Name: Cartographie sort des cellules souches embryonnaires humaines par la formation de tératome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-01T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Découvrez la cartographie des cellules souches embryonnaires humaines par formation de tératome. Cette méthode permet de suivre la différenciation in vivo et d'analyser le destin tissulaire des cellules marquées.

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Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche global du California Institute for Regenerative Medicine (RC1-00104), un Service de santé publique de subvention (HL085377) à partir du NHLBI, et un don de la Fondation Pollin à HSB

Le protocole écrit ci-dessous est basée sur des paramètres publiés par les auteurs, avec quelques modifications. Le protocole est exécuté avec l'approbation par le soin des animaux UCSF institutionnels et d'utilisation (IACUC) et surveillance de la recherche sur les cellules souches (SCRO) Comités. I. Culture des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) <ol><li> Cultivez CSEh en standard à 6 puits (3,5 cm de diamètre des puits) plaques. </li><li> Au moins 12 heures avant repiquage des cellules, fibroblastes de souris graines embryonnaires (MEF; obtenu à partir de CF1 jour E12.5 souris chronométrés-estimé, irradiés à 1000 Ci) cellules nourricières sur des plaques enduites de gélatine à 1% (6,7). FAE devrait être plaqué à 50-60% de confluence, ou 4 x 10 5 cellules par 3,5 cm de diamètre ainsi (figure 1). </li><li> Passage des cellules où les colonies ont atteint la confluence ~ 70% (figure 2). </li><li> Pour le passage des cellules, la croissance moyenne aspirer KSR (6) dans les puits et les remplacer par 0,5 ml de milieu contenant de la collagénase IV dans KSR à une concentration de 1 mg / ml. </li><li> Incuber les plaques avec de la collagénase IV à 37 ° C / 5% CO 2 pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que les bords des colonies commencent à soulever de la plaque. </li><li> Retirez la collagénase IV de la plaque, ajoutez 0,5 ml de KSR dans chaque puits, et manuellement gratter les cellules à supprimer complètement de la plaque. </li><li> Recueillir la suspension de cellules de chaque puits, placer dans un tube de 15 ml conique, et permettent aux cellules de se déposent par gravité pendant 5 minutes. </li><li> Retirer le surnageant du tube, laissant les cellules et le milieu dans un volume total de ~ 300μl. </li><li> L'utilisation d'un micro-200 pl pipeteur fixé à plein volume, délicatement la pipette la suspension de cellules 5-6 fois pour briser les colonies. </li><li> Apportez la suspension cellulaire à un volume total de 9 ml par puits original de cellules en utilisant un milieu KSR (c'est à dire, si l'on est bien récolté, le tube doit contenir 9 ml). Supplément de la moyenne avec facteur humain recombinant fibroblastes de croissance basique (bFGF) à une concentration de 12,5 ng / ml. </li><li> Après lavage des puits nouveaux contenant des cellules MEF (voir étape 2) avec du phosphate de Dulbecco saline tamponnée (DPBS) pour supprimer tous sérum, ajouter 3 ml de la suspension cellulaire dans chaque puits et incuber les plaques à 37 ° C CO / 5% 2. </li><li> Changer moyennes KSR avec bFGF 24 heures après le passage, et toutes les 24-48 heures jusqu'à cellules sont prêtes à être repiquées à nouveau. </li></ol> II. Préparation des CSEh granulés pour le greffage <ol><li> A 24 heures avant la greffe, ajouter l'inhibiteur ROCK au milieu KSR à une concentration finale de 10 uM d'augmenter la viabilité cellulaire (8). Un puits de cellules à confluence ~ 70% (5 x 10 5 cellules) va créer deux boulettes, avec deux pastilles inséré par capsule du rein. </li><li> Pour préparer les culots de cellules à greffer (9), inhibiteur de ROCK incuber les cultures