Name: La production de transgéniques Xenopus laevis Intégration par médiation des enzymes de restriction et de la transplantation nucléaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Apprenez à produire des Xenopus laevis transgéniques par intégration médiée par enzymes de restriction et transplantation nucléaire. Cette méthode permet d'étudier l'expression génique pendant le développement embryonnaire.

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Le financement de notre travail est fourni par le NIH, le Mars of Dimes, et l&#39;American Cancer Society.

Des versions modifiées de cette approche de transgenèse ont été initialement décrites en 1 et 2. A. Préparation des noyaux de sperme Cette méthode de préparation des noyaux est adapté de Murray 3, mais les inhibiteurs de protéase ont été omises car elles interfèrent avec le développement ultérieur des œufs transplantés avec des noyaux de spermatozoïdes. Des aliquotes sont congelés à -80 ° C et peuvent être utilisés pour des transplantations d'environ 6 mois. Toutes les solutions doivent être préparées et placées sur la glace avant le début de la préparation. <ol><li> Anesthetize 1-2 mâle adulte X. laevis par immersion dans tricaïne pendant au moins 20 min suivie du jonchage; retirer les testicules. </li><li> Rouler les testicules sur une serviette en papier pour enlever le sang, les vaisseaux sanguins et de graisse du corps, lavez-les brièvement dans un plat de 60 mm de Petri contenant 1XMMR, et enlever toute pièce supplémentaire de la graisse corporelle. Prenez soin de ne pas percer les testicules, car cela libère le sperme. </li><li> Transfert des testicules à une sèche de 60 mm boîte de Pétri et laisser macérer des testicules avec des pinces jusqu'à ce qu'il n'y morceaux visibles. La macération doit être fait de manière aussi approfondie que possible afin d'obtenir des rendements élevés de noyaux. </li><li> Ajouter 2mls tampon froid préparation nucléaire (CNLC; 1X de stock) pour le macérat et doucement la pipette de haut en bas. </li><li> Squirt macérer dans environ 4 épaisseurs de gaze sur un entonnoir, recueillant dans un tube de 15 ml (par exemple Falcon 2059); Rincez plat avec 8mLs de la CNLC et de mettre ce rinçage à travers la gaze, en la recueillant dans le tube. Avec les mains gantées presser le fromage pour recueillir le liquide restant dans le tube. </li><li> Pellet le sperme à 3000 rpm pendant 10 min. à 4 ° C dans un rotor swing (1480g par exemple dans un Sorvall HB-rotor 4 ou équivalent) avec les adaptateurs de tube approprié. Décanter le surnageant, ajouter 8 ml CNLC à ce tube et la pipette de haut en bas avec une pipette de 10 mL à Resuspendre le culot; Isoler à nouveau comme ci-dessus et décanter le surnageant. Equilibrer 1mL de la CNLC à température ambiante pendant la rotation. </li><li> Resuspendre le culot dans 1 ml CNLC température ambiante en utilisant une pointe de 1 mL pipetteman, ajouter 50 pl de la lysolécithine 10mg/ml fraîchement préparé, mélangez délicatement et incuber pendant 5 min. à température ambiante. </li><li> Ajouter 10 ml de BSA à froid 1XNPB 3% sur le tube pour arrêter la réaction lysolécithine, mélanger délicatement et spin bas pendant 10 min à 3000 rpm dans un rotor swing. Décanter le surnageant. Le culot lysolécithine traité devrait ressembler un peu plus translucide (moins opaque blanc) qu'il a fait avant le traitement lysolécithine. </li><li> Décanter le surnageant et remettre le culot dans 5 ml de BSA à froid CNLC 0.3%, mélanger délicatement avec une pipette de 10 ml et centrifuger pendant 10 min à 3000rpm comme ci-dessus. </li><li> Décanter le surnageant et remettre le culot dans 500μl de tampon de stockage du sperme et le transfert d'un tube de 1,5 ml. C'est maintenant votre stock noyaux. Store sur la glace pendant que vous vérifiez le rendement de noyaux. </li><li> Pour vérifier le rendement des noyaux, placer 98 ul de tampon de dilution du sperme (PSD), 1 pl du stock nucléaire et 1 microlitre de 1:100 dilution du stock de Hoechst dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Mélanger le bouillon nucléaires très bien à l'aide d'un rasoir-coupées (ou grande ouverture) pointe de la pipette juste avant d'enlever l'ul 1. Mélanger la dilution SDB / Hoechst / noyaux très bien et laissez une petite quantité de s'écouler dans la chambre d'un hématimètre de Neubauer améliorée par capillarité. Comptez noyaux dans un carré de l'hématimètre sous un microscope composé. D'un homme, vous devriez obtenir le nombre d'au moins 100-200 (X10 4 cellules / mL) pour cette dilution 1:100 du stock pour une concentration d'actions non dilué de 1-2X10 5 cellules / ul. Si votre stock est moins concentré, laissez les noyaux se contenter de quelques heures, retirer certaines de surnageant, et de raconter. Laisser les noyaux à 4 ° C pendant la nuit pour permettre à la glycérine pour pénétrer pour mieux la cryoconservation, puis mélanger le matériel nucléaire bien avec une pointe de pipette large orifice, de préparer des aliquotes 20 pi, et congeler dans l'azote liquide. </li></ol> B. Préparation de l'extrait de High Speed Cette méthode est adaptée de Murray trois et produit un extrait cytosolique interphase qui favoriseront décondensation chromatine enflure et partielle des noyaux de spermatozoïdes ajouté. Extrait peuvent être congelés en petits aliquots à -80 ° C et décongelés avant utilisation. <ol><li> 3-5 jours avant l'injection de HCG, le Premier 8-12 femelle adulte X. laevis en injectant 50 U de PMSG dans le sac lymphatique dorsal. Le soir, avant la préparation d'extraire, d'injecter chaque grenouille avec 500 unités HCG et placer 2 grenouilles / conteneur en 2 1XMMR litres. Comme une grenouille avec lyse ou l'activation des œufs peuvent compromettre la préparation d'extrait, il est conseillé de séparer les grenouilles en paires pour