Name: Visualisation et quantification des interactions intracellulaires des Neisseria meningitidis Et lhomme α-actinine par imagerie confocale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-24T17:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Découvrez la visualisation de la colocalisation de Neisseria meningitidis avec l'α-actinine intracellulaire dans les cellules endothéliales cérébrales humaines par microscopie confocale. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes d'entrée bactérienne.

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Les études ont été financées par le Wellcome Trust et la méningite Royaume-Uni. Lignée cellulaire HBMEC a été fourni par le Dr KS Kim. Imagerie confocale et la microscopie électronique ont été effectuées dans l&#39;installation de bio-imagerie Wolfson, Université de Bristol. Nous tenons également à remercier M. Alan Leard, le Dr Mark Jepson (Université de Bristol), et M. Alan Tilley (PerkinElmer) pour leur aide et leurs conseils.

1. Immunofluorescence Protocole Semis, maladies infectieuses et l'immuno-coloration Les procédures suivantes nécessitent convient de culture tissulaire de sécurité de niveau et des installations de laboratoire microbiologique. JOUR 1 A. Préparation des cellules cibles de l'infection <ol><li> HBMECs des semences à 50% de confluence (~ 1.5x10 4 cellules / cm 2) sur des lamelles de verre (16 mm de diamètre) placés dans une plaque de 12 puits (3,8 cm zone de croissance 2 / puits). Milieu de croissance: RPMI 1640 complété avec inactivés par la chaleur de 15% (56 ° C, 30min) FBS, 2 mM de glutamine, 1 mM pyruvate de sodium, 100 U / ml de pénicilline / streptomycine et 1% (v / v) MEM aminés non essentiels solution de 1% des acides et des vitamines MEM solution. </li><li> Culture pendant la nuit (O / N) à 37 ° C, dans un 5% de CO 2 incubateur. </li></ol> B. culture bactérienne <ol><li> Cultiver la souche d'intérêt O / N (16-18 h) sur le support de perfusion, par exemple Cœur nécessaire cervelle (BHI) gélose complétée par du sang de cheval 10% chauffé à 37 ° C en atmosphère de CO 2 5% 4. </li></ol> JOUR 2 A. Préparation de bactéries (N. meningitidis) Suspension <ol><li> En utilisant une boucle de la culture uL 10, faire une suspension de la culture bactérienne durant la nuit dans 2 mL PBSB (PBS avec du calcium et du magnésium). </li><li> Autoriser gros agrégats bactériens à régler en laissant la suspension reposer pendant 5 min à température ambiante (RT). </li><li> Sans perturber le culot, le transfert de la tranche supérieure de 1 mL de la suspension (stock d'inoculum) dans un tube stérile. </li><li> Pour estimer le nombre de bactéries dans l'inoculum bouillon, ajouter des aliquotes (20-50 uL) dans des tubes contenant des volumes de 1 ml de SDS 1% dans 0,1 M NaOH et mélanger délicatement pour solubiliser. </li><li> Mesurer la teneur en acide nucléique de la solution en déterminant l'absorbance à 260 nm (A260). Dans nos mains, A260 de 1 correspond à 5x10 8 unités formant colonie / ml (UFC / ml). Ceci peut être vérifié en préparant une série de dilutions de l'inoculum stock dans PBSB, étalement sur gélose et le comptage des colonies après O / N incubation. </li><li> Diluer une aliquote de l'inoculum d'actions dans le milieu d'infection [(M199 supplémenté avec 2% décomplémenté (56 ° C, 30min) du sérum humain normal (SHN)] pour obtenir la densité requise bactérienne pour l'infection de cellules cibles. <ol><li> Dans notre laboratoire, un ratio d'infection de 200-300 bactéries par cellule cible est couramment utilisé. </li></ol></li></ol> Infection B. Culture Cellulaire <ol><li> Lavez les lamelles avec des cellules cibles en culture 3 fois avec le milieu de Hank pour enlever toute trace d'antibiotiques. </li><li> Infecter les cellules fraîchement préparés suspensions bactériennes (décrit ci-dessus) pendant 3 h à 8 h à 37 ° C, en 5% de CO 2. </li><li> A la fin de la période d'infection, lavez les cellules trois fois avec du PBS et de fixer dans 500 ul de 2% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 30-45 min à température ambiante ou O / N à 4 ° C. <ol><li> Fixation paraformaldéhyde à la concentration et l'heure indiquées ci-dessus a été jugé approprié pour la conservation de la morphologie bactérienne et cellulaire. </li></ol></li><li> Après le lavage hors paraformaldéhyde, permeabilise