Coloration immunofluorescente des sphéroïdes : une technique pour analyser les sphéroïdes pour l’expression de l’expression intra- et extracellulaire de l’antigène

- Les sphéroïdes sont des modèles de culture cellulaire in vitro tridimensionnels. Pour la coloration immunofluorescente, générez d’abord une culture de sphéroïdes du type cellulaire requis dans une plaque multipuits. À l’aide d’une micropipette à pointe à large orifice, prélevez les sphéroïdes en prenant soin d’éviter les ruptures dues aux forces de cisaillement.

Ensuite, fixez et perméabilisez les sphéroïdes pour rendre les cellules individuelles perméables. Maintenant, incubez avec une solution contenant des protéines pour bloquer les sites d’interaction protéiques non spécifiques à la surface de la cellule. Traitez les sphéroïdes avec un cocktail d’anticorps primaires souhaité. Incuber pour que les anticorps se lient aux molécules cibles à la surface de la cellule.

Ensuite, marquez les sphéroïdes avec une solution d’anticorps secondaires marquée par fluorescence spécifique aux anticorps primaires. Enfin, traitez les sphéroïdes avec un colorant fluorescent de liaison à l’ADN approprié pour colorer les noyaux cellulaires. À l’aide d’un microscope à fluorescence à balayage laser, imagez plusieurs sections efficaces optiques du sphéroïde dans différents plans optiques.

Les images capturées reflètent des noyaux et des antigènes d’intérêt marqués par fluorescence. Fusionnez les piles à l’aide d’un logiciel approprié pour obtenir l’image composite finale du sphéroïde 3D. Dans le protocole suivant, nous effectuerons une coloration immunofluorescente de sphéroïdes de fibroblastes pancréatiques et de fibroblastes associés au cancer cultivés en présence d’un stimulant, le TGF bêta-1.

- Tout d’abord, coupez l’extrémité d’une pointe de pipette pour agrandir l’orifice. Une fois l’incubation terminée, utilisez cette pointe de pipette coupée pour collecter les sphéroïdes dans un tube de réaction de 1,5 millilitre, selon les conditions expérimentales ou par protéine à analyser. Centrifugez les sphéroïdes à 1 000 fois g pendant environ 30 à 60 secondes. Retirez soigneusement le surnageant contenant de la méthylcellulose par pipetage, en veillant à ne pas déranger les sphéroïdes granulés.

- Une attention particulière doit être prise lors du transfert des sphéroïdes dans les tubes réactionnels. Assurez-vous de ne pas avoir de forces de contrainte de cisaillement en coupant la pointe. Il est également important que vous collectionniez tous les sphéroïdes. Pendant l'étape de lavage, assurez-vous de ne pas perdre les sphéroïdes par aspiration.

- Pour laver les sphéroïdes à 50 microlitres de 1X PBS, centrifugez à 1 000 fois g pendant 30 à 60 secondes, puis retirez soigneusement le PBS par pipetage. En fonction de la protéine à colorer, fixez les sphéroïdes soit avec 50 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 20 minutes à température ambiante.

Lavez les sphéroïdes avec du PBS comme décrit précédemment. Perméabiliser les cellules avec 0,1 % de Triton X dans du PBS pendant 4 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les sphéroïdes dans du PBS trois fois, comme décrit précédemment. Ajoutez du PBS contenant 5 % de FBS et 2 % de BSA aux sphéroïdes et incubez à température ambiante pendant une heure pour bloquer les sites d’interaction protéique non spécifiques.

Maintenant, incubez les sphéroïdes avec 30 microlitres d’anticorps primaires dans du PBS avec 2,5 % de FBS et 1 % de BSA à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, lavez les sphéroïdes dans PBS trois fois comme décrit précédemment.

Après cela, incubez les sphéroïdes avec 30 microlitres d’anticorps secondaires dans du PBS avec 2,5 % de FBS et 1 % de BSA à température ambiante pendant 90 minutes. Lavez les sphéroïdes dans du PBS trois fois comme décrit précédemment.

Ensuite, incubez les cellules avec 30 microlitres de solution de coloration DAPI pendant 4 minutes à température ambiante. Lavez les sphéroïdes dans le PBS une fois comme décrit précédemment. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, placez les sphéroïdes sur une lame de verre dans une goutte de PBS. À l’aide d’un microscope à balayage laser, imagez les sphéroïdes par microscopie à fluorescence à un grossissement de 10 fois. Prenez différentes sections optiques du sphéroïde à différents plans optiques d’un empilement Z.