Réponse chimiotactique des micro-organismes marins à l'échelle micro nutriments des couches

Bonjour, je m'appelle Marcos. Je travaille avec le professeur Roman Stalker au département de génie civil et environnemental du MIT, et je vais vous montrer comment fabriquer un microcanal en utilisant la technique de la lithographie par auto-photographie. Pour commencer, nous devons concevoir un masque.

Voici donc le masque, qui correspond essentiellement au design final du microcanal que nous souhaitons réaliser. Il s'agit du design d'un injecteur, permettant de créer une fine couche de nutriment dans laquelle des micro-organismes peuvent nager, afin d'observer leur chimiotaxie. Ceci est un canal latéral menant à une cavité destinée à générer un micro-vortex à l'intérieur de cette cavité. Une vidéo montrera ultérieurement ce phénomène. Après avoir obtenu le masque, nous emmenons les plaquettes en salle blanche et les plaçons dans la boîte de Pétri. Et maintenant, nous nous rendons en salle blanche.

Très bien, après avoir fait imprimer notre masque et l'avoir préparé, nous sommes maintenant en salle blanche pour réaliser les microfabriquations proprement dites. Ce que je vais faire maintenant, c'est prendre un morceau de silicium vierge que je viens d'acheter, et je veux m'assurer qu'il est parfaitement propre en utilisant les trois solvants suivants. La première étape consiste à nettoyer avec de l'acétone, puis immédiatement avec du méthanol.

Ensuite, la dernière étape consiste en l'isopropanol. Nous travaillons sur le côté brillant de la plaquette, qui est préparé pour le revêtement. Maintenant, je vais la sécher à l'aide d'azote.

Après avoir séché la plaquette, nous la plaçons maintenant dans un four éteint à environ 130 degrés Celsius et la faisons cuire de cinq à dix minutes. Pendant ce temps, en attendant la cuisson de la plaquette, nous pouvons préparer les deux plaques chauffantes, l'une à 65 degrés Celsius et l'autre à 95 degrés Celsius. Après une cuisson de cinq minutes, nous retirons la plaquette du four et la laissons reposer à température ambiante pendant environ cinq minutes.

Ensuite, nous sommes prêts pour le dépôt par centrifugation. Avant de verser la résine photosensible, nous devons simplement nous assurer qu'aucune particule de poussière n'est présente à sa surface ; nous utilisons de l'azote pour la pulvériser sur la tranche. Le mouvement de pulvérisation va du centre vers l'extérieur.

Je vais maintenant verser la résine photosensible sur ce wafer. Nous déposons une quantité d'environ trois millilitres. Essayez de maintenir le flacon aussi bas que possible afin d'éviter la formation de bulles lors du versement de la résine photosensible sur le wafer.

Laissons maintenant la résine photosensible reposer sur la plaquette pendant environ une minute avant de commencer à la faire tourner. Et comme je l'ai mentionné, je vais obtenir un revêtement d'une épaisseur de cent micromètres. Nous réglons donc le temps total de rotation à 55 secondes et nous pouvons commencer la centrifugation.

Tout d'abord, nous essayons d'augmenter progressivement la vitesse de rotation de zéro à 500 tr/min en cinq secondes, puis de laisser tourner environ 10 secondes afin de constater que la résine photosensible recouvre entièrement la plaquette. Ensuite, nous augmentons la vitesse jusqu'à 3000 tr/min pendant environ sept secondes et laissons tourner pendant 30 secondes. Après avoir recouvert la plaquette de résine photosensible, je place maintenant la plaquette sur la plaque chauffante et je la pré-cuis à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis à 95 degrés Celsius pendant 20 minutes. Une fois la pré-cuisson à 95 degrés Celsius terminée, nous laissons refroidir jusqu'à la température ambiante, mais auparavant, nous ramenons la température à 65 degrés Celsius pendant environ deux à trois minutes afin d'éviter une diminution trop rapide de la température.

Ensuite, nous le laissons à température ambiante pour refroidir pendant environ cinq minutes. Maintenant, je vais l'exposer à la lumière UV afin que la partie exposée durcisse, tandis que la partie non exposée sera éliminée par lavage ultérieurement. C'est à ce stade que nous utilisons le masque, et comme vous pouvez le voir, le masque comporte deux parties : une partie transparente et une autre partie complètement opaque ou noire dans ce dispositif.

Je vais donc placer ce masque au-dessus de la plaquette revêtue. Le masque que vous recevez de la société d'impression possède deux faces. L'une est celle sur laquelle ils impriment avec l'encre.

Et ceci est un site que vous souhaitez mettre en contact avec la plaquette. Maintenant, je vais exposer la plaquette à travers le masque avec une lumière UV. Et par mesure de sécurité, je vais porter ces lunettes de protection.