l'ovulation. </li><li> Le lendemain matin, préparer et réfrigérer toutes les solutions avant de commencer la préparation. Doucement, la main d'expulser les oeufs de chaque grenouille dans de grandes beakers contenant 1X ROR. Screen les oeufs de chaque conteneur et omettre tous les lots d'œufs avec des signes de marbrures, lyse ou l'activation (visualisé par la contraction de la pigmentation dans l'hémisphère animal) de la procédure. Collecter les œufs ininterrompue, même avec la pigmentation. Bonne oeufs peuvent aussi être collectées à partir du ROR 1X dans les seaux de grenouille. Le volume total d'œufs doit être&gt; 100 ml de les 8-12 femelles. </li><li> De la gelée des oeufs. Pour ce faire, retirez ROR autant que possible, ajoutez une petite quantité de solution de cystéine, et faire tournoyer les œufs. Remplacer avec une solution de cystéine frais à plusieurs reprises pendant de-gélifiant. De la gelée de chaque lot d'œufs séparément et jetez lots avec la rupture ou l'activation d'oeuf. Combinez le reste des oeufs. </li><li> Laver les œufs à quatre reprises en ~ 35 mL de tampon de l'extrait (HB), puis deux fois dans 25 ml de LCR-XB avec des inhibiteurs de protéase. </li><li> Pour emballer les oeufs: transférer les oeufs dans des tubes ultraclear Beckman. Laisser les œufs à régler. Retirer autant CSF-XB que possible. Centrifuger les oeufs en utilisant un Beekman SW 40 Ti rotor (ou rotor similaire) à 1000 rpm (150g) pour ~ 60 sec à 4 ° C. Retirer l'excès de solution par le haut des oeufs emballés. </li><li> Pour écraser les oeufs et générer cytoplasmique extrait: centrifuger les oeufs à 10000 rpm (16.000 g) pendant 10 min à 4 ° C. Les œufs doivent se séparer en trois couches: des lipides (en haut), le cytoplasme (centre), et le jaune (en bas). Recueillir la couche cytoplasmique de chaque tube avec une aiguille de calibre 18 en insérant l'aiguille dans le tube à la base de la couche cytoplasmique. Transfert dans le cytoplasme d'un nouveau tube ultraclear Beckman sur la glace. </li><li> Ajouter les inhibiteurs de protéase dans le cytoplasme isolé à une concentration finale de 1X. Recentrifuger le cytoplasme à 16.000 g pendant 10 min à 4 ° C. Recueillir le cytoplasme clarifié comme décrit ci-dessus. S'attendre à obtenir de 0,75 à 1 cytoplasme mL / grenouille. </li><li> Ajouter 1 / 20 du volume extrait de mix énergétique à l'échantillon. Transfert du cytoplasme dans des tubes à paroi épaisse en polycarbonate pour la Beckman TL-100 ultracentrifugation. Tubes détiennent environ 3 ml chacun et doit être au moins à moitié plein. </li><li> Ajouter 1 M CaCl 2 dans chaque tube à une concentration finale de 0,4 mM. Incuber les tubes pendant 15 min à température ambiante. Cette inactive LCR et pousse l'extrait dans l'interphase. </li><li> Équilibrer les tubes et les centrifugeuses dans un Beckman TL-100 en utilisant une ultracentrifugeuse TLA-100.3 rotor à 70000 rpm (200000 g) pendant 1,5 h à 4 ° C. Le cytoplasme se fractionnent en quatre couches, de haut en bas: des lipides, le cytosol, membrane / mitochondries, et le glycogène / ribosomes. </li><li> Retirez la couche cytosolique de chaque tube (~ 1 mL si 2-3 mL a été chargée dans le tube) en insérant une seringue dans le haut du tube à travers la couche lipidique. Transfert de la fraction cytosolique des tubes frais et recentrifuger les échantillons à 70 000 rpm (200 000 g) pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Aliquoter le surnageant dans 25 ul aliquotes dans des tubes de 0,5 mL. Quick-geler les aliquotes dans l'azote liquide et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation. Afin de déterminer si l'extrait est efficace, les noyaux des spermatozoïdes peuvent être incubés dans l'extrait et colorés avec Hoechst pour déterminer si les noyaux visiblement houle (épaissir et allonger) dans les 10 min de plus à température ambiante. </li></ol> Réaction de transgénèse C et le transfert nucléaire Important: Vérifiez que les solutions, l'équipement et des grenouilles sont tous prêts avant le début d'une réaction. Une fois que vous commencez, vous devez procéder à la réaction en utilisant le calendrier approximatif décrit ci-dessous, car de nombreux éléments ne restent pas stables pendant&gt; 30 minutes. Alors que le stock de noyaux de sperme est conservé sur la glace, les réactions de transgénèse (dilué et concentré) doit être conservé à température ambiante. <ol><li> Premier grenouilles femelles. Le soir avant de transgénèse, injecter plusieurs (3-5) femelles adultes grenouille avec 800 unités HCG dans le sac lymphatique dorsal d'obtenir fraîchement oeufs pondus dès le lendemain. </li><li> Le jour de la procédure de la transgénèse, de préparer ou mettre à température les solutions nécessaires pour la transgénèse: <ol class="lalpha"><li> Cystéine fraîchement préparé (2,5% en 1XMMR, pH 8,0). Vous aurez besoin de plusieurs centaines de millilitres d'être utilisés ce jour-là. </li><li> Ficoll 0.2XMMR 6% pour les plats de la transplantation et la récupération des embryons transgéniques et 0.2XMMR 100 pg / ml de gentamicine (sans Ficoll) pour élever des embryons. Les solutions doivent pas être plus chaud que 18-21 ° C et d'embryons transgéniques doivent être soulevées par les clivages au début à des températures entre 16 et 21 ° C, car des températures plus élevées nuisent à la fois la fréquence de la transgénèse et le développement embryonnaire. </li><li> Décongeler et s'équilibrer à température ambiante aliquotes congelés de la SDB (tampon de dilution du sperme) en vue de transplantations de la journée, le dégel de l'extrait à haute vitesse et placer sur la glace, et de préparer une solution de MgCl2 100 mM. </li><li> Sortez èmeplats d'injection électronique d'agarose et remplir avec MMR / Ficoll solution, et mis en place et de pré-lancer la pompe à perfusion afin de stabiliser