traitées avec de la collagénase IV pendant 5 minutes à 37 ° C CO / 5% 2. </li><li> Aspirer le IV collagénase du puits et la remplacer par une DPBS ml avec 10% de pénicilline / streptomycine (stylo / STREP). </li><li> Manuellement racler les colonies de la plaque, rincez le bien avec une 1 supplémentaires DPBS ml avec stylo / le streptocoque et le transfert de chaque aliquote de 1 ml de suspension cellulaire dans un tube de 1,5 ml de microcentrifugation. </li><li> Spin microtubes de 8000 x brièvement g, aspirer le surnageant et remettre en suspension les boulettes dans DPBS 500μl avec stylo / streptocoque. </li><li> Pour aider à lier les cellules entre elles pour une greffe, ajouter 100 ul 1 mg / ml de lectine de Phaseolus vulgaris (PHA) dans DPBS à chaque tube. </li><li> Incuber les cellules / suspension de PHA à température ambiante pendant 5 minutes, puis tourner pendant 2 minutes à 8000 x g. Tournez les tubes de 180 ° dans leur puits de rotor et de spin à nouveau pendant 2 minutes à 8000 x g. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant en laissant intacte la pastille. </li><li> Déloger les culots des tubes par un léger pipetage KSR 200 pl à côté de la bordure de la pastille jusqu'à ce qu'elle lève lentement. </li><li> Une fois délogés, transférer immédiatement les pellets à 0.4μm inserts Millicell placés dans les puits 3,5 cm de diamètre contenant 3 ml KSR, et incuber pendant 2 heures pour une nuit à 37 ° C / 5% de CO 2. </li></ol> III. Capsule rénale greffant <ol><li> Effectuez toutes les procédures animaux conformément aux lignes directrices institutionnelles en utilisant les règles d'asepsie. </li><li> Anesthetize SCID beige (CB17.Cg-Prkdc scid Lyst bg / LCR), âgés de 8-12 semaines, en utilisant une combinaison de 3% O2 inhalé isoflurane/0.5% et tribromoéthanol intrapéritonéale (Avertin; 25 mg / kg fraîchement préparé). Deux pastilles de cellules par souris seront greffées en utilisant des techniques décrites (10). </li><li> Après avoir placé la souris sur un coussin chauffant pour prévenir l'hypothermie, raser la zone d'incision, puis désinfectez-les avec la chlorhexidine. Faire une incision de 2,5 cm par la peau juste à côté du centre, mais parallèle à la colonne vertébrale. </li><li> Garder la zone d'incision humides avec des stériles Saline, faire une petite incision dans le muscle, juste en dessous des côtes et environ 1 cm de la colonne vertébrale. L'incision doit être juste assez grand pour tirer le rein à travers, mais assez petite pour que le rein ne sera pas retomber dans la cavité abdominale sans force. </li><li> Tirez doucement le rein par l'incision musculaire en utilisant une pipette Pasteur en verre qui a été tiré dans la forme d'un brutal, un crochet légèrement incurvée. </li><li> Mouiller le rein avec DPBS stérile pour empêcher la capsule de se dessécher. Cela peut être nécessaire de répéter toute la procédure, comme la capsule est très fragile. </li><li> En utilisant une pince Dumont # 5, tirez doucement sur la capsule du rein et de faire une incision de 2 mm en utilisant des ciseaux à ressort Vannas. </li><li> Avec une autre pipette en verre qui a été tiré dans une très fine, une sonde émoussé, faire une petite poche entre la capsule et le rein. </li><li> Utiliser une pipette à grande orifice placé sur une pipette de transfert jetable, prenez une seule cellule de l'insert à granulés Millicell. Assurez-vous de prendre aussi peu médiatique supplémentaire tout au long que possible, que les médias en excès peut interférer avec le transfert de granulés. </li><li> Tout en maintenant le bord de l'incision pour créer la pochette, placez doucement le culot à côté de l'ouverture et la pousser dans la poche vers un pôle du rein avec la pipette tiré. </li><li> Répétez le processus avec une seconde boulette. Placez ce sous la capsule du rein même, mais