Name: Microdissection laser des Drosophile Neurones périphériques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Découvrez la microdissection laser pour isoler des neurones périphériques de Drosophila à partir de larves de troisième stade. Cette méthode permet d'obtenir de l'ARN de haute qualité pour des analyses moléculaires.

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Nous remercions les Drs. Yuh-Nung Jan et Wes Grueber pour fournir des stocks volantes utilisées dans cette étude, et Virginia Espina, Dr Emanuel Petricoin et le Dr Lance Liotta d&#39;aide à la LCM. Les auteurs remercient F. Thomas et Kate Miller Jeffress Memorial Trust pour le soutien de cette recherche (DNC) et l&#39;Université George Mason Provost s de bureau (EPRI).

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</ol>

Le protocole présentés ici décrit notre méthode optimisée pour l&#39;isolement des neurones chez la drosophile périphérique via LCM. Alors que ce protocole a été conçu LCM pour l&#39;isolement spécifique de simple, spécifiques à chaque classe ou de plusieurs neurones da drosophile de l&#39;étape de troisième stade larvaire de développement, des modifications mineures du protocole pourrait être facilement adaptée à la capture d&#39;autres types de cellules de drosophile de tous au développement...

Equipement: <ul><li> Cryostat </li><li> Tube de 50 ml conique pour la fixation de diapositives, rinçage, traitement à la trypsine et de l&#39;éthanol / déshydratation xylène </li><li> Congélateur à -80 ° C </li><li> Incubateur </li><li> PixCell IIe LCM Instrument avec Fluor 300 optique à épifluorescence optimisé pour l&#39;EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices) </li></ul>

microdissection laser des drosophile neurones périphériques

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

L&#39;arborisation dendritique (da) des neurones du système nerveux périphérique chez la drosophile (SNP) fournissent un excellent modèle dans lequel d&#39;étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents spécifiques à chaque classe 1,2 morphogenèse dendrite. Pour faciliter les analyses moléculaires des classes spécifiques de développement da neurone, il est vital d&#39;obtenir ces cellules dans une population pure. Bien que toute une gamme de cellules différentes, et tissu-spécifique des techniques d&#39;isolement d&#39;ARN existent pour les cellules de drosophile, y compris magnétiques purification cellulaire perles basée 3,4, fluorescent tri cellulaire (FACS) 5-8, et l&#39;ARN protéine de liaison des stratégies basées sur neuf, aucun des ces méthodes peuvent être facilement utilisées pour isoler une ou plusieurs classes spécifiques drosophile neurones DA avec un haut degré de précision spatiale. Microdissection par capture laser (LCM) a émergé comme un outil extrêmement puissant qui peut être utilisé pour isoler des types cellulaires spécifiques des sections de tissus avec un haut degré de résolution spatiale et de précision. L&#39;ARN obtenu à partir de cellules isolées peuvent ensuite être utilisées pour des analyses, y compris qRT-PCR et profilage de l&#39;expression biopuces dans un type cellulaire donné 10-16. À ce jour, LCM n&#39;a pas été largement appliquée dans l&#39;analyse des tissus et des cellules de drosophile 17,18, y compris les neurones DA à l&#39;étape du stade larvaire tiers de développement. Ici, nous présentons notre protocole optimisé pour l&#39;isolation des neurones DA drosophile en utilisant l&#39;infrarouge (IR) classe de LCM. Cette méthode permet la capture d&#39;unique, spécifiques à chaque classe ou de plusieurs neurones DA avec une haute spécificité et la résolution spatiale. Appariés selon l&#39;âge des larves troisième stade exprimer une HES-mCD8:: GFP 19 transgène sous le contrôle soit de la classe IV da neurone spécifique PPK-GAL4 20 conducteur ou le pan-da neurone spécifique 21-7-21 GAL4 chauffeur ont été utilisés pour ces expériences. L&#39;ARN obtenu à partir des neurones da isolé est de très haute qualité et peuvent être directement utilisés pour des applications en aval, y compris les qRT-PCR ou microréseau analyses. Par ailleurs, ce protocole LCM peuvent être facilement adaptées pour capturer d&#39;autres types de cellules de drosophile à divers stades de développement dépend du type de cellule spécifique, le modèle d&#39;expression GAL4 axée sur la GFP.