le débit. </li><li> Vérifiez que les grenouilles femelles pondent des oeufs et sont de haute qualité. Idéalement, les oeufs doivent avoir un cortex entreprise (tenir la forme, après de-gélifiant). </li></ol></li><li> Mettre en place une réaction transgénèse: <ol class="lalpha"><li> Très doucement (à l'aide d'une pipette épointés) mélanger les stocks des noyaux et de combiner dans un tube Eppendorf de 1,5 ml: Noyaux 4μl (~ 4-8X10 5 noyaux) 2μl plasmide linéarisé (100ng/μl) Incuber 5 minutes à température ambiante. </li><li> tout d'incubation est de procéder, diluer 0.5μl d'enzyme de restriction dans 4.5μl H 2 O et ajouter 1 microlitre d'enzyme diluée à 18μl du PSD, 2μl de MgCl 2 et 2μl d'extrait à grande vitesse. Ajouter ce mélange à la réaction des noyaux-plasmide. Incuber 10 minutes de plus à gonfler les noyaux. </li><li> Pendant cette incubation, presser les œufs de grenouilles et de 2 à 3 de la gelée dans une solution de cystéine. Lavez-les bien (5X) avec 1XMMR, et l'utilisation d'une pipette grand diamètre pour transférer 400 à 500 oeufs à chaque dejellied agarose contenant 0,2 x plat bien ROR Ficoll 4%. Cela prend habituellement environ 10 minutes, donc une fois les plats d'oeufs sont préparées de la réaction est généralement prêt à diluer. </li><li> Environ 15-20 minutes après le début de l'étape a, mélanger délicatement la réaction (noyaux / / extrait l'ADN) avec une pointe coupée et ajouter environ 5uL à 150 PSD ul à température ambiante. Noyaux dans ce mélange dilué est stable pendant environ 1h., Alors qu'ils ne conservent pas la capacité de la transplantation tant quand on les laisse dans le mélange concentré. </li></ol></li><li> Chargez l'aiguille: Mélanger la réaction diluée préparée ci-dessus très doucement avec une pipette large orifice, puis charger l'aiguille rapidement, comme des noyaux se déposent rapidement dans le tube. Pour backloading l'aiguille, placez un morceau de tuyau Tygon fine sur la fin d'un embout de pipette 200 pl coupés. Aspirer la solution dans l'embout de la pipette, puis fixez le tuyau à l'aiguille et laisser la solution d'entrer dans l'aiguille par gravité ou délicatement sur le piston pipette. </li><li> Fixer l'aiguille à la pompe tuyaux et commencent transplantations de noyaux. Les injections doivent être rapides, peu profondes et à peu près perpendiculaire à la membrane plasmique de l'œuf pour éviter de faire des dégâts. A la vitesse d'écoulement suggéré (10nl/sec), laisser l'aiguille dans l'œuf pour ~ 0,5 secondes. Vous devez compléter 1-2 plats de transplantations en 20-30 minutes. </li></ol> Après les injections, laissez les plats à 16-20 ° C jusqu'à ce que les embryons ont atteint le stade de la cellule 4-8. Trier les embryons clivage loin de leur non-clivage voisins en transférant (avec une pipette Pasteur en verre avec une pointe à peu près le même diamètre que l'œuf) à un plat frais de Ficoll grande 0.2XMMR 4%. Subdiviser les embryons clivage en petits groupes (10-15 embryons / puits d'une plaque à 6 puits) et de la culture 0.2XMMR (pas de Ficoll) 100 mg / ml de gentamicine dans le développement précoce. Les embryons doivent être vérifiés pendant la gastrulation avec tout embryons meurent enlevé rapidement et les médias changé dès que nécessaire. Dépannage: <ol><li> Aiguille est bloquée: débit de la solution de l'aiguille doit être apparente au cours des transplantations. Si l'aiguille est bloquée par les particules visibles, le changement d'aiguilles ou d'essayer d'éliminer les débris par clipsage la pointe avec une pince et en poussant solution à travers l'aiguille. </li><li> Aucun clivage oeufs sont obtenus: vérifier que les dilutions des noyaux de spermatozoïdes et le volume d'injection sont appropriés et que l'aiguille n'a pas été bloquée pendant la transplantation. Si le volume d'injection est trop élevée, les œufs peuvent aussi ne pas cliver et de plutôt montrer la pigmentation décolorées ou des dommages. </li><li> Embryons Beaucoup meurent pendant la gastrulation. Plusieurs facteurs peuvent améliorer la survie des embryons: <ol><li> prendre soin avec les noyaux pendant la préparation et la réaction enzymatique. Noyaux décondensée sont fragiles et ont besoin d'être transplantés à l'aide du calendrier ci-dessus. Ne pas les placer sur la glace. </li><li> Les altérations chromosomiques soutenue par les noyaux des spermatozoïdes lors de la réaction enzymatique et le transfert nucléaire affecte à la fois la fréquence de la transgénèse et le développement normal des embryons. Lésions chromosomiques dans les noyaux améliore l'efficacité de la transgénèse, mais affecte négativement la survie / développement normal. Diminuer ou en omettant d'enzyme de restriction pendant l'incubation enzyme peut améliorer le taux de développement normal, mais peut diminuer la fréquence de la transgénèse ou le nombre de copies du plasmide introduit dans le génome d'embryons. </li><li> Si la fin de blastula travers embryons gastrula montrer des signes de décoloration ou de mort cellulaire, il est également possible que d'un réactif utilisé pour les transplantations était toxique pour les oeufs. En outre, si l'œufs n'ont pas un cortex cabinet, ils peuvent subir exogastrulation et ne parviennent pas à générer la normale après-gastrula embryons. </li></ol></li><li> Le nombre d'embryons exprimant le transgène est faible. Augmenter la quantité d'enzyme de restriction. </li></ol> Représentant Résultats embryon transgénique <img src="/files/ftp_upload/2010/2010fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Embryons transgéniques résultant des transferts nucléaires devrait être soulevée jusqu'à l'expression du promoteur d'intérêt est visible. Dans la figure 1 ci-dessus, un promoteur de l'actine musculaire entraîne l'expression de la protéine fluorescente verte dans les somites de ce têtard transgéniques.