les cellules paraformaldéhyde fixé par incubation dans 0,1% de Triton X-100 dilué dans du PBS pendant 10 min. </li><li> Laver les échantillons 3 fois avec PBS. </li><li> Passez à l'immuno-coloration ou, alternativement, laisser des échantillons de 500 pi de 1% de BSA / PBST O / N à 4 ° C. </li></ol> JOUR 3 Immuno-marquage Coloration des bactéries intracellulaires et α-actinine peuvent être réalisées successivement ou simultanément par l'utilisation d'anticorps appropriés primaire et secondaire comme suit: toutes les procédures peuvent être menées en plaques de 12 puits. <ol><li> Bloquer les lamelles contenant les cellules perméabilisées avec 500 pi de 3% de BSA / PBST (PBS contenant 0,05% de Triton X-100) pendant 30-60 min à température ambiante </li><li> Après un lavage avec du PBS, le transfert de chaque lamelle d'un nouveau puits à sec dans la plaque de 12 puits. </li><li> Ajouter les anticorps primaires contre les bactéries et les α-actinine, quatre-vingt à 100 uL d'anticorps par la lamelle est suffisante si elle est ajoutée soin de couvrir la surface de la lamelle. Incuber pendant 1h à température ambiante. <ol><li> Nous avons utilisé antisérum polyclonal de lapin contre Neisseria meningitidis (laboratoire levés) et la souris des anticorps monoclonaux (mAb) contre α-actinine (Abcam) simultanément. Dans certaines expériences, à la place de l'anti α-actinine, anticorps monoclonaux contre l'actine ou la vimentine ont été utilisés (Sigma). </li></ol></li><li> A la fin de l'incubation, ajouter 200 ul de PBS pour le bien, soulever la lamelle et la placer dans un nouveau puits contenant 500 ul de PBS. </li><li> Après 5 min, retirez du PBS par pipetage, puis ajouter du PBS frais. Répéter deux fois. Transfert à un couvre-nouveau puits à sec. </li><li> Ajouter l'anticorps secondaire approprié conjugué à des fluorochromes différents dilué dans 1% de BSA / PBST; incuber à température ambiante pendant 1h dans le noir. <ol><li> Pour la détection de bactéries, nous avons utilisé anti-lapin conjugué à la TRITC Ig et pour la détection de la protéine α-actinine et les autres du cytosquelette, nous avons utilisé Ig anti-souris conjugué à la FITC soit (Sigma) ou Alexa Fluor 488 - (Invitrogen). </li></ol></li><li> A la fin de l'incubation, laver comme dans les étapes 4 et 5. </li><li> Contre tache avec 0,6 mg / ml en PBS DAPI (colorant ADN) pendant 5 min à température ambiante dans l'obscurité. </li><li> Rincer avec du PBS. </li><li> Mont lamelles (cellules vers le bas) sur des lames avec une goutte de milieu de montage (e, g. Mowiol ou Vectashield) </li><li> Conserver dans l'obscurité à 4 ° C. </li><li> Les échantillons sont prêts pour l'observation au microscope. </li></ol> 2. Microscopie confocale à balayage laser (CLSM) Pour observer et capturer des images de bactéries intracellulaires et des éléments du cytosquelette, nous avons utilisé des échantillons immunomarquées et les images capturées en utilisant un Leica SP5-AOBS microscope confocal à balayage laser attaché à un Leica DM i6000 microscope à épifluorescence inversé. Toutes les images ont été recueillies en utilisant un 63x NA 1,4 objectif à immersion d'huile et le processus avec le logiciel Leica. Procédure de CLSM: <ol><li> Pour commencer la procédure CLSM, ajouter une goutte d'huile d'immersion à l'objectif et placer la lame spécimen, lamelle vers le bas, sur la platine du microscope. </li><li> Régler le microscope à un mode visuel et de trouver la zone d'intérêt en utilisant les oculaires du microscope. </li><li> Utilisation du logiciel Leica, sélectionnez le mode d'acquisition xyz. </li><li> Sélectionnez le format de 512 x 512 (taille d'image). Pour les études colocalisation, la plus haute résolution, la plus précise de l'image; en gardant à l'esprit la limite de résolution du microscope. Ensuite, sélectionnez le mode bidirectionnel X, ce qui augmentera la vitesse de balayage et d'aider à réduire la photo-blanchiment. </li><li> Mettre en place séquentielle des paramètres de numérisation. Cliquez dans le "seq" fonction et choisir l'un des modes de numérisation. Nous utilisons des «entre les lignes" mode. </li><li> Sélectionnez laser poutres selon les fluorochromes conjugués aux anticorps secondaire: 405 nm pour le DAPI (bleu), 488 nm pour Alexa Fluor 488 (vert) et 561 nm pour TRITC (rouge). Activer tube