La durée d'exposition dépend de l'UAS que vous utilisez ainsi que de l'épaisseur que vous souhaitez obtenir. Après l'exposition, je place la tranche sur une plaque chauffante à 65 degrés et je la fais cuire à nouveau pendant cinq minutes, puis à 95 degrés Celsius pendant 20 minutes. Rappelez-vous que cette durée de cuisson varie selon l'épaisseur souhaitée et selon le type d'UAS utilisé.

À partir de ce point, nous allons révéler la plaquette. Le développement consiste à éliminer la partie indésirable de la résine photosensible afin que seule la région exposée demeure sur la plaquette. Afin de révéler la plaquette et de rincer la partie indésirable de la résine photosensible, nous utilisons un révélateur.

Dans ce cas, j'utilise l'acétate de pomélan comme révélateur et je vais verser ce solvant dans ce bécher, puis placer la plaquette et l'immerger dans le bécher pendant environ 10 minutes. Là encore, la durée varie selon l'épaisseur et le solvant utilisé. Dix minutes plus tard, on peut constater que ce qui reste sur la plaquette correspond au motif du canal souhaité, tandis que toutes les parties indésirables ont été éliminées ; il suffit maintenant de rincer légèrement.

Nous utilisons le même solvant, un solvant frais, le même acétate de polyvinyle, et nous en projetons simplement sur le dessus de la plaquette afin de la rincer. Enfin, pour éliminer le solvant, nous utilisons de l'isopropanol et rinçons simplement. Puis nous séchons le tout à l'air azoté.

Et maintenant, vous disposez d'une plaquette propre présentant le motif souhaité. Nous appelons cela le « master ». Nous retournons maintenant à notre laboratoire pour y verser du PDMS et poursuivre le reste de la procédure.

Nous revenons maintenant de la salle propre et nous avons obtenu le « master », qui constitue essentiellement le moule pour ce que nous allons réaliser. Ce que nous allons faire ensuite, c'est verser du PDMS, un polymère qui va durcir. Comme vous pouvez le voir, si nous déposons un polymère sur ce moule, le polymère présentera des sillons à sa surface, et une fois assemblé à une lame de verre, ce polymère formera lui-même le canal.

Nous allons maintenant préparer le PDMS. Voici le PDMS, qui est le polymère, le polydiméthylsiloxane PDMS. Et voici l'agent de réticulation.

Je vais verser cet agent de réticulation dans ce gobelet et je vais verser ce PDMS dans ce gobelet, puis les mélanger selon un rapport de un pour dix. Nous utilisons généralement une baguette pour bien homogénéiser le mélange. En remuant, nous générons de nombreuses bulles, qui servent d'indication pour savoir si le mélange a été correctement agité ou non.

À présent, après avoir mélangé le PDMS avec l'agent de réticulation, nous sommes prêts à verser ce mélange sur le master, qui est une plaquette. Afin de s'assurer que la plaquette ne bouge pas pendant le versement, nous l'avons fixée à l'aide d'un ruban adhésif. Avant de verser le mélange de PDMS sur la plaquette, nous souhaitons rendre celle-ci aussi propre que possible, en éliminant la poussière qui pourrait s'être déposée à sa surface.

Nous allumons donc le compresseur pour souffler sur la plaquette. Bon, vous pouvez voir que le PDMS contient beaucoup de bulles. Nous allons donc éliminer les bulles en plaçant ceci à l'intérieur d'une chambre à vide.

Ainsi, le pompage sous vide prend environ 30 minutes pour éliminer toutes les bulles. Une fois que nous avons terminé de retirer les bulles, nous retirons cet élément et le plaçons dans un four à 65 degrés Celsius pour une cuisson d'au moins 12 heures. Et douze heures plus tard, la plaquette sera prête à être découpée.

Je vais utiliser ce couteau pour découper le PDMS et retirer le PDMS de la plaquette, puis utiliser ce poinçon pour percer les trous destinés aux entrées et sorties du tube. Lorsque vous découpez, vous devez insérer votre couteau jusqu'à ce qu'il touche la plaquette, mais n'appliquez pas trop de pression afin de ne pas casser la plaquette, et découpez tout autour de votre canal. Maintenant, décollez-le.

Vous avez donc, maintenant vous pouvez voir que ce canal correspond au motif provenant de la tranche. Vous pouvez ainsi constater qu'ils sont identiques. Ce motif a maintenant été gravé sur ce polymère, le PDMS.