<ol><li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122, 3173-3183 (1996).</li>
<li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods Mol Biol. 97, 393-414 (1999).</li>
<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle extracts.</a> Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Hartley, K. O., Hardcastle, Z., Friday, R. V., Amaya, E., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+reveal+that+anterior+neural+development+requires+continued+suppression+of+BMP+signaling+after+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos reveal that anterior neural development requires continued suppression of BMP signaling after gastrulation.</a> Developmental Biology. 238, 168-184 (2001).</li>
<li>Karaulanov, E., Knöchel, W., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+BMP4+synexpression+in+transgenic+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of BMP4 synexpression in transgenic Xenopus.</a> EMBO J. 23, 844-856 (2004).</li>
<li>Ogino, H., Fisher, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+a+head-field+selector+Otx2+and+Notch+signaling%3A+a+mechanism+for+lens+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Convergence of a head-field selector Otx2 and Notch signaling: a mechanism for lens specification.</a> Development. 135, 249-2458 (2008).</li>
<li>Taylor, J. J., Wang, T., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf-+and+Vent-binding+sites+regulate+neural-specific+geminin+expression+in+the+gastrula+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tcf- and Vent-binding sites regulate neural-specific geminin expression in the gastrula embryo.</a> Developmental Biology. 289, 494-506 (2006).</li>
<li>Marsh-Armstrong, N., Huang, H., Berry, D. L., Brown, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transmission+of+transgenes+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Germ-line transmission of transgenes in Xenopus laevis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14389-14393 (1999).</li>
<li>Offield, M. F., Hirsch, N., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Xenopus+tropicalis+transgenic+lines+and+their+use+in+studying+lens+developmental+timing+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The development of Xenopus tropicalis transgenic lines and their use in studying lens developmental timing in living embryos.</a> Development. 127, 1789-1797 (2000).</li>
</ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le soin des animaux et utilisation comité à la Washington University School of Medicine.

Pour chaque construction transgénique à être testé, nous avons généralement greffe noyaux dans les œufs 500-1000; à cette échelle, nous pouvons générer des embryons transgéniques exprimant jusqu&#39;à 10 différentes constructions par jour, selon le nombre de femelles sont induits à pondre des oeufs. Parmi ces transplantations, environ un tiers de la cliver les œufs et 60-80% de ces embryons clivage passer par la gastrulation normalement. Selon les conditions de réaction utilisées, entre 10-50% de ces embryons expriment ...

A. Préparation des noyaux de sperme Réactifs: <ol><li> 1X ROR (2mm CaCl 2, 5 mM d&#39;HEPES, pH 7,5, 2 mM de KCl, 1 mM MgCl2, 100 mM NaCl). </li><li> 0,1% tricaïne méthanesulfonate (MS222, ester éthylique d&#39;acide aminobenzoïque, Sigma A-5040), du bicarbonate de sodium à 0,1%. Dissoudre dans l&#39;eau. </li><li> 2X Beurre Préparation nucléaire (CNLC). Le jour de la préparation des noyaux de spermatozoïdes, représentent 30 ml de 2X la CNLC à partir des aliquotes des solutions stocks conservés congelés: 500 mM de saccharose (1,5 M d&#39;actions), 30 mM HEPES (stock 1M; titrer avec KOH pour que le pH est à 7,7 15 mm), 1 mM trichlorhydrate de spermidine (Sigma S-2501, 10 mm Stock), 0,4 mM de spermine tétrachlorhydrate (Sigma S-1141, 10 mm Stock), 2 mM de dithiothréitol (Sigma D-0632; stock de 100 mm), 2 mM EDTA (EDTA 500 mM, pH 8,0). </li><li> Utilisez le 2XNPB faire a. 30ml 1X CNLC, b. 10ml 1XNPB 3% de BSA (fraction V, Sigma A-7906), c. 5ml BSA 1XNPB 0,3%. </li><li> Lysolécithine: 100 ul de 10 mg / ml de L-α-lyso-lécithine, jaune d&#39;oeuf (Calbiochem, 440154); dissoudre à la température ambiante, juste avant utilisation. Magasin de stock de solide à 20 ° C. Jeter de la poudre d&#39;actions si elle devient collante. </li><li> Albumine sérique bovine (BSA): 10% (p / v) de BSA (fraction V, Sigma A-7906) représentent 5 ml dans l&#39;eau le jour de la préparation des noyaux de spermatozoïdes. </li><li> Le sperme de stockage tampon (1 ml) 1X CNLC, glycérol 30%, BSA 0,3%. </li><li> Tampon de dilution du sperme: 250 mM de saccharose, 75 mM KCl, 0,5 mM trichlorhydrate de spermidine, spermine 0,2 