Dans cette vidéo, article, nous présentons une méthode pour isoler un ou plusieurs<em&gt; Drosophile</em&gt; Neurones DA à partir de larves du tiers utilisant la capture infrarouge (IR) classe de microdissection par capture laser (LCM). L&#39;ARN obtenu à partir des neurones isolés peuvent être facilement utilisés pour des applications en aval, y compris qRT-PCR ou microréseau analyses.

Microdissection laser des Drosophile Neurones périphériques

Les neurones à arborisation dendritique (da) du système nerveux périphérique (SNP) de la Drosophila constituent un excellent modèle pour étudier le...

La microdissection par capture au laser ou LCM s'est imposée comme un outil extrêmement puissant permettant d'isoler des types cellulaires spécifiques à partir de sections tissulaires avec une résolution spatiale et une précision élevées. Ici, la LCM est utilisée pour disséquer des neurones périphériques à partir de larves de troisième stade oph. Les larves de troisième stade sont incluses dans un moule cryogénique, congelées, puis un cryostat est utilisé pour couper des sections tissulaires en série, qui sont placées sur des lames en verre, décongelées et fixées dans de l'éthanol à 70 %.Les lames sont ensuite incubées avec de la tripsine afin d'éliminer les cuticules larvaires résiduelles, puis déshydratées par un gradient d'éthanol et clarifiées au xylène. Ensuite, un capuchon de microdissection laser (LCM) est placé sur la section tissulaire et des cellules neuronales fluorescentes spécifiques sont capturées à l'aide d'un laser pulsé. Enfin, l'ARN est isolé à partir des cellules capturées pour des applications ultérieures telles que la RT-PCR quantitative ou des analyses par puces à ADN.Bonjour, je suis Dan Cox du Département de biologie moléculaire et de microbiologie et de l'Institut Krasnow pour les études avancées de l'Université George Mason. Bonjour, je suis Ish AER du laboratoire du Dr Dan Cox. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'isolement cellulaire et de purification d'ARN de neurones périphériques individuels ou multiples de drosophile à l'aide de la microdissection par capture laser.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la morphogenèse du taux DIN spécifique à la classe. Commençons donc. Toutes les procédures montrées dans cette vidéo sont réalisées dans des conditions strictement exemptes d'ARN, conformément aux procédures standard.Commencez ce protocole en collectant 30 à 40 mouches âgées. Larves de troisième stade. Lavez les larves dans de l'eau doublement distillée.Rincez brièvement pour éliminer les ARN, puis effectuez un autre lavage dans de l'eau doublement distillée. Pour éliminer les ARN, utilisez un essuie-tout propre pour absorber complètement tout excès d'eau. Ensuite, prenez un moule propre pour l'inclusion de tissus et ajoutez une fine couche de OCT.Placer le moule sur un bloc de glace pour refroidir à zéro degré Celsius. À l’aide de pinces, placer les larves propres et l’OCT froid. La basse température de l’OCT contribuera à réduire les mouvements des larves.Pendant le processus d'encapsulation, disposer les larves parallèlement les unes aux autres. Une fois les larves disposées, remplir lentement le moule avec du OCT sans les déranger. Ensuite, congeler rapidement.Congelez le moule en le plaçant sur de la glace sèche. Cela garantira que la larve soit disposée selon un seul plan, ce qui maximisera le nombre de cellules disponibles par section. À l'aide d'un cryostat.Découper des sections congelées d'une épaisseur de cinq à huit micromètres sur des lames en verre microscopiques non chargées, sans ARN, clairement étiquetées. Conserver les lames sur de la glace sèche, puis les transférer à moins 80 degrés Celsius jusqu'au moment de la microdissection. Toutes les solutions destinées à la déshydratation doivent être préparées fraîchement avant chaque séance de LCM.La déshydratation complète de coupes de tissu larvaire congelées est essentielle pour obtenir une efficacité optimale de la microdissection. Retirez les lames contenant les coupes de tissu larvaire congelées du congélateur à moins 80 degrés Celsius et placez-les sur de la glace sèche. Retirez une seule lame de la boîte à lames et placez-la immédiatement dans un tube conique de 50 millilitres rempli d'éthanol à 70 % pendant trois à dix secondes.Ensuite, rincez la lame dans un tube conique de 50 millilitres rempli d'eau doublement distillée exempte d'ARN pendant cinq à dix secondes afin d'éliminer la cuticule des sections tissulaires, qui pourrait interférer avec la capture par microdissection laser. Ajoutez délicatement 50 microlitres de trypsine à 2,5 % directement sur la section tissulaire et incubez de cinq à trente secondes à température ambiante. Rincez brièvement les sections dans un tube conique de 50 millilitres contenant de l'eau doublement distillée exempte d'ARN pour éliminer la trypsine et les fragments de cuticule éventuellement encore adhérents. Terminez le processus de déshydratation en immergeant successivement les lames dans les solutions suivantes.70 % éthanol, 95 % éthanol, 100 % éthanol, 100 % éthanol, 100 % xylène. Et enfin, une fois de plus dans du xylène à 100 %. Après la déshydratation, séchez complètement les lames sous un courant d'air doux pendant 60 à 120 secondes à température ambiante.Si possible, effectuez la microdissection dans une pièce à humidité contrôlée afin d'éviter toute réduction de l'efficacité due à une humidité accrue. Commencez par allumer l'alimentation du microscope et de la boîte de commande du laser. Chargez les capuchons dans votre support de capuchons avec des capuchons H-S-L-C-M.Chaque capuchon peut capturer de nombreux corps cellulaires. Ensuite, ouvrez le logiciel des dispositifs moléculaires et saisissez les détails de l'expérience, notamment le numéro de lame et les numéros de lots des capuchons. Placez la lame contenant les sections de tissu larvaire sur la platine du microscope pour la microdissection.Chargez un nouveau capuchon HS LCM depuis la cartouche sur l'instrument P cell two ELCM et positionnez-le