vers le pôle opposé. </li><li> Placez délicatement la capsule de retour vers le bas sur les pastilles. Les pellets doivent rester dans la poche, et pas de sutures sont nécessaires pour fermer la capsule. </li><li> Poussez doucement le rein dans la cavité abdominale et près de la paroi musculaire utilisant des sutures de soie 4-0 (ou plus petit) avec joint inverse de coupe aiguille. L'incision doit être assez petit pour que seule une suture simple est nécessaire. </li><li> Fermer la peau avec une série de 4-5 points de suture interrompue, en utilisant le matériel de suture mêmes. </li><li> Avant de placer la souris de retour dans sa cage, administrer 0,05 mg / kg de buprénorphine (11,12) et 5 mg / kg de kétoprofène (12,13) ​​que les analgésiques à court terme et à long terme, respectivement. Les substances contrôlées ne doivent être utilisés conformément aux directives institutionnelles. </li><li> Transfert retour de l'animal dans sa cage et lui permettre de récupérer de l'anesthésie sur un coussin chauffant. Cela devrait prendre environ 20-30 minutes. </li><li> Une fois que la souris est totalement ambulatoire, il peut être retourné à l'animalerie. </li></ol> IV. La récolte tératome, la fixation et de sectionnement <ol><li> À 8-12 semaines post-chirurgie, il devrait y avoir un tératome peine palpable près du rein. Large, kystes remplis de liquide se développent souvent ainsi, à partir de 6-8 semaines. Ceux-ci peuvent nécessiter une récolte plus tôt si elles causent une détresse à l'animal. Depuis tératomes croître à un taux plus lent que les kystes, cependant, vous aurez envie d'attendre aussi longtemps que possible pour obtenir un tératome de taille suffisante pour l'analyse (c'est à dire, au moins 8 semaines). </li><li> Retirez les reins, le tératome, et tout kystes entourant comme un bloc de tissu de la cavité abdominale utilisant la même approche chirurgicale par laquelle le rein a été consultée (voir Section III, les étapes 1-4 ci-dessus). </li><li> Placez le bloc entier de tissu excisé dans un tube contenant 10% de formol tamponné. </li><li> Laisser le tératome de fixer une nuit à 4 ° C. </li><li> Le lendemain, retirez le tératome du tube. Disséquer l'écart des kystes rénaux et autant que possible sans endommager le tératome lui-même (figure 3). Agrandir tératomes peuvent être coupées en deux pour faciliter la dissection et l'intégration. </li><li> Traiter le tératome utilisant un standard de paraffine fixation technique. Unités automatiques sont disponibles (par exemple, Hypercenter Shandon): <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> 80% d'alcool Flex </td><td> 2 heures </td></tr><tr><td> II. </td><td> 80% d'alcool Flex </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> III. </td><td> 85% d'alcool Flex </td><td> 1,5 heures </td></tr><tr><td> IV. </td><td> 95% d'alcool Flex </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> V. </td><td> 100% d'alcool Flex </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 100% d'alcool Flex </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> VII. </td><td> 100% d'alcool Flex </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> IX. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> X. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> XI. </td><td> Paraffine (TissuePrep) </td><td> 2 heures </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Paraffine (TissuePrep) </td><td> 2 heures </td></tr></tbody></table></li></ol> V. L'immunohistochimie et d'analyse <ol><li> Une fois incorporé dans de la paraffine, la section de 5 um tératome tranches série à l'aide d'un microtome rotatif, et les sections flottent sur des lames. </li><li> Avant coloration, cuire les diapositives pour au moins une heure. </li><li> Colorer les diapositives à l'hématoxyline et l'éosine en utilisant des méthodes