mM tétrachlorhydrate. Titrer à pH 7.3 à 7.5 et stocker de 0,5 à 1 ml aliquotes à 20 ° C. </li><li> Hoechst n ° 33342 (Sigma B-2261): 10 mg / ml d&#39;actions en DH 2 O, de stocker dans un récipient étanche à la lumière à 20 ° C. </li></ol> Equipement: <ul><li> Rotor swing et centrifuger </li><li> étamine </li><li> des outils de dissection (pinces et ciseaux) </li><li> microscope à fluorescence </li><li> entonnoir </li><li> des gants </li><li> hémocytomètre </li><li> aiguilles (calibre 26) </li><li> serviettes en papier </li><li> des boîtes de Pétri (60 mm) </li><li> Pipettes </li><li> plastique (5 et 10 ml) </li><li> Pipetman conseils (1 ml et 200 pl) </li><li> Seringues (1 ml) </li><li> tubes (14 ml; Falcon, 2059) </li><li> tubes </li><li> microcentrifugeuse (1,5 ml) </li></ul> B. Préparation de l&#39;extrait de High Speed Réactifs: <ol><li> 1X Marc modification Ringer (TMM): 100 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM de CaCl 2, 5 mM d&#39;HEPES, pH 7,5. Préparer un stock de 10X, et ajuster le pH avec NaOH à 7,5. </li><li> Extrait 20X tampon (HB) de bouillon de sel: 2 M de KCl, 20 mM MgCl2, 2 mM de CaCl2, filtre-stériliser et conserver à 4 ° C. </li><li> Extrait de tampon (XB; fraîchement préparés et stockés sur glace): 1X sels XB, 50 mM de saccharose, HEPES 10 mM (1 M d&#39;actions, titré avec du KOH de sorte que le pH est de 7,7 lorsque dilué à 15 mM; filtre à stériliser et stocker en aliquots à 20 ° C). Préparer 100 ml environ. </li><li> 2% (p / v) de L-cystéine chlorhydrate 1-hydrate: Fabriqué en 1X sels XB avant de l&#39;utiliser et titré à pH 7,8 avec NaOH. Préparer 300 ml environ. </li><li> LCR-XB: 1X sels XB, MgCl2 1 mM (en plus de MgCl 2 présents dans les sels de XB; concentration finale de 2 mM), 10 mM d&#39;HEPES, pH 7,7, 50 mM de saccharose, 5 mM EGTA, pH 7,7. Préparer 50 ml. </li><li> Les inhibiteurs de protéase: Mélange de leupeptine, chymostatine et pepstatine, chaque dissous à une concentration finale de 10 mg / ml dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Conserver dans de petites aliquotes à 20 ° C. </li><li> 1 M de CaCl 2. </li><li> Mix énergétique: 150 créatine phosphate mM, 20 mM d&#39;ATP, 20 mM MgCl 2. </li><li> Jument gravide gonadotrophine sérique (PMSG): 100 U / ml PMSG (PG600 ®, Intervet, Inc, 021825). Dissoudre dans l&#39;eau et stocké à 20 ° C. </li><li> La gonadotrophine chorionique humaine (HCG): 1000 U / ml d&#39;hCG (CHORULON ®, Intervet, Inc, 057176). Dissoudre dans l&#39;eau et stocké à 4 ° C. </li></ol> Equipement: <ul><li> Xenopus laevis femelles </li><li> Aiguilles (18 et calibre 26) </li><li> Pipette Pasteur </li><li> largeur alésage </li><li> Seringues (1 ml) </li><li> Tubes, microcentrifugeuse (0,5 ml) </li><li> Tubes, à paroi épaisse en polycarbonate (Beckman, 349 622) </li><li> Tubes, UltraClear (14 x 95 mm; Beckman, 344 060) </li><li> Ultracentrifuger et rotors (par exemple, Beckman TL-100 avec des rotors SW 40 Ti et TLA-100.3) </li><li> Béchers pour la collecte des œufs </li><li> Seaux ou des récipients pour la tenue de grenouilles femelles (par exemple, 4-L gobelets en plastique avec couvercle mesh). </li></ul> C. transplantation nucléaire. Réactifs: <ol><li> 2,5% d&#39;agarose dans 0.1XMMR (pour faire des plats d&#39;injection) </li><li> La cystéine 2,5% en 1XMMR, PH 8,0, préparé sur la journée d&#39;utilisation </li><li> Ficoll </li><li> 10 mg / ml de gentamycine (stock 1000X) </li><li> haute vitesse de l&#39;extrait d&#39;œufs (voir ci-dessus) </li><li> 100 MgCl 2 </li><li> ROR 10X (voir ci-dessus) </li><li> Enzyme de restriction (par exemple Notl de New England Biolabs) </li><li> Tampon de dilution du sperme (PSD; voir ci-dessus) et des noyaux de spermatozoïdes (voir ci-dessus) </li><li> La gonadotrophine chorionique humaine (HCG) comme ci-dessus </li><li> huile minérale (Sigma, M8410) </li><li> Plasmide linéarisé d&#39;être présenté comme le transgène: Préparer plasmide linéarisé à une concentration d&#39;environ 100 ng / ul dans stérile, eau sans nucléase (nous évitons de Tris EDTA et contenant des tampons, qui sont un peu toxique pour les embryons). L&#39;enzyme de restriction utilisée pour linéariser le plasmide n&#39;a pas à être le même que celui utilisé dans la réaction de transfert nucléaire. Nous utilisons habituellement Notl pour toutes les réactions, indépendamment de ce plasmide est linéarisé par. Certains de calibrage de la dilution de l&#39;enzyme utilisée dans la réaction peut être nécessaire, des enzymes comme trop peut entraîner des effets néfastes sur le post-gastrula développement. Plasmide peut être purifié de plusieurs manières différentes: nous utilisons habituellement le kit Qiagen QIAquick PCR Purification selon les