correctement par rapport au joystick afin d'assurer un alignement adéquat du capuchon par rapport à la zone de capture. Repérez les cellules marquées par fluorescence dans les lignées rapporteuses transgéniques PPK GAL four U-A-S-M-C-D eight GFP ou 21 7 G four UASM CD eight GFP. Les neurones d'arborisation dendritique, ou neurones DA, du système nerveux périphérique peuvent être facilement identifiés par la fluorescence GFP. Pour maximiser la spécificité, sélectionnez les cellules présentant un signal fluorescent intense et un chevauchement cellulaire minimal.Ensuite, ajustez les paramètres de puissance et de durée de l'impulsion laser afin d'obtenir une tache précise de polymère fondu dont la taille correspond à la taille de spot laser sélectionnée pour la microdissection de neurones DA de classe unique. Les réglages suivants sont recommandés : diamètre du spot de 7,5 micromètres, intensité laser de 30 à 50 milliwatts, durée laser de deux à quatre millisecondes, et une à deux impulsions par cellule.Les paramètres du laser peuvent varier en fonction du type de tissu, de l'épaisseur du tissu et du type de capot de MAC utilisé. En fin de compte, les paramètres du laser nécessitent des tests empiriques pour obtenir des résultats optimaux de capture. Ensuite, soumettez le tissu à la MAC.Lors de la microdissection au laser (LCM), le capuchon est placé au-dessus de la zone d'intérêt et d'un laser infrarouge de faible puissance. Une impulsion est dirigée à travers le capuchon vers un fin film polymère thermo-lab situé au-dessus de la ou des cellules cibles. Lorsque l'impulsion laser est émise, le film s'adoucit, adhère aux cellules cibles, puis se re-solide en maintenant les cellules d'intérêt fixées à sa surface.Lorsque le capuchon est soulevé à partir de la section tissulaire, la ou les cellules sont microdisséquées à partir du tissu environnant afin de capturer davantage de cellules dans un nouveau champ, puis le processus est répété. Une fois que les cellules d'intérêt ont été capturées, soulevez le capuchon de la microdissection laser assistée par microscope (LCM) et placez-le sur une lame propre afin de confirmer la présence des cellules capturées et l'absence de cellules indésirables ou de débris. Observez le capuchon LCM à l'aide d'une illumination en fluorescence et en lumière transmise.Fixez le bouchon contenant les cellules microdisséquées à votre appareil d'extraction. Ajoutez ensuite 12 microlitres de tampon d'extraction d'ARN sur la surface du bouchon et connectez un tube à réaction à paroi mince inversé comme illustré ici. Placez l'ensemble sur un plateau d'alignement et recouvrez-le d'un bloc d'incubation préchauffé.Ensuite, placer le plateau dans un incubateur à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes après l'incubation au centrifugeuse. Placer les tubes contenant les extraits à 800 fois la gravité pendant deux minutes. Après avoir retiré les tubes de la centrifugeuse, les refermer et conserver les extraits cellulaires à −80 degrés Celsius jusqu'au moment de purifier l'extrait d'ARN et de procéder à la purification sur colonne de l'ARN.Selon les instructions du kit d'extraction d'ARN pico pure, le traitement de l'ADN est facultatif et peut être effectué sur colonne pendant la purification de l'ARN si nécessaire. Une fois l'ARN purifié, le conserver à moins 80 degrés Celsius. La microdissection par capture au laser a été utilisée pour isoler des neurones DA spécifiques d'une classe unique ou multiples de drosophile à partir de larves de troisième stade.La microdissection laser permet un degré élevé de précision et de spécificité dans l'isolement des corps cellulaires des neurones D de drosophile. On voit ici une image représentative d'une section tissulaire de huit microns déshydratée et traitée à la tripsine. Avant d'effectuer la microdissection laser, deux neurones DA de classe quatre sont marqués avec la GFP.La flèche indique le neurone mis en évidence pour la capture. Le corps cellulaire du neurone mis en évidence est microdisséqué proprement avec une grande spécificité à partir de la section tissulaire. L'insecte montre une vue endone d'un unique neurone DA de classe quatre capturé sur le capuchon de microdissection laser (LCM).L'ARN total purifié à partir des neurones DA isolés s'est révélé d'excellente qualité, comme en témoigne la présence de pics nets des ARN ribosomiques 5,8S et 28S lors de l'analyse sur un bioanalyseur Agilent 2100. Une PCR quantitative en temps réel avec transcription inverse a été réalisée pour évaluer l'enrichissement spécifique neuronal à l'aide du marqueur génique spécifique aux neurones Lev, selon la méthode du delta delta CT. Un enrichissement supérieur à 2,5 fois au niveau de l'expression de Lev a été observé dans les neurones DA capturés par microdissection laser par rapport à l'animal entier.Nous venons de vous montrer comment isoler et purifier l'ARN à partir de neurones Joss ou périphériques par microdissection par capture laser. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'optimiser la concentration en trypsine et le temps de digestion en fonction du tissu à microdissecter et de l'épaisseur des sections. Des temps d'incubation plus longs peuvent entraîner la perte des cellules d'intérêt à partir des sections tissulaires, tandis qu'un temps d'incubation trop court peut s'avérer insuffisant pour éliminer la cuticule larvaire, ce qui compromet l'efficacité de la microdissection par capture laser (LCM).Il est important que toutes les solutions de déshydratation des tissus soient préparées fraîchement. De plus, afin d'éviter d'endommager le polymère du capuchon de microdissection laser, le xylène doit être complètement évaporé avant la microdissection. Enfin, pour préserver l'intégrité de l'ARN des cellules purifiées, il est essentiel de maintenir des conditions favorables à la préservation des ARN tout au long de la procédure.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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In Vivo Simple-molécule suivi du terminal de nerf moteur présynaptique Drosophila