Et une fois qu’ils auront lié ceci à une lame de verre, cela constituera le canal pour notre expérience. L’étape suivante, qui est importante, consiste à se rappeler de percer des trous afin que nous puissions insérer des entrées et des sorties dans les microcanaux, après avoir percé les trous dans les microcanaux du PDMS. Nous avons donc utilisé du ruban adhésif pour coller le côté du canal, là où se trouve l’entaille, et le fixer.

Et la raison pour laquelle nous collons ce canal avec du ruban adhésif est de retirer toutes les particules de poussière. L'étape suivante est donc la liaison par plasma. Et avant la liaison par plasma, que nous effectuerons dans un autre laboratoire, nous allons retirer le ruban et exposer la surface que nous souhaitons lier, c'est-à-dire cette surface et la lame de verre, puis les exposer au plasma d'oxygène, et ensuite les assembler, ce qui provoquera leur liaison.

Bonjour, je m'appelle Justin Seymour et je suis chercheur postdoctoral dans le laboratoire de Roman Stocker au MIT. Mes recherches portent sur l'écologie microbienne, plus précisément sur la manière dont les micro-organismes marins parviennent à localiser des zones riches en nourriture dans l'océan. Nous utilisons des techniques de microfluidique pour étudier ces types de comportements.

Nous allons donc utiliser le canal dont Marcus a montré la fabrication précédemment, et après le collage par plasma, nous sommes libres d'utiliser celui-ci dans une expérience de microfluidique. Avant cette expérience, nous devons préparer les substrats que nous allons utiliser.

Et dans l'expérience d'aujourd'hui, nous allons examiner comment le phytoplancton marin Donella tur electro parvient à localiser des zones alimentaires à micro-échelle. Dans ce cas, il s'agit d'ammonium, et nous allons lui fournir une concentration de cent micromoles par litre d'ammonium. Ainsi, dans ces expériences, nous sommes en mesure de visualiser les zones de nourriture en ajoutant une substance fluorescente aux nutriments que nous leur fournissons.

Nous utilisons donc un colorant fluorescéine. Ici, je pipette de la fluorescéine à une concentration finale de 100 micromolaire dans l'ammonium, que nous utilisons comme nutriment. Nous pouvons alors visualiser ce nutriment en microscopie à fluorescence, ce qui nous permet d'observer la diffusion d'un patch de nutriments, puis d'étudier la réponse des organismes à ce patch de nutriments.

Ainsi, dans les expériences de microfluidique, nous utilisons des seringues en verre. La première étape consiste donc à ajouter nos substrats et organismes dans les seringues que nous allons utiliser. L'étape suivante consiste à insérer le tube dans le dispositif microfluidique.

Nous effectuons cette étape sur la platine du microscope. Nous plaçons donc notre canal microfluidique sur la platine du microscope, puis insérons des tubulures dans les entrées et les sorties. Ensuite, nous insérons un réservoir de déchets et nous nous assurons qu’il est rempli à moitié de liquide afin que la tubulure dans le réservoir de déchets soit complètement immergée.

Cela nous permet de maintenir une pression constante dans le canal. Nous raccordons ensuite des seringues au tube qui alimente le canal de microfluidique contenant les organismes, ici donella, lector, et le substrat nutritif, ici l'ammonium. Nous mettons ensuite en place le microscope et observons le canal de microfluidique dans la position appropriée avant de commencer les expériences.

Une fois que le canal est en position, nous passons alors à la visualisation du canal à l’aide de la caméra et nous pouvons le voir sur l’ordinateur. Nous pouvons maintenant effectuer des réglages plus fins grâce à la mise au point et visualiser l’injecteur par lequel nous introduisons les nutriments. Celui-ci est constitué d’une pointe d’aiguille filaire de 100 micromètres intégrée au canal de microfluidique.

Nous pouvons produire un gradient de nutriments en les injectant. À partir de ce stade et avant de commencer les expériences, nous devons éliminer toutes les bulles qui auraient pu pénétrer dans le système de microfluidique. Pour ce faire, nous utilisons une seringue remplie d'eau de mer artificielle dans ce cas précis, que nous pouvons raccorder au canal de microfluidique via une vanne.

Nous poussons ensuite cette seringue pour éliminer les bulles du canal. Nous pouvons supprimer les bulles de deux manières : soit en les expulsant par la pression générée par la seringue vers la sortie, soit en les forçant à traverser les parois du matériau PDMS, qui est perméable aux gaz. Une fois les bulles éliminées et lorsque nous sommes prêts à commencer l'expérience, nous réglons les débits appropriés pour l'injection et l'introduction des matériaux dans le canal à l'aide d'une pompe à seringue.