directives des fabricants; purification d&#39;une bande unique à partir d&#39;un gel n&#39;est pas nécessaire. Si plasmide est purifié à l&#39;aide de phénol / chloroforme et précipitation extractions éthanol, être certain d&#39;éliminer toutes traces de matières organiques et l&#39;éthanol. </li></ol> Equipement: Plats Agarose pour l&#39;injection: Dans une boîte de Pétri de 60 mm en plastique, posez une petite 35mmX35mm pèsent bateau sur fondue de 2,5% d&#39;agarose en 0.1XMMR eau pour créer une dépression avec un fond d&#39;agarose enduits pour le remplissage avec des oeufs. Une fois gélose a durci, l&#39;envelopper dans du parafilm et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. Faire 2-3 plats à l&#39;avance pour chaque réaction transgéniques vous envisagez de faire. Pompe à perfusion: Nous utilisons une pompe seringue de perfusion de Harvard Apparatus, équipé avec une seringue cc 3 / aiguille rempli d&#39;huile minérale (Sigma M-8410). Blunt bout de l&#39;aiguille de seringue (pour l&#39;empêcher de perforer le tube) et attacher le tuyau Tygon fine. Faites fonctionner la pompe à ~ 10nl/sec, ce qui suppose que le temps de l&#39;aiguille est dans chaque œuf ne sera pas supérieure à 1 sec. La pompe doit être pré-tourner pendant plusieurs minutes avant de transgénèse de départ pour la journée afin de s&#39;assurer que le piston de la seringue est à fleur avec le piston et ce flux positifs de l&#39;huile du tube est en cours. Aiguilles pour les transferts nucléaires. L&#39;utilisation d&#39;un extracteur de micropipette, générer des aiguilles avec une longue pointe en pente. Clip avec une pince à ces sous un microscope à dissection équipé d&#39;un micromètre oculaire pour obtenir une ouverture ~ microns 80 avec une forme biseautée. Autres équipements: Xenopus laevis femelles, stéréomicroscope, incubateur, micromanipulateur, extracteur d&#39;aiguilles de microinjection (par exemple le modèle P-87, Sutter), aiguilles de seringues (26 gauge), les aiguilles de microinjection verre, micromètre oculaire pour la tonte des pointes d&#39;aiguille calibrée au diamètre 80μm microinjection, des boîtes de Pétri, peser bateaux 35mm, tube Tygon (ID = 1 / 32 po, OD = 3 / 32 po)

la production de transgéniques xenopus laevis intégration par médiation des enzymes de restriction et de la transplantation nucléaire

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

L&#39;intégration stable de produits de gène cloné dans le génome de Xenopus est nécessaire de contrôler l&#39;heure et le lieu d&#39;expression, d&#39;exprimer des gènes à des stades ultérieurs du développement embryonnaire, et de définir comment les amplificateurs et les promoteurs régulent l&#39;expression génique au sein de l&#39;embryon. Le protocole démontré ici peuvent être utilisés pour produire efficacement transgéniques Xenopus laevis embryons. Cette approche implique la transgénèse trois parties: 1. Noyaux spermatozoïdes sont isolés des adultes X. testicule laevis par traitement avec lysolécithine, qui perméabilise la membrane plasmique des spermatozoïdes. 2. Extraire des oeufs est préparé par centrifugation à faible vitesse, ajout de calcium pour provoquer l&#39;extrait de progresser vers l&#39;interphase du cycle cellulaire, et une centrifugation à haute vitesse pour isoler cytosol interphase. 3. Transplantation nucléaire: les noyaux et extraire sont combinés avec l&#39;ADN plasmidique linéarisé d&#39;être présenté comme le transgène et une petite quantité d&#39;enzyme de restriction. Lors d&#39;une réaction très court, extrait d&#39;oeuf décondense partie de la chromatine des spermatozoïdes et l&#39;enzyme de restriction génère cassures chromosomiques qui favorisent la recombinaison du transgène dans le génome. Les noyaux des spermatozoïdes traités sont ensuite transplantées dans les œufs non fécondés. L&#39;intégration du transgène se produit habituellement avant le premier clivage embryonnaire tels que les embryons qui en résultent ne sont pas chimériques. Ces embryons peuvent être analysées sans qu&#39;il soit nécessaire de se reproduire à la prochaine génération, permettant la génération rapide et efficace des embryons transgéniques pour des analyses de promoteur et de la fonction des gènes. Adulte X. laevis résultant de cette procédure également propager le transgène dans la lignée germinale et peut être utilisé pour générer des lignées d&#39;animaux transgéniques à des fins multiples.

Ce protocole vidéo montre une méthode pour générer des transgéniques<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Par l&#39;introduction de transgènes dans les noyaux des spermatozoïdes suivie par transplantation nucléaire dans les œufs non fécondés.