photomultiplicateur (PMT) 1, 2 et 3, respectivement. Réglez les paramètres de PMT pour détecter la longueur d'onde d'émission correcte. </li><li> Mettre en place des haut («commencer») et en bas («fin») de Z-piles ou une série. Ensuite, réglez le nécessaire "z-pas de taille". <ol><li> Neisseria meningitidis est un diplocoque (figure 1G) et puisque chaque coccus a un diamètre approximatif de 0,5 um, la taille z-étape de 0,20 um a été choisi pour renforcer la probabilité de scanner chaque coccus au moins deux fois. Il est également à la taille du pas pour une résolution optimale de 0,1 - 0,2 um. </li></ol></li><li> Définissez les paramètres de numérisation finale en choisissant une moyenne de 3 lignes pour améliorer le rapport signal sur bruit. </li><li> En cliquant sur "démarrer" images doubles ou triples colorées sont obtenues par balayage séquentiel différentes longueurs d'onde pour éliminer la diaphonie entre différents chromophores. </li><li> Pour une indication de la co-localisation des deux fluorochromes, sélectionnez l'option "overlay" fonction pour fusionner les canaux sélectionnés en une seule image, par exemple, lorsque les deux Alexa 488 (vert) et TRITC (rouge) fluorochromes colocalise, la couleur jaune apparaît dans l'image superposée . </li><li> Compiler z-piles ou une série en utilisant la "projection maximale" de fonction pour la construction d'une image 2D requis pour visualiser colocalisation possible. Une analyse plus détaillée de la co-localisation peut être obtenue par l'analyse de chaque section optique. </li><li> Après l'acquisition de la Z-piles ou une série, traiter vos données pour obtenir une image orthogonale pour la visualisation de la localisation intracellulaire des différents éléments (figure 1E). </li></ol> 3. Quantification de colocalisation Les analyses statistiques des images microscope confocal à balayage sont réalisées avec le logiciel Volocity (Improvisation, PerkinElmer). Ce logiciel offre un outil conçu spécifiquement pour l'analyse de co-localisation tels que décrits par Manders et al. (1993) 5. Colocalisation dans le contexte de l'imagerie de fluorescence numérique peut être décrite comme la détection d'un signal à la même voxel (volume pixel) l'emplacement de chaque canal. Les deux canaux sont constitués d'images de deux fluorochromes différents pris dans la zone même échantillon (guide de l'utilisateur Volocity). Les analyses statistiques sont réalisées avec le logiciel Volocity (Improvisation, PerkinElmer) en utilisant l'analyse quantitative colocalisation décrit ci-dessous. Analyse quantitative colocalisation <ol><li> Créer une bibliothèque avec des images en utilisant le logiciel Volocity CLSM. </li><li> Sélectionnez "focus étendue" de l'image dans la barre supérieure. Cet outil va compiler z-piles dans une image 2D à analyser. </li><li> Sélectionnez «colocalisation» de l'outil. Les deux canaux à analyser doit avoir la profondeur de la même couleur. </li><li> Sélectionnez la zone que ça va être quantifiés. Régler le seuil de supprimer tout fond. </li><li> Créer la sortie colocalisation en sélectionnant «générer colocalisation». Statistiques colocalisation sont générés pour les régions d'intérêt sélectionnées précédemment. </li><li> Sélectionnez Manders coefficients R (coefficient de recouvrement) et Ma (coefficient de co-localisation). <ol><li> Coefficients Manders ne sont pas sensibles à l'intensité de la coloration comme ils sont normalisés par rapport à l'intensité des pixels au total, de sorte qu'ils peuvent être employés lorsque la coloration d'un antigène est plus forte que l'autre. </li><li> Overlap R coefficient en fonction de Manders 5,6 représente le degré réel de colocalisation, c'est à dire le nombre de pixels qui colocalise par rapport au nombre total de pixels. </li><li> D'autre part, le coefficient de co-localisation, Mon, décrit la contribution de fluorescence de la fraction plus abondante (dans ce cas α-actinine, vert) à la moitié moins abondantes (dans ce cas, les bactéries, rouge), c'est à dire le nombre de pixels rouges qui se chevauchent avec des pixels verts par rapport au nombre total de pixels rouges. </li><li> Coefficients Manders comprise entre 1 et 0, 1 étant co-localisation haute, 0 aucun être, mais ils peuvent être exprimés en pourcentage pour faciliter l'interprétation. </li></ol></li><li> Les statistiques d'exportation des valeurs d'un document Excel pour la présentation des données. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Localisation intracellulaire des OPC exprimer Neisseria meningitidis et les α-actinine Imagerie confocale du cerveau humain cellules endothéliales microvasculaires infectés par Nm pour 3 et 8 heures comme décrit ci-dessus indiquée de colocalisation α-actinine et Nm, ce qui semblait être moins fréquents dans les trois expériences d'infection h (non montré) par rapport aux cultures infectées pendant 8 h ( Figure 1 AF). Une colocalisation démontrable de α-actinine avec OPC-exprimant méningocoques a été observée à chaque fois dans&gt; 5 expériences répétées. L'analyse statistique des co-localisation à partir de plusieurs images confocale a été réalisée comme décrit ci-dessus. Globalement, dans HBMEC infectés avec OPC-exprimant les méningocoques,&gt; 25% de chevauchement de la verdure (α-actinine) et rouge (Nm) pixels a été obtenue (figure 2B, Overlap coefficient R). Contrairement aux α-actinine, des expériences dans lesquelles l'étiquetage des bactéries internalisées et soit l'actine ou la vimentine a été réalisé, co-localisation occasionnelle a été observée avec l'actine mais avec la vimentine était rare (Figure. 2B). Les données ont également été analysés en utilisant le coefficient, Ma, qui prend en compte l'abondance relative de chaque fraction. Ma est une mesure de la fréquence d'apparition du signal plus abondante (dans ce cas, verte, α-actinine) chaque fois que le signal le moins abondant (dans ce cas, rouges, bactéries) se produit. Cette mesure montre un niveau frappant de survenance d'α-actinine dans les environs de intériorisé méningocoques (figure 2A et C). <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Microscopie confocale à balayage laser pour évaluer les interactions intracellulaires de N. meningitidis avec les α-actinine. AH. Confluent des monocouches endothéliales cultivées sur lamelles ont été infectés avec l'OPC-exprimant (AF) N. meningitidis. Après 8 h, non-adhérent bactéries ont été lavés, des cellules fixées avec du paraformaldéhyde et perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100. Par la suite, les bactéries et les α-actinine ont été colorées comme décrit ci-dessus (α-actinine, vert, bactéries, rouge). AC. Un champ de montrer des images xy de l'emplacement de Nm (A) ou α-actinine (B). La superposition d'image dans (C) indique plusieurs régions dans lesquelles couleur jaune-orange apparaît suggérant colocalisation. Les flèches en (A) et (B) montrent les régions où un haut degré de α-actinine l'accumulation semble avoir eu lieu autour des bactéries. D. Dissection optique d'une co-localisation HBMEC monocouche infectée indiquant autour des bactéries intracellulaires situé à la base d'une cellule. Encore une fois, cette co-localisation n'est pas due à la proximité accidentelle d'α-actinine, comme le général tache de α-actinine dans cette région est faible. E et F. images tridimensionnelles des monocouches infectées HBMEC traitées comme ci-dessus. Une vue oblique de la surface apicale (E) montre bactéries adhérentes colorés en rouge (flèche rouge), alors que plusieurs bactéries situées vers les surfaces basales des cellules endothéliales (flèche jaune) sont nettement orange / jaune. Lieu basale peut être plus clairement vu dans (F) qui est une fin en XZ section. G. Une image d'électron négatif teinté microscope de N. meningitidis montrant sondiplococcal prédominante à partir. Chaque coccus est d'environ 0,5 m de diamètre. <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Localisation et distribution des α-actinine, l'actine et la vimentine dans les cellules HBMEC. Monocouches A. infectée de HBMEC ont été traités comme décrit dans la légende ci-dessus mais en plus de α-actinine, quelques lamelles ont été utilisés pour la détection de l'actine ou la vimentine par procédure similaire à celle de α-actinine. Comme ci-dessus, α-actinine concentrées autour de plusieurs bactéries intériorisées (flèches blanches). Vimentine et l'actine n'a pas colocalise avec des bactéries à un niveau appréciable. Barre représente 20 um. B. &amp; C. Les valeurs des coefficients R et My ont été obtenus à partir de plus de trois expériences en utilisant le logiciel Volocity comme décrit précédemment.