Dans ce cas, nous utilisons un débit de deux microlitres par minute, ce qui équivaut à un débit dans le canal de 266 micromètres par seconde. Une fois le débit approprié réglé, nous pouvons alors commencer l'expérience en lançant l'écoulement, ce qui crée une fine bande de nutriments. Nous pouvons ainsi visualiser les nutriments lorsqu'ils sont injectés dans le canal à partir du point d'injection en ajoutant un colorant fluorescéine aux nutriments et en les observant au microscope à fluorescence APF. Nous pouvons ensuite étudier la dynamique des parcelles en arrêtant l'écoulement dans le canal de microfluidique et en observant la diffusion latérale de la bande de nutriments depuis leur position initiale.

Nous passons ensuite à la microscopie en contraste de phase afin de visualiser les organismes nageant dans le canal et d'observer leur position par rapport au patch de nutriments. Nous pouvons réaliser cela en acquérant une séquence d'images à une fréquence de 10 images par seconde, ce qui produit une vidéo dans laquelle nous pouvons observer ces organismes. Nous pouvons alors visualiser les organismes en déplacement en calculant la différence temporelle entre deux images consécutives, où une image est soustraite de l'image précédente, de sorte que seuls les objets en mouvement soient visibles.

Ainsi, nous pouvons éliminer le bruit de fond des images. Ensuite, nous enregistrons des vidéos à intervalles réguliers pendant 10 à 20 minutes après la libération initiale du patch nutritif. En utilisant un logiciel d'analyse d'image pour superposer les positions des organismes d'une image à l'autre dans la séquence, nous pouvons examiner les changements de position de ces organismes afin d'obtenir des informations sur leurs trajectoires de nage, à partir desquelles nous pouvons ensuite extraire des données plus détaillées sur leurs statistiques de nage, notamment les vitesses et les changements de direction.

Ces expériences nous ont donc permis, pour la première fois, d'examiner directement comment les micro-organismes marins parviennent à détecter et à tirer parti de poches de nutriments à l'échelle microscopique. Cela pourrait avoir des implications importantes pour les dynamiques trophiques et le recyclage des nutriments dans l'océan. En lien avec ce qu'a mentionné Justin, la manière dont les micro-organismes, en particulier les bactéries, interagissent avec leur nourriture dans l'océan peut avoir de nombreux effets sur les cycles biochimiques.

Or, l'océan est très dynamique, ce qui n'est pas pris en compte, et il existe de nombreuses conditions d'écoulement telles que la turbulence, générée par le vent ou à la surface. À l'échelle des micro-organismes, ce qu'ils subissent, ce qu'ils expérimentent, n'est pas vraiment la grande turbulence, mais plutôt le cisaillement, et les plus petits résidus de turbulence sont connus sous le nom de tourbillons de Kolmogorov. Ce que nous cherchons à faire ici, c'est comprendre, ce que nous voulons étudier, quels sont les effets de ces tourbillons sur le comportement d'agrégation des micro-organismes.

Pour ce faire, nous créons un autre canal en utilisant cette masse que je vous ai montrée précédemment. Il existe une cavité au centre. Permettez-moi simplement de la dessiner afin d'agrandir le schéma.

Ainsi, voici à quoi ressemble le canal : nous avons ici la vue que nous obtenons depuis le haut, et nous injectons l'écoulement de la gauche vers la droite ; en raison du cisaillement, cela génère une zone de recirculation à l'intérieur de cette cavité. Cette cavité représente une enduit graph Addis. Nous pouvons simplement utiliser le même dispositif que Justin a déjà expliqué précédemment. Lorsque la pompe à seringue est éteinte, et que je n'ai activé aucun écoulement, vous pouvez observer que les bactéries nagent de manière assez aléatoire et libre à l'intérieur de cette cavité.

Et il n’existe aucune orientation privilégiée. La vidéo que vous voyez est une vidéo de différence temporelle, qui utilise exactement la même technique que celle employée par Justin. Ainsi, lorsque l’écoulement est très rapide, comme vous pouvez le constater, les bactéries sont entraînées loin par le vortex.

Et la trajectoire des bactéries elles-mêmes suit les lignes de courant du vortex. Mais ce qui est en réalité plus intéressant, c'est ce qui suit lorsque nous activons la pompe à seringue. Toutefois, la vitesse n'est pas très élevée.

Il ne va pas trop vite au point que les bactéries ne puissent pas lutter contre lui. Mais d'une certaine manière, on peut encore observer assez clairement une ressemblance avec un vortex dans ce film. Ainsi, grâce à cette expérience, nous avons appris qu'en présence d'un écoulement très fort et turbulent, les bactéries sont à la merci de l'écoulement et ne parviennent pas à s'y opposer.

Toutefois, dans une région de turbulence modérée, ils sont encore capables de nager selon leur propre volonté.