Name: Microdissection laser des Drosophile Neurones périphériques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Découvrez la microdissection laser pour isoler des neurones périphériques de Drosophila à partir de larves de troisième stade. Cette méthode permet d'obtenir de l'ARN de haute qualité pour des analyses moléculaires.

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Nous remercions les Drs. Yuh-Nung Jan et Wes Grueber pour fournir des stocks volantes utilisées dans cette étude, et Virginia Espina, Dr Emanuel Petricoin et le Dr Lance Liotta d&#39;aide à la LCM. Les auteurs remercient F. Thomas et Kate Miller Jeffress Memorial Trust pour le soutien de cette recherche (DNC) et l&#39;Université George Mason Provost s de bureau (EPRI).

<ol><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
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<li>Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29+of+Drosophila+hemocytes+reveals+important+functional+similarities+to+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).</li>
<li>Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+germline+cells+from+Drosophila+embryos+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry.</a> Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).</li>
<li>Reeves, N., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+programs+activated+by+proneural+proteins+in+the+developing+Drosophila+PNS%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS.</a> Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+Cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li>
<li>Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mRNA+from+specific+tissues+of+Drosophila+by+mRNA+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging.</a> Nucl. Acids Res. 33, (2005).</li>
<li>Appay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+Gene+Expression+Profiling+of+Human+T+Cell+Subsets+Reveals+Parallel+Post-Thymic+Differentiation+for+CD4%2B+and+CD8%2B+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages.</a> J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).</li>
<li>Ginzinger, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+quantification+using+real-time+quantitative+PCR%3A+An+emerging+technology+hits+the+mainstream%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream.</a> Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).</li>
<li>Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+single-cell+RT-PCR+without+RNA+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification.</a> J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).</li>
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<li>Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+in+embryonic+mouse+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling in embryonic mouse lenses.</a> Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).</li>
<li>Scharschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+osteoarthritic+connective+tissue+by+laser+capture+microdissection+and+QRT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Connect.+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR.</a> Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).</li>
<li>Spletter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regulates+Drosophila+olfactory+projection+neuron+identity+and+targeting+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity.</a> Neural Dev. 2, 14-14 (2007).</li>
<li>Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+Drosophila+neuronal+remodeling%3A+a+role+for+the+RNA-binding+protein+Boule+as+a+negative+regulator+of+axon+pruning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning.</a> J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Espina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prot%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

Le protocole présentés ici décrit notre méthode optimisée pour l&#39;isolement des neurones chez la drosophile périphérique via LCM. Alors que ce protocole a été conçu LCM pour l&#39;isolement spécifique de simple, spécifiques à chaque classe ou de plusieurs neurones da drosophile de l&#39;étape de troisième stade larvaire de développement, des modifications mineures du protocole pourrait être facilement adaptée à la capture d&#39;autres types de cellules de drosophile de tous au développement...

Equipement: <ul><li> Cryostat </li><li> Tube de 50 ml conique pour la fixation de diapositives, rinçage, traitement à la trypsine et de l&#39;éthanol / déshydratation xylène </li><li> Congélateur à -80 ° C </li><li> Incubateur </li><li> PixCell IIe LCM Instrument avec Fluor 300 optique à épifluorescence optimisé pour l&#39;EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices) </li></ul>