standard pour identifier les structures des tissus représentant de chacun des trois feuillets embryonnaires (figure 4): <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> Lavez Xylène </td><td> 3-5 minutes </td></tr><tr><td> II. </td><td> Xylène </td><td> 3-5 minutes </td></tr><tr><td> III. </td><td> D'alcool à 100% </td><td> 3-5 minutes </td></tr><tr><td> IV. </td><td> D'alcool à 100% </td><td> 3-5 minutes </td></tr><tr><td> V. </td><td> 95% d'alcool </td><td> 3-5 minutes </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 80% d'alcool </td><td> 3-5 minutes </td></tr><tr><td> VII. </td><td> L'eau de lavage (plusieurs changements) </td><td> 2 minutes </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Gill hématoxyline # 3 </td><td> 2-5 minutes </td></tr><tr><td> IX. </td><td> L'eau de lavage (plusieurs changements) </td><td> jusqu'à ce l'eau soit claire </td></tr><tr><td> X. </td><td> Scott eau (pour les noyaux en bleu) </td><td> 3 minutes ou plus </td></tr><tr><td> XI. </td><td> L'eau de lavage (plusieurs changements) </td><td> 1-2 minutes </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Éosine Y </td><td> 1 minute </td></tr><tr><td> XIII. </td><td> L'eau de lavage (plusieurs changements) </td><td> 30 secondes </td></tr><tr><td> XIV. </td><td> 80% d'alcool </td><td> 1 minute </td></tr><tr><td> XV. </td><td> 95% d'alcool </td><td> 2 minutes </td></tr><tr><td> XVI. </td><td> 95% d'alcool </td><td> 2 minutes </td></tr><tr><td> XVII. </td><td> D'alcool à 100% </td><td> 3 minutes </td></tr><tr><td> XVIII. </td><td> 100% d'alcool (propre) </td><td> 3 minutes </td></tr><tr><td> XIX. </td><td> Xylène </td><td> 2 minutes ou plus </td></tr><tr><td> XX. </td><td> Xylène </td><td> 2 minutes ou plus </td></tr></tbody></table></li><li> Monter une lamelle sur chaque diapositive avec Permount. </li></ol> VI. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Placage des fibroblastes de souris irradiées CF1 embryonnaires comme une couche nourricière pour les CSEh culture indifférencié. FAE sont plaqués au confluent ~ 50%, comme indiqué ici, ou 4 x 10 5 cellules par 3,5 cm de diamètre bien dans une boîte de culture de 6 puits. Bar, 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. CSEh exemple de la culture des CSEh indifférenciées subconfluentes sur une couche nourricière MEF. Sont cultivés sur des couches nourricières MEF jusqu'au confluent ~ 70%, comme indiqué ici, puis repiquées comme décrit. Bar, 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Exemple de tératomes explantés. Après explantation, le tératome, le rein, et tout tissu accessoires sont fixés comme un bloc dans le formol, puis les reins et les tissus accessoires sont soigneusement taillées loin avant enrobage dans la paraffine. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Tératomes dérivées de CSEh indifférenciées contiennent représentatifs des tissus de toutes les couches de germe de trois en vivo. Un tératome, comme celui représenté dans la figure 3, a été sectionné et colorées à l'hématoxyline et l'éosine pour identifier les tissus embryonnaires. CSEh donner lieu à des tissus provenant des trois feuillets embryonnaires (ectoderme (A, B), mésoderme (C), l'endoderme (D). (A) la structure naissante du tube neural. (B) épithélium primitif. (C) entouré par une capsule de cartilage du mésenchyme condensé. (D) la structure glandulaire intestinale. Bar, 100 um. Images reproduites avec l'autorisation de l'auteur. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Analyse tératome peut être utilisé pour cartographier le sort de étiquetés, CSEh indifférenciées. Comme précédemment publié (9), un mélange de CSEh spécifiquement marqués avec CSEh non marquées peuvent être utilisées pour cartographier le sort des cellules marquées dans un dosage de la formation de tératome. Comme le montre ici, CSEh indifférenciées exprimant le marqueur de surface, CD133, et étiqueté avec la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP), ont été mélangés avec non balisés, CSEh indifférenciées. Ils ont été utilisés pour former des tératomes par capsule rénale greffe. L'analyse immunohistochimique de l'hématoxyline et l'éosine tératome sections colorées avec des anticorps anti-eGFP démontre le sort de l'neuroectodermique CD133 + CSEh. Tératomes ont été traitées comme dans la figure 4 et de contraste avec des anticorps anti-eGFP (marron) pour localiser des dérivés de cellules CD133 + cellules GFP + dans les tissus. CD133 + cellules dérivées (flèches) ont été observées dans les tissus provenant de l'ectoderme embryonnaire, l'épithélium spécifiquement neural (à gauche) et du tube neural naissante structures similaires (à droite). Bar, 100 um. Images reproduites avec l'autorisation de l'auteur. Gélatine <ul><li> 0,1% gélatine porcine </li><li> DPBS 99,9% <ul><li> Ajouter la gélatine au DPBS, incuber à 37 ° C pendant une heure ou jusqu'à ce que la gélatine tous les passe en solution, et stériliser par filtration (0.22μm) avant utilisation. </li></ul></li></ul> MEF moyennes <ul><li> 10% de sérum fœtal bovin (qualifié) </li><li> Dulbecco 90% de modification Essential Medium (D-MEM) </li><li> 1x L-Glutamine </li><li> 1x Pen / Strep <ul><li> Stériliser par filtration avant l'utilisation. </li></ul></li></ul> KSR (Remplacement Knockout sérum) moyenne <ul><li> 20% de remplacement du sérum KnockOut </li><li> 80% KnockOut D-MEM </li><li> 1x L-Glutamine </li><li> 1x acides aminés non essentiels </li><li> 0,1 mM β-mercaptoéthanol / </li><li> 12,5 ng / ml de bFGF <ul><li> Stériliser par filtration. </li><li> Conserver à 4 ° C, mais au chaud à 37 ° C avant d'ajouter aux cellules. </li><li> Ajouter bFGF immédiatement avant utilisation. </li></ul></li></ul> Collagénase IV <ul><li> Dissoudre 1 mg / ml dans le milieu KSR en plaçant à 37 ° C pendant 1-2 heures ou jusqu'à ce que toute la poudre passe en solution. </li><li> Stériliser par filtration. </li></ul> Avertin <ul><li> 0,25 g de 2,2,2-tribromoéthanol </li><li> 0,25 ml de 2-méthyl-2-butanol <ul><li> Incuber à 37 ° C pendant la nuit pour former une solution 100%. </li><li> Plusieurs heures avant la chirurgie, une solution diluée à 2,5% de travail en utilisant DPBS et incuber à 37 ° C pendant au moins 1 heure. </li><li> Filtre stériliser et aliquote. </li><li> Tribromoéthanol est très sensible à la lumière, afin de protéger de la lumière à toutes les étapes de préparation et d'utilisation. </li><li> Préparer pas plus de 12-24 heures avant utilisation. </li></ul></li></ul> La buprénorphine <ul><li> 1 mg / ml de solution concentrée dans le méthanol <ul><li> Diluer à 0,015 mg / ml, solution de travail en utilisant stériles H 2 O. </li><li> Conserver à -20 ° C jusqu'à un mois. </li></ul></li></ul> Le kétoprofène <ul><li> 0,5 mg / ml, solution de travail dans DPBS <ul><li> Ajouter DPBS, incuber une nuit à 37 ° C pendant 1-2 heures ou jusqu'à ce que toute la poudre passe en solution. </li><li> Filtre stériliser et conserver à 4 ° C. </li></ul></li></ul>

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</ol>

Nous avons adapté un test de tératome très efficace de formation dans le but de cartographier le sort de différencier les CSEh dans un environnement in vivo. Un petit nombre de CSEh spécialement sélectionnés est mélangé avec indifférencié CSEh lectine de type sauvage et Phaseolus vulgaris pour former un culot cellulaire. Ceci est greffée sous la capsule rénale de souris immunodéficientes une. Le sort des CSEh initialement sélectionné peut alors être déterminé par immunohistochimie (figure 5), comme indiqué précédemment (9). Cette méthode fournit un outil précieux pour identifier et générer tissu-spécifique des réactifs pour thérapie cellulaire.

