les échantillons en ajoutant de l’acétate tamponné à une concentration finale de 133 millimolaire de chlorure de sodium à une concentration finale de 66 millimolaire et 2,7 volumes d’éthanol.Ensuite, isolez les échantillons d'ARNt par Resus, en les mettant en suspension dans du Tris-HCl 50 millimolaire et en incubant à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes, neutralisez la réaction en ajoutant un volume égal d'acétate tamponné 50 millimolaire et de chlorure de sodium 100 millimolaire, puis précipitez avec 2,7 volumes d'éthanol. Remettez en suspension le culot d'ARN dans de l'eau à environ un microgramme par microlitre.Une fois que les échantillons témoins et oxydés ont été vérifiés quant à la qualité de l'ARN en les faisant migrer sur des gels d'agarose, nous pouvons procéder au marquage fluorescent afin d'attacher des étiquettes oligonucléotidiques fluorescentes sur l'ARNt. Mélangez 0,1 microgramme par microlitre d'ARN avec des oligonucléotides contenant le tampon de ligase SI3 ou SI5 à 4 micromolaire, 15 % de DMSO, 0,5 unité par microlitre de ligase ADN T4 et de phosphatase d'exo levure, puis incubez à 16 degrés Celsius pendant plus de 16 heures. Après la ligature, mélangez les échantillons avec quatre volumes d'acétate de potassium et de chlorure de potassium, puis extrayez-les avec un volume égal de phényl chloroforme. Après extraction de la phase aqueuse, précipitez les préparations d'ARN à l'éthanol. Enfin, reconstituez les culots d'ARN dans de l'eau à environ 0,1 microgramme par microlitre avant l'hybridation. Immergez les lames de puces à ADN et de l'eau distillée pendant une à deux minutes afin d'éliminer les oligonucléotides non liés.Ensuite, combiner les cinq échantillons marqués S3 ou SCI avec 140 microlitres de tampon d'hybridation contenant de l'ADN de sperme de saumon à une concentration finale de 140 microgrammes par millilitre et de poly A à une concentration finale de sept microgrammes par millilitre, puis lancer un programme d'hybridation sur un hybrideur de puces automatique. Nous recommandons fortement l'utilisation d'une machine d'hybridation automatique pour les travaux sur l'ARNt, car l'hybridation manuelle produit un fond élevé. Une fois le programme d'hybridation terminé, laver manuellement les lames avec la solution de lavage 3 en agitant doucement dans un tube conique de 50 millilitres pendant trois à cinq minutes.Lavez les lames au moins deux fois dans des tubes préalablement enveloppés de papier d'aluminium. Séchez les lames par centrifugation à faible vitesse pendant cinq à dix minutes pour des résultats optimaux. Les lames doivent être analysées immédiatement après leur séchage.Les lames peuvent être numérisées deux à trois fois sans dégradation notable de la qualité d'image. Des résultats représentatifs d'un échantillon d'ARN total correctement isolé et de son analyse sont présentés ici. Cet échantillon présente un spectre très propre avec un rapport OD260/OD280 proche de 2, sans contamination détectable par des protéines ou du phénol lorsqu'il est analysé sur des gels d'agarose à 1 %. Les échantillons oxydés et les échantillons témoins doivent tous deux présenter une bande d'ARN intense, les autres bandes d'acides nucléiques pouvant varier selon les organismes.Si un échantillon est nettement plus faible que les autres échantillons, ou si un smearing est observé, les échantillons ne doivent pas être utilisés pour les puces à ADN. Les puces à ADN doivent présenter un fond très faible, inférieur d'un ordre de grandeur à celui de la sonde d'ARNt la plus faible. Je viens de vous montrer comment isoler et déterminer les niveaux de chargement relatifs de l'ARNt lors de la réalisation de cette procédure.Il est important de se rappeler de maintenir vos réactifs exempts de nucléases, en particulier durant les étapes d'oxydation et de dilatation. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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Analyse en temps réel du facteur de Transcription Binding, Transcription, traduction et chiffre d’affaires pour afficher des événements mondiaux au cours de l’Activation cellulaire

Nous décrivons une plateforme d’analyse ARN de transfert original nommée SPOt (plateforme simplifiée pour l’observation des ARNt). SPOt mesure simultanément les concentrations cellulaires de tous les ARNt dans des échantillons biologiques, en seulement trois étapes et en moins de 24 heures.

Marquage métabolique et profilage des ARN de transfert à l’aide de macroréseaux

Nous décrivons ici un protocole pour la caractérisation biochimique de l’enzyme de RNA-modification de la levure, Mod5 et discuter de comment ce protocole pourrait être appliqué à d’autres enzymes de modification des RNA.

Un test In Vitro pour détecter l’activité ARNt-isopentényl transférase

Le séquençage de l’ARN par quantification absolue (AQRNA-seq) est une technologie développée pour quantifier le paysage de tous les petits ARN dans les mélanges biologiques. Ici, les étapes de préparation de la bibliothèque et de traitement des données d’AQRNA-seq sont démontrées, quantifiant les changements dans le pool d’ARN de transfert (ARNt) chez Mycobacterium bovis BCG pendant la dormance induite par la famine.

AQRNA-seq pour la quantification de petits ARN

Découvrez une méthode d'analyse des niveaux d'aminoacylation de l'ARNt chez Saccharomyces cerevisiae par microarray. Cette approche permet d'étudier les réponses cellulaires au stress.

L'échelle du génome Analyse des aminoacylation (recharge) Niveaux d'ARNt utilisant des microarrays

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