La production de transgéniques Xenopus laevis Intégration par médiation des enzymes de restriction et de la transplantation nucléaire

L'intégration stable de produits géniques clonés dans le génome de Xenopus est nécessaire pour contrôler le moment et le lieu de l'expression, pour exprimer des gènes à des stades plus avancés du développement embryonnaire et pour définir comment les enhancers et les promoteurs régulent l'expression génique au sein de l'embryon. Le protocole présenté ici peut être utilisé pour produire efficacement des embryons transgéniques de Xenopus laevis. Cette approche de transgenèse se compose de trois parties : 1. Les noyaux spermatiques sont isolés des testicules d'adultes X. laevis par un traitement à la lysolecithine, qui perméabilise la membrane plasmique des spermatozoïdes. 2. L'extrait ovocytaire est préparé par centrifugation à basse vitesse, ajout de calcium pour permettre à l'extrait de progresser vers l'interphase du cycle cellulaire, puis une centrifugation à haute vitesse pour isoler le cytosol d'interphase. 3. Transplantation nucléaire : les noyaux et l'extrait sont combinés avec l'ADN plasmidique linéarisé à introduire en tant que transgène et une petite quantité d'enzyme de restriction. Lors d'une réaction courte, l'extrait ovocytaire décondense partiellement la chromatine spermatique et l'enzyme de restriction génère des cassures chromosomiques qui favorisent la recombinaison du transgène dans le génome. Les noyaux spermatiques traités sont ensuite transplantés dans des ovocytes non fertilisés. L'intégration du transgène se produit généralement avant le premier clivage embryonnaire, de sorte que les embryons résultants ne sont pas chimériques. Ces embryons peuvent être analysés sans qu'il soit nécessaire de passer à la génération suivante, permettant ainsi une génération efficace et rapide d'embryons transgéniques pour l'analyse de la fonction des promoteurs et des gènes. Les adultes X. laevis issus de cette procédure propagent également le transgène via la lignée germinale et peuvent être utilisés pour générer des lignées d'animaux transgéniques à des fins multiples.

Pour étudier l'expression génique au cours du développement embryonnaire de Xenopus, les produits géniques clonés doivent être intégrés de manière stable dans le génome. Tout d'abord, des noyaux spermatozoïdes sont isolés à partir des testicules d'adultes de grenouille et rendus perméables. Ensuite, des extraits cytosoliques en interphase sont préparés à partir d'œufs de Xenopus.Les noyaux de spermatozoïdes et l'extrait d'œuf sont mélangés avec de l'ADN transgénique linéarisé et une enzyme de restriction. Au cours de cette étape, l'extrait d'œuf décondense la chromatine des spermatozoïdes tandis que l'enzyme de restriction favorise l'intégration du transgène. Enfin, les noyaux traités sont transférés dans des œufs non fécondés.Chaque cellule de l'embryon résultant porte le transgène et l'expression dépendante du promoteur du transgène est détectée par microscopie en immunofluorescence ou d'autres méthodes. Le principal avantage de cette méthode par rapport à d'autres méthodes, telles que l'injection d'ADN, est que les embryons résultants subissent l'intégration du transgène avant le premier clivage. Cela signifie que les embryons résultants ne sont pas chimériques, et qu'aucun croisement n'est donc nécessaire.Grâce à ce protocole, un grand nombre d'embryons transgéniques peut être créé rapidement et efficacement en seulement quelques heures. Ces embryons transgéniques peuvent être utilisés pour analyser la fonction des promoteurs ou des gènes, ou être croisés afin de créer des lignées transgéniques. Commencez cette procédure en transférant les testicules d'une ou deux grenouilles sacrifiées dans une boîte de Pétri sèche de 60 millimètres. À l'aide de pinces, macérez les testicules jusqu'à ce qu'aucun morceau visible ne subsiste.Ajoutez deux millilitres de tampon froid de préparation nucléaire (NPB) au macérat et aspirez-déversez doucement le macérat à travers environ quatre épaisseurs de gaze dans un entonnoir, puis recueillez le filtrat dans un tube de 15 millilitres. Rincez ensuite la boîte avec huit millilitres de NPB et filtrez à travers la gaze dans le tube. Cette solution contient les spermatozoïdes manipulés avec des gants.Serrer le torchon en tissu pour recueillir le liquide restant, centrifuger le tube pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius afin d'obtenir un culot de spermatozoïdes. Après la centrifugation, décantez le surnageant. Ajoutez ensuite huit millilitres de NPB et aspirez et rejetez plusieurs fois pour resuspendre le culot. Centrifugez à nouveau ; pendant la centrifugation, portez un millilitre de NPB à température ambiante.Ensuite, après la centrifugation, resuspendre le culot dans un millilitre de NPB et ajouter 50 microlitres de lyso-lecithine fraîchement préparée à 10 milligrammes par millilitre pour permeabiliser les spermatozoïdes. Incuber doucement une partie du mélange pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, ajoutez 10 millilitres de XMPB froid à 1 X contenant 3 % de BSA dans le tube. Pour arrêter la réaction de lyse, centrifugez les spermatozoïdes traités. Le culot doit apparaître légèrement plus translucide qu'auparavant.Resuspendre le culot dans cinq millilitres de NPB froid contenant 0,3 % de BSA pour laver les noyaux spermatozoïdes, en mélangeant doucement à l’aide d’une pipette de 10 millilitres, puis centrifuger ; après la centrifugation, décanté le surnageant et resuspendre le culot. Transférer le spermatozoïde dans 500 microlitres de tampon de stockage des spermatozoïdes dans un tube de 1,5 millilitre. Il s’agit du stock de noyaux. Placer ce tube sur de la glace pour vérifier le rendement en noyaux.Placer 98 microlitres de tampon de dilution des spermatozoïdes, un microlitre de stock de noyaux et un microlitre d'une dilution au 1/100 du stock de hux dans un tube microfuge de 1,5 millilitre. Bien mélanger. À l’aide d’un pipeteur manuel, laisser une petite quantité s’écouler par capillarité dans la chambre d’un