<ol><li>Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanisms+of+interactions+of+Opc-expressing+meningococci+at+apical+and+basolateral+surfaces+of+human+endothelial+cells%3B+the+role+of+integrins+in+apical+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions.</a> Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).</li>
<li>Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opc-+and+pilus-+dependent+interactions+of+meningococci+with+human+endothelial+cells%3A+molecular+mechanisms+and+modulation+by+surface+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides.</a> Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).</li>
<li>Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+Opc+invasin+binds+to+the+cytoskeletal+protein+alpha-actinin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin.</a> Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).</li>
<li>Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pili+in+the+interactions+of+pathogenic+Neisseria+with+cultured+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells.</a> Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).</li>
<li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+colocalization+of+objects+in+dual+color+confocal+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Measurement of colocalization of objects in dual color confocal images.</a> Journal of Microscopy. 6, 357-382 (1993).</li>
<li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images%3A+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica+et+Cytochemica%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).</li>
</ol>

La possibilité de lier des intériorisé Opc exprimant Neisseria meningitidis aux α-actinine a été explorée à l&#39;aide HBMEC par l&#39;examen de la co-localisation de bactéries et de la protéine du cytosquelette dans les cellules infectées après 3 et 8 h d&#39;incubation. Par microscopie confocale, co-localisation de Neisseria meningitidis avec α-actinine a pu être démontrée. Notamment, bien que les bactéries ont été intériorisées à 3 h, il y avait co-localisation peu avec α-actinine à ce point dans le temps. Association bactérienne avec la protéine du cytosquelette semblait exiger une plus longue période de résidence intracellulaire après 8 h période d&#39;infection, un nombre important de bactéries avaient α-actinine, apparemment en étroite association. Alpha-actinine est une protéine multifonctionnelle, et les interactions des bactéries avec l&#39;élément du cytosquelette pourraient avoir une influence significative sur la fonction des cellules cibles, qui est un sujet d&#39;études en cours. La quantification des co-localisation comme décrit ci-dessus nécessite la préparation des échantillons méticuleux. Une attention particulière devrait être accordée à la fixation des échantillons, le blocage des dilutions époque et d&#39;anticorps. Pour le meilleur rapport signal sur bruit, chaque anticorps primaire et secondaire doit être augmentée par des expériences préliminaires pour déterminer les concentrations optimales. Dans notre expérience, le milieu de montage Mowiol produit de meilleures images.

1. Microscopie confocale à balayage laser (CLSM): Leica SP5 imagerie confocale système: Ce système, en utilisant une combinaison de AOTF (acousto-optique filtre accordable) et une AOBS (acousto-optique séparatrice), simplifie l&#39;excitation avec des longueurs d&#39;onde spécifiques. 2-logiciel: Leica confocale logiciels LCS, Leica Microsystems, en Allemagne. Volocity 5, Improvisation, PerkinElmer, USA.

visualisation et quantification des interactions intracellulaires des neisseria meningitidis et l&#39;homme α-actinine par imagerie confocale

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

La protéine Opc de Neisseria meningitidis (Nm, méningocoque) est une protéine exprimée en surface intégrante membrane externe, qui peut agir comme une adhésine et un invasine efficace pour les cellules humaines épithéliales et endothéliales. Nous avons identifié endothéliales surface située en tant que récepteurs intégrines majeur pour l&#39;OPC, un processus qui exige Opc pour lier des ligands de l&#39;intégrine premier telles que la vitronectine et via ces à la cellule-récepteurs exprimés 1. Ce processus conduit à l&#39;invasion bactérienne des cellules endothéliales 2. Plus récemment, nous avons observé une interaction des OPC avec une protéine 100kDa trouve dans lysats de cellules entières de cellules humaines 3. Nous avons d&#39;abord observé cette interaction lorsque les protéines de la cellule hôte séparées par électrophorèse et transférées sur nitrocellulose ont été superposées avec OPC-exprimant Nm. L&#39;interaction est directe et ne comportait pas de molécules intermédiaires. Par spectrométrie de masse, nous avons établi l&#39;identité de la protéine comme α-actinine. Comme aucune surface exprimée α-actinine a été trouvé sur une des lignes de huit cellules examinées, et que les interactions avec les cellules endothéliales Opc dans la présence de plomb sérique à l&#39;entrée des bactéries dans les cellules cibles, nous avons examiné la possibilité de deux protéines interagissant intracellulaire. Pour cela, le cerveau humain en culture des cellules endothéliales microvasculaires (HBMECs) étaient infectés par Opc exprimant Nm pour des périodes prolongées et les emplacements des bactéries internalisées et α-actinine ont été examinés par microscopie confocale. Nous avons observé en fonction du temps augmentation de co-localisation des Nm avec la protéine du cytosquelette, qui était considérable, après une période de huit heures d&#39;internalisation bactérienne. En outre, l&#39;utilisation de logiciels d&#39;imagerie quantitative nous a permis d&#39;obtenir une mesure relative de la co-localisation des Nm avec α-actinine et les autres protéines du cytosquelette. Nous présentons ici un protocole pour la visualisation et la quantification de la co-localisation de la bactérie à des protéines intracellulaires après l&#39;entrée des bactéries dans des cellules endothéliales humaines, bien que la procédure est également applicable aux cellules épithéliales humaines.

