Primaire-Libre Choix aptamères en utilisant une bibliothèque d'ADN aléatoires

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les abers d’une banque aléatoire, qui se lient spécifiquement à une protéine cible dans ce cas, la protéine S 100 B. Ceci est accompli en digérant d’abord la banque avec l’endonucléase de restriction pour libérer des séquences aléatoires des séquences d’amorces fixes flanquantes. La deuxième étape de la procédure consiste à lier les séquences de banque aléatoires à la protéine S 100 B purifiée et à les récupérer.

La troisième étape de la procédure consiste à réunir des séquences liées avec des séquences d’amorces fixes par hybridation et ligature. La dernière étape de la procédure consiste à transcrire les produits ligaturés pour permettre la réamplification R-T-P-C-R du pool lié d’abers candidats, suivie de tours supplémentaires de cette procédure de sélection. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent une liaison spécifique des abers sélectionnés à la protéine S 100 B.

Par exemple, ici, des tests de liaison sandwich sont effectués à l’aide de microréseaux et des tests de second abers marqués par fluorescence sont également effectués à l’aide de nanofils fonctionnalisés et de seconds abers couplés à des nanoparticules d’or de 15 nanomètres. Aujourd’hui, nous allons montrer une procédure de sélection des protéines optimales, qui se lient à la protéine S cent B à partir d’une bibliothèque aléatoire de séquences D. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire à diverses fins, notamment pour développer une plateforme de capteurs pour la détection précoce du cancer.

Alors commençons. Pour commencer cette procédure, générez une banque d’ADN sans amorce ou PF comme décrit précédemment. Le clivage de la banque d’ADN double brin suivi d’une purification sur gel avec un gel de polyacrylamide dénaturant à 10 % donnera un fragment de 32 nucléotides de cinq phosphates primaires dans 30 cc, et un fragment de 30 nucléotides de cinq phosphates primaires dans 30, désignés respectivement comme les fragments 32 plus et 30 plus.

Le fragment 32 plus contient le domaine aléatoire de 30 nucléotides avec la séquence flanquante minimale CC à l’extrémité trois premiers, tandis que le fragment plus de 30 se compose uniquement de la séquence de domaine aléatoire de 30 nucléotides. Pour préparer les fragments d’ADN de la banque PF pour la sélection aptr, résus suspend chacun des 32 plus et 30 fragments plus dans 40 microlitres de 20 millitris, HCL pH 7,4. Ensuite, chauffez les échantillons pendant trois minutes à 85 degrés Celsius après l’incubation.

Refroidissez, laissez les échantillons pendant trois minutes dans un incubateur à bain d’eau à 37 degrés Celsius, puis à 760 microlitres de sélection, tamponnez et incubez pendant trois minutes à 37 degrés Celsius. Après trois minutes, conservez l’échantillon à température ambiante pendant 10 minutes. Après l’incubation, passez la solution dans une colonne contenant des billes de nickel NTA agro prélavées avec un tampon de sélection.

Pour éliminer l’ADN non spécifique, collectez les fragments d’ADN de la banque PF qui ne se lient pas à la colonne et mettez-les de côté pour plus tard. Pour préparer les billes liées S 100 B, faites d’abord tourner 400 microlitres de billes de nickel NDA pendant trois secondes dans une micro-centrifugeuse et jetez le surnageant. Ensuite, lavez les billes avec 400 microlitres de tampon de liant en pipetant doucement cinq fois.

Ensuite, faites tourner les perles et jetez le surnageant. Répétez cette opération. Laver deux fois.

Ensuite, l’histidine précédemment purifiée a marqué des protéines sur les billes. Ici, la liaison du calcium humain S 100. La protéine B est utilisée doucement, en pipetant la solution de haut en bas cinq fois toutes les trois minutes pour un total de 15 minutes.

Au bout de 15 minutes, faites tourner les perles et jetez le surnageant. Enfin, lavez le cordon lié S 100 B avec 400 microlitres de tampon de sélection en tapotant doucement de haut en bas trois fois. Encore une fois, faites tourner les perles vers le bas et jetez le surnageant.

Répétez cette étape deux fois pour un total de trois lavages finaux à sélectionner pour les abers liés S 100 B. Récupérez les fragments 32 et plus et 30 qui ont été précédemment mis de côté. Ajoutez les fragments dans la perle liée S 100 B.Ensuite, incubez l’échantillon pendant 15 minutes.

En mélangeant toutes les trois minutes en pipetant doucement de haut en bas après 15 minutes, faites tourner brièvement les billes, jetez le surnageant, puis lavez le complexe S 100 BDNA avec 800 microlitres de tampon de sélection en pipetant doucement. Ensuite, faites tourner les perles vers le bas et jetez le surnageant. Répétez cette étape de lavage deux fois.

Pour récupérer le S 100, il faut sélectionner des abers à 200 microlitres de 20 millimolaires, HCL pH 7,4 aux billes. Ensuite, chauffez la boue pendant trois minutes à 85 degrés Celsius. Après l’incubation.

