Modèles expérimentaux pour l'étude de la physiologie épithélium pigmentaire rétinien et physiopathologie

L'objectif général de cette procédure est de générer des cultures de pigment épithélial rétinien, ou RPE, fœtal humain pouvant être utilisées comme modèle. Dans les études sur les maladies oculaires humaines, les tissus sont reçus de donneurs sous forme de globes oculaires intacts. La première étape de la procédure consiste à retirer les muscles et tissus conjonctifs excédentaires, puis à ouvrir l'œil en enlevant la cornée et le cristallin.

L'œil est traité avec du dispa et aplati, puis la monocouche de RPE est décollée de la choroïde. Le RPE isolé est semé dans des flacons et cultivé pendant plusieurs semaines jusqu'à l'obtention de monocouches confluentes et au développement de pigments. Les cultures cellulaires sont utilisées dans des expériences fonctionnelles in vitro.

Des expériences in vitro réussies sont répétées chez des modèles animaux d'essais précliniques, où les réponses des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (RPE) peuvent être mieux évaluées dans des environnements de signalisation plus complexes. Le modèle décrit ici permettra une meilleure compréhension de la physiologie des RPE et le développement de nouvelles interventions thérapeutiques pour traiter les maladies oculaires. Bonjour, je m'appelle Sheldon Miller.

Mon laboratoire est situé à l'Institut national de la santé oculaire, qui fait partie des Instituts nationaux de la santé sur le campus de Bethesda dans le Maryland. Bonjour, je suis Arki du laboratoire Miller. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour préparer des cultures primaires de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes fœtales humaines.

Ces cellules seront préparées sous forme de monocouches confluentes pouvant être montées dans des chambres de type Ussing modifiées. Nous utiliserons également ces cellules RPE humaines isolées pour des études en biochimie et en génétique. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire afin d'établir des cultures primaires de cellules épithéliales pour étudier la fonction et la régulation des processus physiologiques et physiopathologiques, ainsi que pour développer des modèles animaux cliniques de maladies.

Nous nous concentrons sur l'épithélium pigmentaire rétinien ou RPE, qui se situe à l'arrière de l'œil, séparant la rétine nerveuse et l'apport sanguin choroïdien. Ce schéma simplifié de l'œil montre l'emplacement de la couche de RPE à l'arrière de l'œil, juste adjacente aux photorécepteurs. L'encart montre les cellules de la rétine avec les photorécepteurs à droite et les cellules ganglionnaires à gauche.

Cet épithélium est extrêmement actif sur le plan métabolique. Il effectue quotidiennement une phagocytose continue des photorécepteurs, et il stocke, modifie et transporte la vitamine A, le pigment visuel, vers les photorécepteurs. Dans le cycle visuel, il agit de manière homéostatique pour maintenir la composition chimique et le volume des espaces extracellulaires environnants.

Une propriété essentielle des épithéliums est leur polarité. La livraison asymétrique continue de protéines vers les membranes apicales et latérobasales est un processus régulé qui permet à l'épithélium d'assurer le transport vectoriel de métabolites, d'ions et de fluides d'un espace extracellulaire à un autre. Cette activité aide l'épithélium à maintenir la santé et l'intégrité de la rétine nerveuse.

Le protocole in vitro que nous décrivons ici permet l'analyse des protéines de transport, des récepteurs et des voies de signalisation qui déterminent la polarité et la fonction épithéliales avant le début de la dissection. Préparez une plaque de 12 puits dans une hotte à flux laminaire avec des solutions à température ambiante. Chaque œil nécessite un puits de solution antibiotique antifongique 10 x, deux puits de PBS 1 x et un puits de deux unités par millilitre d'espace interdisque diluées dans un milieu RPE 5 % contenant du sérum. Remplissez un plat de dissection doublé de silicone avec du H-B-S-S 1 x, éliminez le liquide et transférez chaque œil dans un puits de solution antibiotique antifongique.

Incuber de trois à cinq minutes à température ambiante. Éviter d'appliquer une pression excessive sur le globe oculaire. Rincer l'œil dans deux puits successifs d'une XPBS pour éliminer l'antibiotique en excès.