<table><tbody><tr><td>2-méthyl-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>2,2,2-tribromo&amp;#8211;éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>Sutures en soie 4-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td>641G</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233FB</td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7536</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046-341</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Pinces Dupont n°5</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500233</td><td>Capsule rénale</td></tr><tr><td>Eosine Y</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-658</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (qualifié)</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Alcool flexible</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046344</td><td></td></tr><tr><td>Gill&amp;rsquo;s Hematoxyline #3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-204</td><td></td></tr><tr><td>Hémostat, droit</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501241</td><td>Chirurgie générale</td></tr><tr><td>Pinces à iris</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>15914</td><td>Chirurgie générale</td></tr><tr><td>Kétoprofène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2012</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25020-081</td><td></td></tr><tr><td>Inserts MILLICELL</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de chirurgie</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501754</td><td>Chirurgie générale</td></tr><tr><td>Paraffine (TissuePrep)</td><td>Fisher Scientific</td><td>8002-74-02</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1668</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine porcine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6144</td><td></td></tr><tr><td>inhibiteur de la ROCK</td><td>Calbiochem</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>Souris SCID beige</td><td>Charles River Laboratories</td><td>250</td><td></td></tr><tr><td>Scott&amp;rsquo;s Lavage</td><td>Fisher Scientific</td><td>6697-32</td><td>Produits chimiques Ricca</td></tr><tr><td>Ciseaux de Vannas à ressort</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14003</td><td>Capsule rénale</td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercaptopropyl&amp;#8211;éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr></tbody></table>

cartographie sort des cellules souches embryonnaires humaines par la formation de tératome

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont une capacité illimitée de l&#39;auto-renouvellement, et la capacité de se différencier en cellules provenant de chacun des trois feuillets embryonnaires (1). Différenciation dirigée des CSEh dans les types cellulaires spécifiques a suscité beaucoup d&#39;intérêt dans le domaine de la médecine régénérative (par exemple, (2-5)), et des méthodes pour la détermination de la<em&gt; In vivo</emLe destin&gt; des CSEh sélectionnés ou manipulés sont essentiels à cet effort. Nous avons adapté un test très efficace la formation de tératome à cet effet. Un petit nombre de CSEh spécialement sélectionnés est mélangé avec indifférencié CSEh lectine de type sauvage et Phaseolus vulgaris pour former un culot cellulaire. Ceci est greffée sous la capsule rénale de souris immunodéficientes une. Aussi peu que 2,5 x 10<sup&gt; 5</supCSEh&gt; sont nécessaires pour former un 16 cm<sup&gt; 3</supTératome&gt; dans les 8-12 semaines. Le sort des CSEh initialement sélectionné peut alors être déterminée par immunohistochimie. Cette méthode fournit un outil précieux pour caractériser tissu-spécifique des réactifs pour thérapie cellulaire.

Différenciation dirigée des CSEh dans des cellules spécifiques a suscité beaucoup d&#39;intérêt en médecine régénérative. Nous fournissons un résumé concis, étape par étape pour déterminer le protocole de<em&gt; In vivo</emLe destin&gt; des CSEh sélectionnés qui offre un outil précieux pour caractériser tissu-spécifique des réactifs pour thérapie cellulaire.

Cartographie sort des cellules souches embryonnaires humaines par la formation de tératome

Les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) possèdent une capacité d'auto-renouvellement illimitée et l'aptitude à se différencier en cellules dérivées des trois...

