Primaire-Libre Choix aptamères en utilisant une bibliothèque d'ADN aléatoires

L'objectif général de cette procédure est d'identifier des abers provenant d'une bibliothèque aléatoire, qui se lient spécifiquement à une protéine cible, dans ce cas la protéine S 100 B. Ceci est réalisé en premier lieu par la digestion de la bibliothèque à l'aide d'une endonucléase de restriction afin de libérer des séquences aléatoires à partir des séquences fixes des amorces adjacentes. La deuxième étape de la procédure consiste à lier les séquences aléatoires de la bibliothèque à la protéine S 100 B purifiée, puis à les récupérer.

La troisième étape de la procédure consiste à réunir les séquences liées avec les séquences d'amorces fixes par hybridation et ligature. La dernière étape de la procédure est de transcrire les produits ligaturés afin de permettre une réamplification par R-T-P-C-R du pool lié de candidats abers, suivie de tours supplémentaires de cette procédure de sélection. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus montrant une liaison spécifique des abers sélectionnés à la protéine S 100 B.

Par exemple, ici, des dosages de liaison sandwich sont réalisés à l'aide de puces à ADN et des dosages avec des seconds anticorps marqués par un fluorochrome sont également effectués en utilisant des nanofils fonctionnalisés et des seconds anticorps couplés à des nanoparticules d'or de 15 nanomètres. Aujourd'hui, nous allons décrire une procédure permettant de sélectionner des séquences optimales capables de se lier à la protéine S hundred B à partir d'une bibliothèque aléatoire de séquences D. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire à diverses fins, notamment le développement d'une plateforme de détection pour le diagnostic précoce du cancer.

Commençons donc. Pour commencer cette procédure, générez une bibliothèque d'ADN sans amorce ou ADN PF comme décrit précédemment. La clivaison de la bibliothèque d'ADN double brin suivie d'une purification sur gel au moyen d'un gel de polyacrylamide dénaturant à 10 % produira un fragment de 32 nucléotides portant un phosphate en 5' dans 30 cc, et un fragment de 30 nucléotides portant un phosphate en 5' dans 30, désignés respectivement fragment 32+ et fragment 30+.

L'élément 32 plus contient le domaine aléatoire de 30 nucléotides avec la séquence flanquante minimale CC à l'extrémité trois prime, tandis que l'élément 30 plus ne comprend que la séquence du domaine aléatoire de 30 nucléotides. Pour préparer les fragments d'ADN de la bibliothèque PF en vue d'une sélection par apture, resuspendre chacun des éléments 32 plus et 30 plus dans 40 microlitres de Tris 20 millimolaire, HCl pH 7,4. Ensuite, chauffer les échantillons trois minutes à 85 degrés Celsius après incubation.

Refroidir les échantillons pendant trois minutes dans un bain-marie incubateur à 37 degrés Celsius, puis ajouter 760 microlitres de tampon de sélection et incuber pendant trois minutes à 37 degrés Celsius. Après trois minutes, maintenir l'échantillon à température ambiante pendant 10 minutes. Après incubation, faire passer la solution à travers une colonne contenant des billes d'agarose NTA-nickel préalablement lavées avec le tampon de sélection.

Pour éliminer l'ADN non spécifique, récupérez les fragments d'ADN de la bibliothèque PF qui ne se lient pas à la colonne et mettez-les de côté pour une utilisation ultérieure. Pour préparer les billes liées à la protéine S 100 B, centrifugez d'abord 400 microlitres de billes au nickel NDA pendant trois secondes dans une microcentrifugeuse et jetez le surnageant. Lavez ensuite les billes avec 400 microlitres de tampon de liaison en pipetant doucement cinq fois.

Ensuite, centrifuger pour faire tomber les billes et jeter le surnageant. Répéter cette étape. Effectuer deux lavages.

Ensuite, faites passer la protéine précédemment purifiée portant une étiquette d'histidine sur les billes. Ici, la protéine B liant le calcium S100 humain est utilisée ; pipetez doucement la solution vers le haut et vers le bas cinq fois toutes les trois minutes, pendant un total de 15 minutes.

Après 15 minutes, centrifuger brièvement pour faire déposer les billes et jeter le surnageant. Enfin, laver les billes liant la protéine S100B avec 400 microlitres de tampon de sélection en pipetant doucement trois fois vers le haut et vers le bas. Centrifuger à nouveau les billes pour les faire déposer, puis jeter le surnageant.

Répétez cette étape deux fois pour un total de trois lavages finaux afin de sélectionner les anticorps liés à la S100B. Récupérez les fragments 32+ et 30+ mis de côté précédemment. Ajoutez les fragments aux billes liées à la S100B. Incubez ensuite l'échantillon pendant 15 minutes.

Mélanger toutes les trois minutes en pipetant doucement vers le haut et vers le bas après 15 minutes, centrifuger brièvement les billes, éliminer le surnageant, puis laver le complexe S 100 BDNA avec 800 microlitres de tampon de sélection en pipetant doucement. Ensuite, centrifuger les billes et éliminer le surnageant. Répéter cette étape de lavage deux fois.

Pour récupérer le S 100, ajouter 200 microlitres de tris HCl 20 millimolaire, pH 7,4, aux billes. Ensuite, chauffer le mélange pendant trois minutes à 85 degrés Celsius. Après l'incubation.