Ensuite, utilisez une pince pour le transférer dans la boîte de dissection remplie d'une solution X-H-B-S-S sous un microscope stéréoscopique de dissection. Utilisez des ciseaux à iris pour retirer l'excès de muscle et de tissu conjonctif autour de l'œil. Positionnez l'œil de manière à ce que la cornée soit orientée vers le haut.

Utilisez deux aiguilles stériles de calibre 27 pour fixer l'œil par le tissu conjonctif sans endommager la sclère sur le tampon en silicone. Dans cette orientation, utilisez un couteau à orifice latéral pour pratiquer une incision à travers la sclère. La coupure doit être située au tiers de la distance entre l'équateur de l'œil et la surface antérieure.

Utilisez des ciseaux à iris pour poursuivre la coupe de manière circulaire autour de l’œil afin d’éviter d’endommager l’épithélium pigmentaire rétinien, abrégé en RPE en raison de l’attraction de la rétine par le vitré. Utilisez les mêmes ciseaux pour couper à travers le corps vitré et séparer le lambeau antérieur de l’œil de la cupule oculaire.

Soulevez la partie antérieure de l'IOA et jetez-la. Utilisez une pince pour transférer l'œil ouvert dans la cavité de la boîte de Pétri. Assurez-vous qu'il n'y ait aucune bulle d'air dans la cupule oculaire.

Incuber de 40 à 60 minutes à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Transférer l’œil depuis la coupelle de dissection vers la boîte de dissection, qui a été remplie avec du H-B-S-S à une concentration de 1 X à température ambiante. Positionner l’œil avec la cupule vers le haut et le fixer à l’aide de deux aiguilles de calibre 27.

Sous le microscope stéréoscopique, utilisez une pince fine pour soulever délicatement la rétine partiellement séparée à l’aide de ciseaux rétiniens. Détachez la rétine du nerf optique. Jetez la rétine avec les ciseaux à iris.

Pratiquer une incision depuis la périphérie de l'œil jusqu'au nerf optique. Fixer l'œil à l'aide de 5 aiguilles de calibre 27. Pour étirer la couche de l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE), utiliser des ciseaux rétiniens afin de réaliser une coupe circulaire autour du nerf optique.

Séparer la couche de l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) en passant à un grossissement de 250 x ou plus. Repérer le bord de la feuille de RPE le long de l'incision réalisée par la ciseau à iridectomie et à proximité du nerf optique. Utiliser deux paires de forceps pour séparer le RPE et la membrane de Bruch de la couche tissulaire choroidienne.

Testez plusieurs zones le long du bord coupé pour trouver l'endroit où la connexion entre l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) et la choroïde est la plus faible. Détachez délicatement la membrane pour l'enlever complètement. Placez les lambeaux de RPE dans un tube conique de 15 millilitres rempli de trips à température ambiante contenant de l'EDTA.

Lorsque toutes les feuilles sont collectées, boucher le tube, incuber les tubes dans un bain-marie pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Agiter vigoureusement le tube pour dissocier l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) en petits agrégats. L'absence d'agrégats cellulaires sombres indique que la dissociation est terminée.

Replacer le tube dans le bain-marie pendant cinq minutes supplémentaires. Utiliser un piston, une pipette et une aspiration douce pour éliminer les résidus de tissu non digérés. Centrifuger les cellules à 280 ×g pendant quatre minutes.

Éliminer le surnageant. Porter le volume final à neuf millilitres avec du milieu RPE 15 % à l’aide d’une pipette pour resuspendre. Prélever trois millilitres de la suspension cellulaire à la pipette et les transférer dans un flacon de 25 centimètres carrés.

Ajoutez deux millilitres de milieu de culture RPE 15 % frais à température ambiante. Incubez les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius et sous 5 % de dioxyde de carbone. Au fur et à mesure que les cultures mûrissent, leur pigmentation augmentera après trois à quatre semaines.

Les cultures réussies seront confluentes et uniformément pigmentées, de manière intense. Nous venons de vous montrer comment préparer des cultures primaires de RP fœtal humain. Voilà, c'est terminé.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.