microdissection laser des drosophile neurones périphériques

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

L&#39;arborisation dendritique (da) des neurones du système nerveux périphérique chez la drosophile (SNP) fournissent un excellent modèle dans lequel d&#39;étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents spécifiques à chaque classe 1,2 morphogenèse dendrite. Pour faciliter les analyses moléculaires des classes spécifiques de développement da neurone, il est vital d&#39;obtenir ces cellules dans une population pure. Bien que toute une gamme de cellules différentes, et tissu-spécifique des techniques d&#39;isolement d&#39;ARN existent pour les cellules de drosophile, y compris magnétiques purification cellulaire perles basée 3,4, fluorescent tri cellulaire (FACS) 5-8, et l&#39;ARN protéine de liaison des stratégies basées sur neuf, aucun des ces méthodes peuvent être facilement utilisées pour isoler une ou plusieurs classes spécifiques drosophile neurones DA avec un haut degré de précision spatiale. Microdissection par capture laser (LCM) a émergé comme un outil extrêmement puissant qui peut être utilisé pour isoler des types cellulaires spécifiques des sections de tissus avec un haut degré de résolution spatiale et de précision. L&#39;ARN obtenu à partir de cellules isolées peuvent ensuite être utilisées pour des analyses, y compris qRT-PCR et profilage de l&#39;expression biopuces dans un type cellulaire donné 10-16. À ce jour, LCM n&#39;a pas été largement appliquée dans l&#39;analyse des tissus et des cellules de drosophile 17,18, y compris les neurones DA à l&#39;étape du stade larvaire tiers de développement. Ici, nous présentons notre protocole optimisé pour l&#39;isolation des neurones DA drosophile en utilisant l&#39;infrarouge (IR) classe de LCM. Cette méthode permet la capture d&#39;unique, spécifiques à chaque classe ou de plusieurs neurones DA avec une haute spécificité et la résolution spatiale. Appariés selon l&#39;âge des larves troisième stade exprimer une HES-mCD8:: GFP 19 transgène sous le contrôle soit de la classe IV da neurone spécifique PPK-GAL4 20 conducteur ou le pan-da neurone spécifique 21-7-21 GAL4 chauffeur ont été utilisés pour ces expériences. L&#39;ARN obtenu à partir des neurones da isolé est de très haute qualité et peuvent être directement utilisés pour des applications en aval, y compris les qRT-PCR ou microréseau analyses. Par ailleurs, ce protocole LCM peuvent être facilement adaptées pour capturer d&#39;autres types de cellules de drosophile à divers stades de développement dépend du type de cellule spécifique, le modèle d&#39;expression GAL4 axée sur la GFP.

Dans cette vidéo, article, nous présentons une méthode pour isoler un ou plusieurs<em&gt; Drosophile</em&gt; Neurones DA à partir de larves du tiers utilisant la capture infrarouge (IR) classe de microdissection par capture laser (LCM). L&#39;ARN obtenu à partir des neurones isolés peuvent être facilement utilisés pour des applications en aval, y compris qRT-PCR ou microréseau analyses.

Microdissection laser des Drosophile Neurones périphériques

Les neurones à arborisation dendritique (da) du système nerveux périphérique (SNP) de la Drosophila constituent un excellent modèle pour étudier le...

La microdissection par capture au laser ou LCM s'est imposée comme un outil extrêmement puissant permettant d'isoler des types cellulaires spécifiques à partir de sections tissulaires avec une résolution spatiale et une précision élevées. Ici, la LCM est utilisée pour disséquer des neurones périphériques à partir de larves de troisième stade oph. Les larves de troisième stade sont incluses dans un moule cryogénique, congelées, puis un cryostat est utilisé pour couper des sections tissulaires en série, qui sont placées sur des lames en verre, décongelées et fixées dans de l'éthanol à 70 %.Les lames sont ensuite incubées avec de la tripsine afin d'éliminer les cuticules larvaires résiduelles, puis déshydratées par un gradient d'éthanol et clarifiées au xylène. Ensuite, un capuchon de microdissection laser (LCM) est placé sur la section tissulaire et des cellules neuronales fluorescentes spécifiques sont capturées à l'aide d'un laser pulsé. Enfin, l'ARN est isolé à partir des cellules capturées pour des applications ultérieures telles que la RT-PCR quantitative ou des analyses par puces à ADN.Bonjour, je suis Dan Cox du Département de biologie moléculaire et de microbiologie et de l'I

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Cellules neuroprogenitor humaines (CNP) ont été élargis dans des conditions de prolifération. NPC ont été différenciées en cultures de neurones riches en présence d'une combinaison de neurotrophines. Marqueurs neuronaux ont été détectés par immunofluorescence. Pour isoler une population pure de neurones, les PNJ ont été différenciés sur des lames de membrane PEN et microdissection laser a été effectuée.

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Nous décrivons ici un protocole de manipulation optogenetic d'activité des motoneurones, tout en surveillant les changements dans la production automobile (contraction musculaire) en...

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L&#39;utilisation de puces microfluidiques pour l&#39;imagerie en direct et l&#39;étude des réponses blessures en<em&gt; Drosophila</em&gt; Larves

L'isolement des neurones dopaminergiques individuels ou l'aire tegmentale ventrale par immunohistochimie directe ou indirecte est démontrée en utilisant microdissection laser. Les paramètres pour l'isolement d'un tissu à partir d'une lame de verre en utilisant un laser infrarouge et de diapositives membrane en utilisant la combinaison d'un laser infrarouge et ultraviolet sont discutés.

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