L'échelle du génome Analyse des aminoacylation (recharge) Niveaux d'ARNt utilisant des microarrays

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer les variations relatives des niveaux de chargement des ARNt. Cette détermination est réalisée en isolant l'ARN à un pH bas avant et après traitement, afin d'obtenir des ARNt dont les niveaux de chargement sont intacts. Dans une deuxième étape, l'ARN est soumis à un traitement d'oxydation par l'iodate, qui permet de mesurer les niveaux de chargement relatifs.

Ensuite, liger les échantillons à un oligonucléotide fluorescent et les hybridiser sur une puces à ADN afin de mesurer les variations des niveaux de ligation dues à la chargement en ARNt ; les résultats sont obtenus. Les modifications au niveau génomique de CHO dans le chargement des ARNt sont basées sur la technologie des puces à ARNt. Bonjour, je suis John Zai du laboratoire de DRT Pan du département de biochimie et biologie moléculaire de l'Université de Chicago.

Aujourd'hui, je vais vous montrer une procédure permettant d'isoler et de mesurer le taux de chargement des ARNt au niveau génomique. Nous utilisons cette méthode pour mesurer les variations du chargement des ARNt pendant les stress appliqués dans notre laboratoire. Commençons donc.

Pour isoler la charge totale en ARNt, commencez par cultiver un minimum l'équivalent de 30 OD 600 de cellules de levure, ce qui devrait produire 30 microgrammes d'ARN total. Pelletez les cellules dans une centrifugeuse de table. Resuspendez les cellules dans une solution tampon de lyse. Ajoutez un volume égal d'acétate de sodium, de phényl chloroforme saturé et vortexez pendant 30 secondes, puis placez sur glace pendant au moins 30 secondes.

Répétez le vortexage et le hachage deux fois supplémentaires. Centrifugez l'échantillon à 18 600 RFC pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, retirez la couche aqueuse et effectuez une autre extraction au phényl chloroforme saturé d'acétate après la deuxième extraction.

Précipitez l'ARN en ajoutant 2,7 volumes d'éthanol et en centrifugeant à 18 600 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Resuspendez les culots d'ARN dans une solution tampon de lyse, puis précipitez à nouveau à l'aide d'éthanol. Enfin, resuspendez l'ARN dans une solution contenant 10 millimolaire d'acétate tamponné et 1 millimolaire d'EDTA pour un traitement ultérieur.

L'échantillon peut être conservé de manière stable à moins 80 degrés Celsius pendant environ deux semaines supplémentaires. Le stockage n'est pas recommandé, car certains ARNt chargés commenceront à se décharger avant l'étiquetage avec les sondes oligonucléotidiques fluorescentes S3 ou SCI5. L'ARNt total est soumis à un traitement d'oxydation en une journée, ce qui permet de déterminer les niveaux relatifs de chargement. Mélanger l'ARN total avec 0,066 micromolaire de chaque étalon d'ecoiRNA et 100 millimolaire d'acétate tamponné, en présence de 50 millimolaire de parahydroxybenzoate de sodium. Pour l'échantillon d'ARNt témoin qui ne sera pas oxydé, utiliser 50 millimolaire de chlorure de sodium à la place du parahydroxybenzoate de sodium.

Incuber les réactions pendant 30 minutes à température ambiante ; après 30 minutes, arrêter la réaction en ajoutant du glucose à une concentration finale de 100 millimolaire et en incubant à température ambiante pendant cinq minutes. Une fois la réaction arrêtée, effectuer un échange de tampon à l’aide d’une colonne G 25 par centrifugation pour éliminer tout le sodium proraté restant des échantillons. Précipiter les échantillons en ajoutant de l’acétate tamponné à une concentration finale de 133 millimolaire de chlorure de sodium à une concentration finale de 66 millimolaire et 2,7 volumes d’éthanol.

Ensuite, isolez les échantillons d'ARNt par Resus, en les mettant en suspension dans du Tris-HCl 50 millimolaire et en incubant à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes, neutralisez la réaction en ajoutant un volume égal d'acétate tamponné 50 millimolaire et de chlorure de sodium 100 millimolaire, puis précipitez avec 2,7 volumes d'éthanol. Remettez en suspension le culot d'ARN dans de l'eau à environ un microgramme par microlitre.

Une fois que les échantillons témoins et oxydés ont été vérifiés quant à la qualité de l'ARN en les faisant migrer sur des gels d'agarose, nous pouvons procéder au marquage fluorescent afin d'attacher des étiquettes oligonucléotidiques fluorescentes sur l'ARNt. Mélangez 0,1 microgramme par microlitre d'ARN avec des oligonucléotides contenant le tampon de ligase SI3 ou SI5 à 4 micromolaire, 15 % de DMSO, 0,5 unité par microlitre de ligase ADN T4 et de phosphatase d'exo levure, puis incubez à 16 degrés Celsius pendant plus de 16 heures. Après la ligature, mélangez les échantillons avec quatre volumes d'acétate de potassium et de chlorure de potassium, puis extrayez-les avec un volume égal de phényl chloroforme. Après extraction de la phase aqueuse, précipitez les préparations d'ARN à l'éthanol. Enfin, reconstituez les culots d'ARN dans de l'eau à environ 0,1 microgramme par microlitre avant l'hybridation. Immergez les lames de puces à ADN et de l'eau distillée pendant une à deux minutes afin d'éliminer les oligonucléotides non liés.

Ensuite, combiner les cinq échantillons marqués S3 ou SCI avec 140 microlitres de tampon d'hybridation contenant de l'ADN de sperme de saumon à une concentration finale de 140 microgrammes par millilitre et de poly A à une concentration finale de sept microgrammes par millilitre, puis lancer un programme d'hybridation sur un hybrideur de puces automatique. Nous recommandons fortement l'utilisation d'une machine d'hybridation automatique pour les travaux sur l'ARNt, car l'hybridation manuelle produit un fond élevé. Une fois le programme d'hybridation terminé, laver manuellement les lames avec la solution de lavage 3 en agitant doucement dans un tube conique de 50 millilitres pendant trois à cinq minutes.

Lavez les lames au moins deux fois dans des tubes préalablement enveloppés de papier d'aluminium. Séchez les lames par centrifugation à faible vitesse pendant cinq à dix minutes pour des résultats optimaux. Les lames doivent être analysées immédiatement après leur séchage.

Les lames peuvent être numérisées deux à trois fois sans dégradation notable de la qualité d'image. Des résultats représentatifs d'un échantillon d'ARN total correctement isolé et de son analyse sont présentés ici. Cet échantillon présente un spectre très propre avec un rapport OD260/OD280 proche de 2, sans contamination détectable par des protéines ou du phénol lorsqu'il est analysé sur des gels d'agarose à 1 %. Les échantillons oxydés et les échantillons témoins doivent tous deux présenter une bande d'ARN intense, les autres bandes d'acides nucléiques pouvant varier selon les organismes.

Si un échantillon est nettement plus faible que les autres échantillons, ou si un smearing est observé, les échantillons ne doivent pas être utilisés pour les puces à ADN. Les puces à ADN doivent présenter un fond très faible, inférieur d'un ordre de grandeur à celui de la sonde d'ARNt la plus faible. Je viens de vous montrer comment isoler et déterminer les niveaux de chargement relatifs de l'ARNt lors de la réalisation de cette procédure.

Il est important de se rappeler de maintenir vos réactifs exempts de nucléases, en particulier durant les étapes d'oxydation et de dilatation. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.