Dosage de la formation de sphères : une méthode in vitro pour identifier les cellules souches du cancer du pancréas et dépister les thérapies

- L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) contient un sous-ensemble de cellules souches cancéreuses (CSC) exclusivement tumorigènes. Les CSC sont auto-renouvelables, pluripotents et capables de former des tumeurs. Ils expriment des protéines anti-apoptotiques et contiennent également des gènes multirésistants, ce qui les rend résistants à la chimiothérapie. Pour identifier les cellules souches cancéreuses et étudier l’effet des médicaments sur celles-ci, nous effectuons un test de formation de sphères.

Tout d’abord, suspendez les cellules souches cancéreuses extraites dans le milieu de culture cellulaire souhaité. Ensuite, ensemencez la suspension cellulaire dans une plaque multi-puits et incubez pendant la durée souhaitée. Ajoutez une quantité requise de médicament d’intérêt dans quelques puits et un placebo dans d’autres puits comme contrôle négatif. Incuber les cellules pendant la durée souhaitée. Les cellules souches cancéreuses forment des colonies en forme de sphère dans un environnement de culture non adhérent.

Après l’incubation, pipetez une petite quantité de suspension cellulaire sur un hémocytomètre et placez-la dans un compteur de cellules automatisé. Maintenant, comptez le nombre de sphères formées. Les cellules traitées par le médicament présentent généralement une réduction substantielle de la taille et du nombre de sphères. Dans le protocole suivant, nous effectuerons un test de formation de sphère pour identifier les cellules souches du cancer du pancréas et évaluer l’effet de la metformine.

- Pour faciliter la formation de la sphère tumorale pour l’enrichissement en cellules souches cancéreuses, diluez les cellules dans le volume approprié de milieu de cellules souches cancéreuses jusqu’à une concentration finale de 2 fois 10 à 3 cellules par millilitre, et refroidissez-les sur de la glace pendant quelques minutes. Ensuite, après avoir ajouté 500 microlitres de PBS aux première et dernière rangées d’une plaque cellulaire à très faible fixation, remettre les cellules en suspension à l’aide d’une pipette et ensemencer 1 millilitre de cellules par puits dans les puits vides de la plaque.

Traitez quatre puits de cellules avec le médicament d’intérêt et au moins quatre puits de contrôle négatif avec véhicule. Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une semaine. Tous les deux jours, ajoutez un nouveau traitement ou véhicule à chacun des puits.

Le jour 5 ou 7, évaluez le nombre de sphères tumorales formées à l’aide d’un compteur de cellules automatisé qui permet d’identifier des structures plus grandes. Pour le passage en série des sphères tumorales, le jour 7, utilisez une passoire cellulaire de 40 micromètres pour récolter les sphères. Ensuite, faites tourner les sphères et incubez-les dans 1 millilitre de trypsine pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius pour dissocier la pastille en une suspension unicellulaire. Ensuite, élargissez les cellules pendant sept jours supplémentaires, comme nous venons de le démontrer.