Neisseria meningitidis (Nm), un agent pathogène respiratoire gram négatif humaines spécifiques, peuvent se lier aux humains α-actinine. Nous présentons ici un protocole pour la visualisation de co-localisation de la bactérie intracellulaire avec des α-actinine après l&#39;entrée des bactéries dans les cellules humaines endothéliales microvasculaires du cerveau (HBMECs).

Visualisation et quantification des interactions intracellulaires des Neisseria meningitidis Et l&#39;homme α-actinine par imagerie confocale

La protéine Opc de Neisseria meningitidis (Nm, méningocoque) est une protéine intégrale de membrane externe exprimée à la surface, qui peut agir comme une adhésine et une ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer le degré de colocalisation des bactéries internalisées, RIA Meningitidis, avec la protéine cytosquelettique Alpha Actinine. Cela est réalisé en infectant des cellules microvasculaires cérébrales humaines cultivées avec une culture bactérienne de nuit pendant trois à huit heures, afin de permettre aux bactéries d'entrer dans les cellules cibles. Dans une deuxième étape, les cellules contenant des bactéries intracellulaires sont lavées, fixées, puis perméabilisées, ce qui prépare la culture infectée à la coloration immunohistochimique des bactéries internalisées et de l'alpha actinine intracellulaire.Après l'imagerie confocale et l'application d'un logiciel de colocalisation, les images de la colocalisation intracellulaire peuvent être observées et des résultats quantitatifs sont obtenus, montrant que Meninga Croci exprimant les OPC ainsi que la protéine membranaire peuvent interagir spécifiquement avec l'alpha-actinine intracellulaire, selon la visualisation en microscopie confocale et une analyse quantitative de colocalisation. Bonjour, je suis Isel Maria du laboratoire du professeur Mata TI au Département de médecine cellulaire et moléculaire de l'Université de Bri. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'estimer le niveau de col, le rapport de bactéries intracellulaires avec les protéines du cytosquelette.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier une interaction entre la méningite mycélienne exprimant une protéine membranaire autochtone OPC et la protéine du cytosquelette alpha-actine. Commençons donc. Ce travail doit être effectué dans un laboratoire de sécurité adéquat.Deux jours avant la procédure de coloration immuno, ensemencer la souche bactérienne d'intérêt sur gélose au bouillon cerveau-cœur. Incuber les géloses supplémentées avec 10 % de sang de cheval chauffé à 37 degrés Celsius pendant la nuit dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone, la veille de la coloration immuno. Utiliser une boucle de culture de 10 microlitres pour préparer une suspension de la culture bactérienne de nuit.Dans deux millilitres de PBSB, laissez la suspension reposer pendant cinq minutes à température ambiante afin de permettre la décantation des grands agrégats bactériens. Ensuite, transférez le millilitre supérieur de la suspension dans un tube stérile sans perturber le culot, puis solubilisez les bactéries en ajoutant un millilitre de SDS à 1 % et d'hydroxyde de sodium 0,1 molaire à deux vials contenant chacun 20 microlitres de suspension bactérienne, et retournez le tube pour homogénéiser. Pour estimer le nombre de bactéries.Mesurez la teneur en acide nucléique en déterminant l'absorbance de la solution. À 216 anters, ajustez la suspension bactérienne à la densité requise dans le milieu d'infection pour infecter les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales humaines. Les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales humaines ou H-B-M-E-C-A, semées deux jours avant la coloration immunologique, ont été placées sur des lamelles en verre de 16 millimètres dans les puits d'une plaque de 12 puits, et les cellules HBME ont été semées à une confluence de 50 % sur les lamelles, puis incubées toute la nuit à 37 degrés Celsius dans une atmosphère à 5 % de dioxyde de carbone ; le jour suivant.Infecter les cellules avec la suspension bactérienne fraîchement préparée dans notre laboratoire. Un ratio d'infection de 200 à 300 unités formant colonies par cellule cible est couramment utilisé. Incuber de trois à huit