Ici, nous décrivons la méthode que nous avons employée pour imager la filodose dendritique fortement motivoir dans une préparation en direct du cerveau larvaire de Drosophila, et le protocole que nous avons développé pour quantifier des ensembles de données d'imagerie 3D de time-lapse pour des évaluations quantitatives du dendrite dynamique dans le développement des neurones.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-

Nous décrivons une méthode pour le traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires de Drosophila utilisant des colorants fluorescents lipophiles.

Traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires drosophila à l'aide de colorants fluorescents lipophiles

Nous présentons ici un protocole détaillé pour visualiser les réseaux de microtubules dans les jonctions neuromusculaires et les cellules musculaires. Combiné aux puissants outils génétiques de Drosophila melanogaster, ce protocole facilite grandement le criblage génétique et l’analyse de la dynamique des microtubules pour le rôle des protéines régulatrices du réseau de microtubules dans le système nerveux.

Utilisation de la jonction neuromusculaire larvaire de drosophile et des cellules musculaires pour visualiser le réseau de microtubules

Ce protocole démontre l’ablation cellulaire au laser de neurones individuels chez des larves de drosophile intactes. La méthode permet d’étudier l’effet de la réduction de la compétition entre les neurones du système nerveux en développement.

L’ablation cellulaire au laser chez des larves de drosophile intactes révèle une compétition synaptique

Découvrez la microdissection laser pour isoler des neurones périphériques de Drosophila à partir de larves de troisième stade. Cette méthode permet d'obtenir de l'ARN de haute qualité pour des analyses moléculaires.

Microdissection laser des Drosophile Neurones périphériques

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