L'objectif général de cette procédure est de différencier in vivo des cellules souches embryonnaires humaines et de déterminer leurs destinées tissulaires spécifiques. Cela est réalisé en premier lieu en formant un culot à partir de cellules d'intérêt génétiquement marquées. La deuxième étape de la procédure consiste à placer chirurgicalement ce culot sous la capsule rénale d'une souris immunodéprimée.La troisième étape de la procédure consiste à laisser le culot cellulaire se différencier pendant huit à douze semaines sous la capsule du rein de souris. La dernière étape de la procédure consiste à récolter le tératome obtenu, à le fixer au formol et à analyser le destin des cellules marquées par immunohistochimie. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent que les cellules marquées se développent en une ou plusieurs des trois couches germinatives grâce à l'histologie et à l'immunohistochimie des tératomes obtenus.Bonjour, je suis Carissa Ritner du laboratoire du Dr Harold Bernstein à l'Institut de recherche cardiovasculaire de l'Université de Californie à San Francisco. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de développer des tératomes par greffe sous la capsule rénale. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la différenciation des cellules souches embryonnaires, à la fois afin de vérifier que chaque lignée avec laquelle nous travaillons peut donner naissance aux trois feuillets germinatifs et pour suivre le destin de cellules souches marquées génétiquement in vivo.Toutes les procédures que nous allons vous montrer sont effectuées avec l'approbation du Comité institutionnel de soins aux animaux et d'utilisation de l'UCSF. De plus, tous les travaux impliquant des cellules souches embryonnaires humaines sont réalisés avec l'approbation du Comité de surveillance de la recherche sur les cellules souches de l'UCSF. Commençons donc.Pour préparer des cultures de cellules souches embryonnaires humaines, veuillez vous référer à la partie textuelle de ce protocole. Pour les manipulations dans une hotte à flux laminaire, traitez les cultures de cellules souches embryonnaires humaines préalablement exposées à l'inhibiteur de rock avec un milligramme par millilitre de collagénase IV, puis incubez pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Aspirez la collagénase IV du puits. Remplacez-la par un millilitre de DPBS à température ambiante supplémenté avec 10 % de pénicilline-streptomycine.Utilisez un détacheur cellulaire à lame plate pour prélever les colonies à partir de la plaque et transférez 0,5 millilitre de la suspension cellulaire dans chacun des deux tubes de microcentrifugation. Rincez le puits avec un millilitre de DPBS et transférez 0,5 millilitre du rinçage dans chaque tube. Faites centrifuger les tubes pendant 20 secondes à 8 000 ×g, aspirez le surnageant et resuspendez chaque culot dans 500 microlitres de DPBS frais, à raison de 100 microlitres par milligramme par millilitre.Lectine de Fasi vulgaris dans DPBS dans chaque tube pour aider à lier les cellules ensemble en vue de la transplantation. Incuber la suspension cellulaire à température ambiante pendant cinq minutes. Centrifuger les cellules à 8 000 ×g pendant deux minutes afin d'obtenir un culot homogène.Faites pivoter les tubes de 180 degrés dans leurs alvéoles de rotor. Ensuite, effectuez une nouvelle centrifugation à 8 000 fois la gravité pendant deux minutes.Aspirez soigneusement le SUP nasin, en laissant les culots intacts pour détacher les culots du tube. Pipetez délicatement 200 microlitres de milieu KSR le long du bord du culot jusqu'à ce qu'il se détache lentement. Une fois le culot détaché, aspirez immédiatement le milieu dans une milli-cellule de 0,4 micromètre.Insérez dans un puits contenant trois millilitres de milieu KSR. Incubez de deux heures à toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Placez une souris immunodéficiente anesthésiée sur un tapis chauffant afin d'éviter l'hypothermie.Utilisez des ciseaux chirurgicaux et une pince à iris pour pratiquer une incision de 2,5 centimètres à travers la peau, parallèlement à la colonne vertébrale, mais légèrement décalée par rapport au centre. Pratiquez une incision plus petite à travers le muscle juste sous les côtes et à environ un centimètre de la colonne vertébrale.L'incision doit être suffisamment grande pour