Vortexez les billes pendant une minute et faites-les centrifuger. Transférez ensuite le surnageant dans un tube propre. Répétez cette étape une fois et combinez les surnageants.

Enfin, purifiez les fragments d'ADN sélectionnés. Extrayez les produits de PCR deux fois avec un volume équivalent de phényl chloroforme, alcool isopropylique. Précipitez-les avec du chlorure de sodium à 250 millimolaire et 2,5 fois le volume d'éthanol à 100 % à moins 70 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Faire centrifuger à 21 000 ×g à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, éliminer le surnageant. Rincer efficacement le culot avec de l'éthanol à 75 %.

Centrifuger à 21 000 ×g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes et éliminer le surnageant. Sécher le culot au vide rapide pendant trois minutes après 10 cycles de sélection. Cloner les fragments d'ADN amplifiés par PCR dans le vecteur PCR 2.1 topo obtenu auprès d'un centre vitrogen.

Ensuite, séquencer entre 40 et 50 colonies individuelles pour chacun des fragments N 30 cc et N 30 sélectionnés à l’aide de l’amorce M 13 forward. Aligner les séquences sélectionnées à l’aide du logiciel Infomax Vector NTI. Puis déterminer les séquences consensuelles à partir des alignements.

Une fois les séquences de consensus identifiées, acheter les aptamères de consensus comme décrit dans le protocole écrit. Suspendre le premier aptamère synthétisé avec un groupement aminoc6 en position cinq prime dans un tampon d'impression à une concentration finale de 15 micromolaire. Ensuite, déposer la solution d'aptamère sur des lames activées CodeLink à l'aide d'un microréseau Apogen Discoveries.

Suivre les protocoles recommandés par le lien de code. Imprimer chaque diapositive avec 12 matrices. Utiliser un format deux par huit.

Boîtier d'hybridation pour puces à ADN destiné à l'hybridation. Diluez la protéine S100B à la concentration appropriée dans 70 microlitres de PBS. Appliquez ensuite la solution dans les puits du boîtier de puces à ADN.

Scellez la cassette de microarray avec un film adhésif sans nucléase pour éviter l'évaporation. Laissez les protéines se lier aux abers imprimés sur le code lien. Incubez individuellement pendant une heure à température ambiante.

Lavez les puits de la cassette trois fois avec du PBS contenant du chlorure de magnésium à cinq millimolaire ou du PBSM. Ensuite, diluez les seconds anticorps marqués de manière fluorescente à 0,125 micromolaire dans 70 microlitres de PBSM. Chauffez le mélange pendant trois minutes à 85 degrés Celsius.

Ensuite, laissez refroidir les ABERS marqués sur de la glace. Appliquez les ABERS dans les puits de la cassette de microarray pendant trois minutes. Scellez à nouveau la cassette avec le film adhésif et incubez-la pendant une heure à température ambiante.

Encore une fois, individuellement. Laver les puits trois fois avec du PBSM après le lavage. Démonter la cassette et rincer toute la lame avec du PBSM.

Ensuite, séchez complètement la lame par centrifugation. Enfin, analysez la lame à l’aide d’un scanner Packard Biosciences ScanArray. La liaison 4 000 XL a été déterminée pour des aptamères marqués à l’extrémité 5’ par du γ-P³²-ATP en présence de la protéine S100B, puis représentée en fonction de la concentration afin de déterminer la KD.

Les Kd représentatifs après environ sept cycles de sélection se situent généralement dans la gamme de 10 à la puissance moins sept molaire. Des aptamères ciblant l'extrémité 5' ont été couplés à des micropuces CodeLink ; la protéine S100B purifiée a été liée au premier optimer, puis un second optimer marqué avec LO-5 46 a été lié au complexe premier optimer–S100B.

La fluorescence a été quantifiée à l'aide d'un scanner Scan Array. La rangée du milieu montre une liaison sandwich avec either, caractérisée par une liaison additive dans les dosages de KD représentés dans les rangées ci-dessus et ci-dessous. Il n'y a aucune liaison sandwich pour abers dont la dérivatisation thiol cinq prime a été effectuée ; les premiers abers ont été couplés à des nanofils d'or en utilisant une chimie thiol standard.

Les seconds aptamères ont été couplés à 50 NMO ou à des nanoparticules d'or de la même manière. La protéine S 100 B purifiée a ensuite été liée en premier aux nanofils fonctionnalisés, puis les seconds aptamères à 50 nanomolaires de nanoparticules d'or ont été liés aux complexes nanofil aptamère S 100 B. Les complexes sandwich formés ont été visualisés par MEB à émission de champ (F FE SEM).

Un témoin négatif peut être observé pour un dosage de liaison effectué avec la protéine HTRA1 à la place de la protéine S100B. Bon, l'une des choses les plus importantes concernant cette procédure est que nous utilisons une approche sans amorces, où nous n'avons pas de séquences fixes qui pourraient entraîner des faux positifs et des faux négatifs en fonction des séquences elles-mêmes, qui risqueraient de submerger la région aléatoire. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de s'assurer que le modèle d'ADN est détruit avant chaque réaction de transcription inverse, et de faire attention à isoler le produit spécifique de RT-PCR après chaque réamplification.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.