hémocytomètre.Sous un microscope composé, compter les noyaux. Un mâle devrait fournir entre 50 et 100 millions de cellules. Placer les noyaux à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour permettre à la glycérine de pénétrer et d'assurer une meilleure cryoconservation.Les aliquotes congelées à l'azote liquide sont conservées à moins 80 degrés Celsius. Les œufs sont collectés à partir de huit à 12 grenouilles. Celles-ci sont transférées dans un bécher et lavées quatre fois dans environ 35 millilitres de tampon d'extraction, puis deux fois dans 25 millilitres de tampon d'extrait de facteur de blocage cytostatique ou C-S-F-X-B contenant des inhibiteurs de protéase, afin de compacter les œufs, qui sont ensuite transférés dans des tubes Beckman UltraClear. Laisser les œufs se déposer.Retirer autant que possible de C-S-F-X-B et centrifuger à 150 G pendant environ 60 secondes. Après la centrifugation, retirer l'excès de solution au-dessus des œufs compactés. Ensuite, pour broyer les œufs et générer un extrait cytoplasmique, centrifuger les œufs à 16 000 G pendant 10 minutes. À quatre degrés Celsius, les œufs doivent se séparer en trois couches.La couche supérieure est constituée de lipides. La couche intermédiaire est le cytoplasme, et la couche inférieure est le vitellus. Insérez une aiguille de calibre 18 munie d'une seringue à travers le tube à la base de la couche intermédiaire et retirez la solution cytoplasmique.Transférez la solution dans un tube Beckman UltraClear frais sur de la glace. Ajoutez des inhibiteurs de protéase au cytoplasme isolé pour obtenir une concentration finale de un x centrifuge. Préparez le cytoplasme à 16 000 Gs pendant 10 minutes.À quatre degrés Celsius, transférez le cytoplasme clarifié dans un nouveau tube. Prévoyez d'obtenir entre 0,75 et un millilitre de cytoplasme par grenouille. Ensuite, ajoutez un vingtième du volume d'extrait de mélange énergétique à l'échantillon.Transférez le cytoplasme dans des tubes en polycarbonate à parois épaisses. Pour l'ultracentrifugation, ajoutez du chlorure de calcium à une concentration molaire de un molaire dans chaque tube afin d'obtenir une concentration finale de 0,4 millimolaire. Incubez les tubes pendant 15 minutes à température ambiante ; cela inactive le facteur cytostatique et pousse l'extrait en interphase avant la centrifugation.Dans une ultracentrifugeuse à 200 000 Gs pendant une heure et demie à quatre degrés Celsius, le cytoplasme se fractionne en quatre couches de haut en bas. Elles sont constituées de lipides, de cytosol, de membranes, et de mitochondries, ainsi que de glycogène et de ribosomes. Insérez une seringue au sommet du tube et prélève la couche cytosolique.Cela devrait représenter environ un millilitre. Si deux à trois millilitres ont été chargés dans le tube, transférez la fraction cytosolique dans des tubes frais et centrifugez les échantillons à 200 000 ×g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, puis aliquotez le surnageant en fractions de 25 microlitres dans des tubes de 0,5 millilitre. Congelez rapidement les aliquots dans de l'azote liquide et conservez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation.Pour préparer une réaction de transgénèse, utilisez une pipette à embout coupé pour mélanger délicatement la solution mère de noyaux et combiner quatre microlitres de noyaux et deux microlitres de plasmide linéarisé dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Incubez pendant cinq minutes à température ambiante pendant que l'incubation se déroule. Diluez 0,5 microlitre de l'enzyme de restriction dans 4,5 microlitres d'eau.Ensuite, ajouter un microlitre d'enzyme diluée à 18 microlitres de tampon de dilution des spermatozoïdes, deux microlitres de chlorure de magnésium et deux microlitres d'extrait à haute vitesse. Ajouter ce mélange à la réaction noyaux-plasmide. Incuber encore 10 minutes afin de permettre le gonflement des noyaux pendant cette incubation.Les œufs obtenus à partir de deux à trois femelles sont déjelés et lavés cinq fois dans du XMMR 1×. Utilisez une pipette large pour transférer 400 à 500 œufs déjelés dans chaque boîte de Pétri contenant du XMMR 0,2× et 4 %fi.Appelez environ 15 à 20 minutes après le début de la réaction de transgénèse. Mélangez délicatement la réaction contenant les noyaux, l'extrait et l'ADN à l'aide d'une pipette dont la pointe a été coupée au niveau du EC, puis ajoutez cinq microlitres de la réaction à 150 microlitres de tampon de dilution des spermatozoïdes à température ambiante pour charger la pipette par arrière. Placez un fin morceau de TIG sur le tube à l'extrémité de la pointe de pipette de 200 microlitres dont la partie EC a été coupée.Aspirez la solution. Ensuite, fixez le tube à l'aiguille et laissez la solution pénétrer dans l'aiguille par gravité. Fixez l'aiguille au tube de la pompe.Placez les œufs sur la platine du microscope. Ensuite, insérez rapidement l'aiguille dans le premier œuf. L'injection doit être superficielle et approximativement perpendiculaire à la membrane plasmique de X.Pour éviter tout dommage, maintenir l'aiguille dans l'œuf pendant environ 0,5 seconde. En délivrant à un débit d'environ 20 nanolitres par seconde, on peut réaliser une à deux boîtes de transplantations en 20 à 30 minutes. Après les injections, placer les boîtes à une température de 16 à 20 degrés Celsius jusqu'à ce que les embryons atteignent le stade de quatre à huit cellules.Les embryons transgéniques issus des transferts nucléaires doivent être élevés jusqu'à ce que l'expression du promoteur d'intérêt soit visible sur l'image présentée ici. Un promoteur d'actine musculaire induit l'expression de la protéine verte fluorescente dans les somites de cette têtard transgénique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser le transfert nucléaire de noyaux spermatozoïdes pour créer des embryons transgéniques de Xenopus.Cette approche a été démontrée pour la transgénèse avec opus lavis, mais peut également être adaptée à zap tropic avec de légères modifications.

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