heures à 37 °C en présence de 5 % de dioxyde de carbone à la fin de la période d'infection.Lavez les cellules trois fois avec du PBS et fixez-les avec 500 microlitres de paraformaldéhyde à 2 % pendant 30 à 45 minutes à température ambiante. Après avoir éliminé le paraformaldéhyde, percez les cellules fixées au paraformaldéhyde en les incubant dans du Triton X-100 à 0,1 % dilué dans du PBS pendant 10 minutes. Lavez enfin les échantillons trois fois avec du PBS et procédez au marquage immunohistochimique comme indiqué. La coloration des bactéries intracellulaires et de l’α-actinine peut ensuite être réalisée simultanément.Dans des plaques de 12 puits, bloquer les lamelles contenant les cellules perméabilisées avec 500 microlitres de PBS-T contenant 3 % de BSA pendant 30 à 60 minutes. Après lavage avec du PBS, transférer chaque lamelle à température ambiante dans un nouveau puit sec de la plaque de 12 puits, en ajoutant simultanément les anticorps primaires dirigés contre les bactéries et l'alpha-actinine ; 80 à 100 microlitres d'anticorps par lamelle suffisent si l'on ajoute soigneusement pour recouvrir toute la surface de la lamelle. Incuber pendant une heure à température ambiante. À la fin de l'incubation, ajouter 200 microlitres de PBS au puit, soulever la lamelle et la placer dans un nouveau puit contenant 500 microlitres de PBS. Après cinq minutes, éliminer le PBS par pipetage, puis ajouter du PBS frais. Répéter deux fois et transférer les lamelles dans un nouveau puit sec.Ensuite, ajoutez les anticorps secondaires appropriés conjugués à différents fluorochromes, dilués dans du 1 % B-S-A-P-B-S-T. Incubez une heure à température ambiante à l'abri de la lumière. À la fin de l'incubation, effectuez un lavage comme indiqué précédemment, puis contrecolorez l'ADN avec du DPI pendant cinq minutes à température ambiante à l'abri de la lumière. À la fin de cette incubation, rincez les lamelles dans du PBS une fois, puis montez-les avec une goutte de milieu de montage. Les lamelles montées doivent être conservées à l'abri de la lumière jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à être observées. Au microscope, nous observons et capturons des images de nos échantillons immunomarqués à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser couplé à un microscope à fluorescence episcopique inversé.Pour commencer la procédure de microscopie confocale à balayage laser, déposez une goutte d'immersion sur l'objectif et placez la lame de spécimen, faites-la glisser sur la platine du microscope, réglez le microscope en mode visuel et localisez la zone d'intérêt à l’aide des oculaires du microscope. Nous sommes désormais prêts à utiliser le logiciel Leica. Sélectionnez le mode d'acquisition XY zed. Choisissez le format cinq 12 par cinq 12 pour les études de colocalisation.Plus la résolution est élevée, plus l'image est précise. Ensuite, sélectionnez le mode X bidirectionnel, ce qui augmentera la vitesse de balayage et aidera à réduire le photoblanchiment. Configurez les paramètres de balayage séquentiel.Cliquez sur la fonction SEC, puis sélectionnez entre les lignes. Choisissez les faisceaux laser en fonction des fluorochromes conjugués aux anticorps secondaires : 405 nanomètres pour DAPI, 488 nanomètres pour Alexa Fluor 488 et 561 nanomètres.Pour trixy, activez respectivement les tubes photomultiplicateurs un, deux et trois. Réglez le haut et le bas de la pile ou de la série en Z. Ensuite, réglez la taille du pas de Z à 0,2 micromètre.RIA Mencius est un diplocoque et, puisque chaque coccie a un diamètre approximatif de 0,5 micromètre, une taille de pas Z de 0,2 micromètre augmente la probabilité de balayer chaque coccie au moins deux fois. Définissez les paramètres finaux de balayage en sélectionnant une moyenne sur trois lignes afin d'améliorer le rapport signal sur bruit, puis cliquez sur démarrer. Des images doublement ou triplement marquées sont obtenues par balayage séquentiel à différentes longueurs d'onde et en utilisant le mode entre les lignes pour chaque canal afin d'éliminer les interférences entre les différents chromophores.Pour évaluer la colocalisation de deux fluorochromes, sélectionnez la fonction de superposition afin de fusionner les canaux sélectionnés en une seule image. Par