Faites tourbillonner les perles pendant une minute et faites-les tourner. Transférez ensuite le surnageant dans un tube frais. Répétez cette étape une fois et combinez les surnageants.

Enfin, purifiez les fragments d’ADN sélectionnés. Extraire les produits PCR deux fois avec un volume équivalent de phényl chloroforme, alcool isopropylique. Précipitez-les avec 250 millimolaires de chlorure de sodium et 2,5 fois le volume d’éthanol à moins 70 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Faites pivoter à 21 000 GS à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Jetez ensuite le surnageant. Rincez efficacement le granulé avec de l’éthanol à 75 %.

Faites tourner à 21 000 GS à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Séchez le granulé dans un aspirateur rapide pendant trois minutes après 10 tours de sélection. Clonez les fragments d’ADN amplifiés par PCR résultants dans le vecteur topo PCR 2.1 obtenu à partir d’un noyau de vitrogène.

Ensuite, séquencez entre 40 et 50 colonies simples pour chacun des fragments N 30 cc et N 30 sélectionnés avec l’amorce directe M 13. Alignez les séquences sélectionnées à l’aide du logiciel infomax vectoriel NTI. Déterminez ensuite les séquences de consensus en fonction des alignements.

Une fois que les séquences consensuelles ont été identifiées, achetez des abers consensuels comme décrit dans le protocole écrit. Suspendez le premier aptamère synthétisé avec un groupe Amin C six à cinq premiers dans le tampon d’impression à une concentration finale de 15 micromolaires. Ensuite, repérez la solution aptamère sur des lames activées par lien de code à l’aide d’un réseau de micro-réseaux de découvertes d’apogen.

Suivre les protocoles recommandés par le lien de code. Imprimez chaque diapositive avec 12 tableaux. Utilisez un format deux par huit.

Cassette d’hybridation de microarray pour l’hybridation. Diluer la protéine S 100 B à la concentration appropriée dans 70 microlitres de PBS. Appliquez ensuite la solution sur les puits de la cassette de la puce à électricité.

Scellez la cassette de la micropuce à l’aide d’une feuille de plafond adhésive sans nucléase pour éviter l’évaporation. Laissez la protéine se lier aux abers imprimés sur le lien du code. Glisser pendant une heure à température ambiante après l’incubation individuellement.

Lavez trois fois les puits de la cassette avec du chlorure de magnésium PBS à cinq millimolaires ou PBSM. Ensuite, diluez les seconds abers marqués par fluorescence à 0,125 micromolaire dans 70 microlitres de PBSM. Faites chauffer le mélange pendant trois minutes à 85 degrés Celsius.

Laissez ensuite refroidir l’ABERS étiqueté sur de la glace. Pendant trois minutes, appliquez les abers sur les puits de la cassette du microréseau. Encore une fois, scellez la cassette avec la feuille adhésive et incubez-les pendant une heure à température ambiante.

Encore une fois, individuellement. Lavez les puits trois fois avec du PBSM après le lavage. Démontez la cassette et rincez toute la diapositive avec du PBSM.

Ensuite, séchez soigneusement la lame par centrifugation. Enfin, numérisez la lame à l’aide d’un réseau de balayage Packard Biosciences. La liaison de 4 000 XL a été déterminée pour les aptamères gamma P 32 A marqués à cinq extrémités premières marqués à la protéine S 100 B et tracée en fonction de la concentration pour la détermination de KD.

Les kds représentatifs après environ sept tours de sélection sont généralement de l’ordre de 10 à moins sept molaires. Cinq premiers aptamères ont été couplés à des microréseaux de liaison codée : la protéine S 100 B purifiée a été liée au premier optimiseur et à LOR 5 46 marqué en second. Optimer était lié au premier complexe optimer S 100 B.

La fluorescence a été quantifiée à l’aide d’un scanner à balayage. La rangée du milieu montre des garrots de liaison sandwich caractérisés par une liaison additive dans les dosages KD dans les rangées au-dessus et au-dessous. Il n’y a pas de liaison sandwich pour les abers, cinq premiers abers premiers dérivés de thiol premiers ont été couplés à des nanofils d’or en utilisant la chimie standard du thile.

Les deuxièmes abers ont été couplés à 50 NMO ou nps d’or de la même manière. La protéine S 100 B purifiée a ensuite été liée d’abord aux nanofils dérivés, puis au deuxième aptamère 50 nano molaires d’or mps ont ensuite été liés aux premiers complexes S 100 B de nanofils d’aptamères. Les complexes sandwich liés ont été visualisés à l’aide de F FE SEM. Ici.

Un contrôle négatif peut être observé pour un test de liaison effectué avec la protéine HTRA une à la place de la protéine S 100 B. D’accord, l’une des choses les plus importantes à propos de la procédure est que nous utilisons une approche sans amorce où nous n’avons pas de séquences fixes qui peuvent provoquer des faux positifs et des faux négatifs basés sur le, les séquences elles-mêmes submergeant la région aléatoire. Lors de cette procédure, il est important de s’assurer que la matrice d’ADN est détruite avant chaque réaction de transcription inverse, et de veiller à isoler le produit R-T-P-C-R spécifique après chaque réamplification.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.