permettre de faire passer le rein, mais assez petite pour qu'il ne puisse pas glisser de nouveau dans la cavité abdominale sans une pression exercée. À l’aide d’une pipette en forme de crochets obtus obtenue en étirant une pipette à pâte, tirez délicatement le rein à travers l'incision musculaire. Humidifiez périodiquement le rein avec du DPBS stérile à l’aide de pinces fines afin d’éviter que la capsule fragile ne s’assèche.Retirez délicatement la capsule du rein. Utilisez des ciseaux de type Venice Spring pour pratiquer une incision de deux millimètres dans la capsule. Au centre du rein, insérez une pipette en verre étirée en une sonde très fine et émoussée entre la capsule et le rein, puis remuez doucement pour créer une petite poche ; répétez l'opération de l'autre côté du rein afin d'obtenir deux poches.Un sur chaque pôle du rein. À l’aide d’une pipette à embout large et d’un dispositif de transfert jetable, prélevez un seul culot à partir de l’insert de la milli-cellule.Prélevez le moins de milieu possible, car un excès de milieu peut interférer avec le transfert du culot. Utilisez une pince pour soulever le bord de la poche sur le rein. Placez délicatement le culot à côté de l'ouverture et utilisez la micropipette étirée pour le pousser dans la poche, en direction d'un pôle du rein.Placer un deuxième culot dans la poche vers le pôle opposé. Remettre soigneusement la capsule sur les culots. Aucune suture n'est nécessaire pour fermer la capsule.Utilisez une pipette recourbée pour repousser doucement le rein dans la cavité abdominale. L'incision musculaire doit être suffisamment petite pour être fermée par un seul point de suture en soie. Fermez la peau à l’aide d’une série de quatre à cinq points séparés et laissez l’animal se remettre de l’intervention avant de le retourner au centre d’élevage huit à douze semaines après la chirurgie.Retirer le tératome rénal et tous les kystes environnants de la cavité abdominale sous forme d'un bloc de tissu. Placer l'ensemble du bloc de tissu excisé dans un tube en polypropylène de 50 millilitres contenant une solution tamponnée à 10 %. Laisser fixer le tératome à quatre degrés Celsius pendant toute la nuit.Retirer le tératome du tube et le placer sur un tapis. Utiliser un scalpel pour disséquer tous les kystes et autant de tissu rénal que possible, sans endommager le tératome lui-même. Les tératomes de plus grande taille peuvent être coupés en deux pour faciliter la dissection et l'inclusion.Traitez le tératome en utilisant la technique standard de fixation à la paraffine et montez les coupes sur des lames pour analyse et imagerie. Reportez-vous aux notes dans la partie textuelle du protocole pour plus de détails. Ici, nous vous montrerons des coupes de tissu provenant d’un tératome typique.Ce tératome a été coloré à l'hématoxyline et à l'éosine afin d'identifier les tissus embryonnaires, représentatifs des trois feuillets germinatifs, et présente une structure de tube neural naissant, caractéristique de l'ectoderme. Cette coupe fournit un autre exemple d'ectoderme, dans ce cas un épithélium squameux primitif. Ici, le cartilage entouré par une capsule de mésenchyme condensé représente des tissus dérivés du mésoderme embryonnaire.Enfin, cette section montrant une structure intestinale glandulaire démontre la présence de tissu dermique interne au sein du tératome afin de cartographier le destin des cellules souches marquées génétiquement. Des tératomes ont été ensemencés avec un mélange de cellules souches embryonnaires humaines de type sauvage et de cellules souches embryonnaires humaines positives pour CD133. Les cellules positives pour CD133, d'origine indiquée par des flèches, ont été observées dans des tissus issus de l'endoderme embryonnaire, spécifiquement dans l'épithélium neuroépithélial et dans des structures en voie de formation semblables à un tube neural naissant. Je suis le Dr Harold Bernstein.Carissa vient de vous montrer comment former des tératomes à partir de cultures de cellules souches embryonnaires humaines afin de réaliser un test de développement in vivo. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de bien prendre soin de vos cellules et de veiller à votre technique aseptique. Voilà donc tout ce qu'il faut retenir.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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