Préparation pulmonaire de souris pour la cytométrie en flux : génération d’une suspension cellulaire à partir de tissu pulmonaire pour l’analyse par cytométrie en flux

- Commencez par prendre une souris euthanasiée et fixez-la sur une planche de dissection avec du ruban adhésif de laboratoire. Utilisez des ciseaux pour ouvrir la peau. Faites une incision verticale à travers le diaphragme et coupez les côtes pour atteindre la cavité thoracique, exposant le cœur et les poumons. Ensuite, faites une petite incision dans le ventricule gauche du cœur. Par la suite, localisez le ventricule droit et insérez une seringue contenant du PBS dans la lumière du ventricule. Perfuser le PBS à travers le ventricule droit, laissant le sang s’écouler de l’incision prédéfinie au ventricule gauche jusqu’à ce que les poumons deviennent blancs. Retirez le tissu pulmonaire contenant les nodules tumoraux et coupez-le en petits morceaux.

Incuber les morceaux dans le tampon de digestion pulmonaire. La collagénase dans le tampon de digestion pulmonaire aide à isoler les cellules, et l’ADN aide à éliminer l’ADN des cellules mortes. Filtrez la suspension résultante à travers une crépine cellulaire pour éliminer les grumeaux et uniformiser la suspension cellulaire. Centrifugez et mettez à nouveau en suspension la pastille dans le tampon de chlorure d’ammonium et de potassium pour lyser les érythrocytes résiduels. Centrifugeuse pour collecter les globules blancs et les cellules tumorales dans la pastille. Remettre en suspension la pastille dans du PBS complété par du FCS, pour maintenir la stabilité de la cellule. Dans le protocole suivant, nous démontrerons la préparation de la suspension de cellules pulmonaires pour l’analyse cytométrique en flux.

Une fois le paramètre expérimental approprié, tremper la carcasse dans de l’éthanol à 70 % et fixer l’animal à une planche de dissection. Faites une incision médiane ventrale et retournez doucement la peau pour exposer les muscles de la paroi thoracique et les organes abdominaux. Utilisez des ciseaux pour percer le diaphragme et couper les côtes exposant la cavité thoracique. Découpez une petite ouverture dans le ventricule gauche et utilisez une aiguille de calibre 27 pour perfuser le poumon trois fois à travers le ventricule droit avec 6 à 8 millilitres de PBS glacé par perfusion. Après la dernière perfusion, les poumons doivent être complètement débarrassés du sang et apparaître blancs. Après la récolte, utilisez des ciseaux pour hacher le tissu pulmonaire en petits morceaux.

Transférez les fragments pulmonaires dans un tube de microcentrifugation de 2 millilitres contenant 1,5 millilitre de tampon de digestion pulmonaire pour une incubation de 30 à 60 minutes à 37 degrés Celsius en secouant. À la fin de la digestion, transférez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 microns dans un tube de 50 millilitres, et utilisez l’extrémité d’un piston de seringue stérile de 10 millilitres pour presser tous les fragments de tissu restants à travers le filtre. Rincez la passoire avec 15 millilitres de PBS complété par 2 % de FCS, et récupérez les cellules par centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans 1 millilitre de tampon de lyse potassique de chlorure d’ammonium pour une incubation de 5 minutes à température ambiante, et centrifugez à nouveau les cellules. Ensuite, remettre en suspension la pastille de globule blanc dans 1 millilitre de PBS complété par 2 % de FCS, et colorer les cellules pour l’analyse cytométrique en flux selon le protocole expérimental.