exemple, lorsque les deux fluorochromes Alexa 488 et trissy se colocalisent, une couleur jaune apparaîtra sur l'image superposée. Pour une reconstruction 2D nécessaire à la visualisation d'une éventuelle colocalisation, compilez la pile Z ou la série à l'aide de la fonction de projection maximale. Après avoir acquis la pile Z ou la série, traitez vos données afin d'obtenir une image orthogonale permettant de visualiser la localisation intracellulaire de divers éléments.La quantification de la colocalisation est effectuée à l'aide du logiciel Vol City fourni par IMP. Pour commencer, créez une bibliothèque contenant des images de microscopie à balayage laser (CLSM), puis sélectionnez la fonction de mise au point étendue dans l'image située dans la barre supérieure. Cet outil combinera les coupes Z en une image 2D à analyser.Sélectionnez maintenant l'outil de COLICALISATION. Les deux canaux à analyser doivent avoir la même profondeur de couleur. Sélectionnez la zone qui sera quantifiée.Réglez le seuil pour supprimer tout fond. Créez un résultat de colocalisation en sélectionnant « générer la colocalisation ». Des statistiques de colocalisation seront générées pour les régions d'intérêt sélectionnées précédemment.Ensuite, sélectionnez les coefficients de Mander R et ny. Enfin, exportez les valeurs statistiques vers un document Excel pour la présentation des données ; ci-dessous, des résultats représentatifs d'imagerie confocale de cellules endothéliales cérébrales humaines infectées par *meninga cockeye* pendant huit heures. L'emplacement des bactéries est indiqué en rouge.Bien que la localisation de l'alpha-actinine soit indiquée en vert, des flèches vertes montrent des régions où un fort degré d'accumulation d'alpha-actinine semble s'être produit autour des bactéries. Sur cette image de superposition, plusieurs régions présentent une couleur jaune orangé, suggérant une colocalisation entre *meninga occi* et l'alpha-actinine. Sur cette image suivante, une dissection optique d'une monocouche de H-B-M-E-C infectée indique une colocalisation autour de bactéries intracellulaires situées à la base d'une cellule.Lorsque des images tridimensionnelles de monocouches H-B-M-E-C infectées ont été traitées, une vue oblique de la surface apicale montre une bactérie Durant colorée en rouge, indiquée par la flèche rouge, où plusieurs bactéries sont localisées vers les surfaces basales des cellules endothéliales, indiquées par la flèche jaune. Un emplacement basal nettement orangé, de couleur jaune, peut être vu plus clairement dans cette coupe transversale XZ d'endon. Contrairement à afar, les expériences d'actinine au cours desquelles un marquage des bactéries internalisées et de menton ou d'actine a été effectué révèlent une colocalisation occasionnelle avec l'actine, mais une colocalisation rare avec fermenting dans les cellules H-B-M-E-C.Comme observé dans les expériences précédentes, la rétine était concentrée autour de plusieurs bactéries internalisées indiquées par les flèches blanches. Les données ont également été analysées afin d'obtenir un chevauchement relatif. Le coefficient R, qui selon Manda représente le véritable degré de colocalisation IE, c'est-à-dire le nombre de pixels colocalisés par rapport au nombre total de pixels, ainsi que les valeurs NY pour l'alpha-actinine, la méningocine et l'actine dans l'ensemble des H-B-M-E-C infectées par des OPC exprimant des méningocoques, a révélé un chevauchement supérieur à 25 % entre la rétine et les méningocoques.Le coefficient et Y constituent une mesure de la fréquence d'une devise du signal de rein plus abondant à chaque occurrence du signal de méningocoque cacao moins abondant. Cette mesure révèle un niveau remarquable de présence d'alpha-actinine aux alentours des méningocoques internalisés. Nous allons simplement vous montrer comment visualiser et quantifier l'introduction de bactéries internalisées avec les éléments du cytosquelette dans le cadre de cette expérience.Il est important de se rappeler de suivre strictement les protocoles de fixation et d'immunomarquage afin de préserver l'intégrité des structures et d'éviter un fond élevé. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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