Visualisation et quantification des interactions intracellulaires des Neisseria meningitidis Et l'homme α-actinine par imagerie confocale

L’objectif global de l’expérience suivante est d’évaluer le niveau de colocalisation de la bactérie internalisée, RIA Meningitidis, avec la protéine cytosquelettique Alpha Actinin. Ceci est réalisé en infectant des cellules microvasculaires du cerveau humain en culture avec une culture nocturne de bactéries pendant trois à huit heures pour permettre aux bactéries de pénétrer dans les cellules cibles. Dans un deuxième temps, les cellules contenant des bactéries intracellulaires sont lavées, fixées, puis imprégnées, ce qui prépare la culture infectée à l’immunocoloration des bactéries internalisées et de l’alpha-actinine intracellulaire.

Suite à l’imagerie confocale et à l’application d’un logiciel de colocalisation, des images de la colocalisation intracellulaire peuvent être observées et des résultats quantifiés sont obtenus qui montrent que Meninga Croci exprimant l’OPC et la protéine membranaire peut interagir spécifiquement avec l’alpha-actinine intracellulaire sur la base d’une visualisation microscopique confocale et d’une analyse quantitative de colocalisation. Bonjour, je m’appelle Isel Maria et je travaille au laboratoire du professeur Mata TI au Département de médecine moléculaire cellulaire de l’Université de Bri. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’estimation du niveau de col, rapport entre les bactéries intracellulaires et les protéines cytosquelettiques.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier une interaction de la méningite à mycélium exprimant une protéine OPC automembranaire avec la protéine alpha actine du cytosquelette. Alors, commençons. Ce travail doit être effectué dans un laboratoire de sécurité adéquat.

Deux jours avant la procédure d’immunomarquage, inoculer la coloration bactérienne d’intérêt sur la perfusion cerveau-cœur. Les plaques de gélose complétées avec 10 % de sang de cheval chauffé poussent pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 % la veille de l’immunocoloration. Utilisez une boucle de culture de 10 microlitres pour faire une suspension de la culture bactérienne pendant la nuit.

Dans deux millilitres de PBSB, laisser reposer la suspension pendant cinq minutes à température ambiante pour permettre aux gros agrégats bactériens de se déposer. Ensuite, transférez le millilitre supérieur de la suspension dans un tube stérile sans perturber les bactéries de solubilisation des pastilles En ajoutant un millilitre d’hydroxyde de sodium à 1 % de SDS 0,1 molaire dans deux flacons contenant 20 microlitres de suspension bactérienne et retournez le tube pour mélanger. Estimer le nombre de bactéries.

Mesurez la teneur en acide nucléique en déterminant l’absorbance de la solution. À 216 anteux, ajustez la suspension bactérienne à la densité requise dans le milieu d’infection pour infecter les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain. Les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain ou H-B-M-E-C-A ensemencées deux jours avant l’immunocoloration placées Couvercle en verre de 16 millimètres glisse dans les puits d’une plaque à 12 puits et ensemence les mers HBME à 50 % Confluence sur les lamelles de couverture incubent pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 % le lendemain.

Infectez les cellules avec la suspension bactérienne fraîchement préparée dans notre laboratoire. Un taux d’infection de 200 à 300 unités formant colonie par cellule cible est couramment utilisé. Incuber pendant trois à huit heures à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone à la fin de la période d’infection.

Laver les cellules trois fois avec du PBS et fixer 500 microlitres de para formaldéhyde à 2 % pendant 30 à 45 minutes à température ambiante Après avoir lavé le para formaldéhyde, perméez les cellules fixées au paraldéhyde en les incubant dans 0,1 % de Triton X 100 dilué dans du PBS pendant 10 minutes. Enfin, lavez les échantillons trois fois avec du PBS et procédez à l’immunocoloration comme indiqué. Ensuite, la coloration des bactéries intracellulaires et de l’actinine dfor peut être effectuée simultanément.

Dans des plaques à 12 puits, bloquez les lamelles contenant les cellules perméables avec 500 microlitres de 3 % B-S-A-P-B-S-T pendant 30 à 60 minutes. À température ambiante après lavage avec transfert PBS, chaque lamelle de couverture vers un nouveau puits sec dans la plaque à 12 puits au niveau des anticorps primaires contre les bactéries et l’alpha actinine simultanément 80 à 100 microlitres d’anticorps par lamelle de couverture est suffisante si elle est ajoutée soigneusement pour couvrir la surface de la lamelle, incuber pendant une heure à température ambiante À la fin de l’incubation, ajoutez 200 microlitres de PBS dans le, soulevez bien la lamelle et placez-la dans un nouveau puits contenant 500 microlitres de PBS Après cinq minutes, retirez le PBS par pipetage, puis ajoutez du PBS frais. Répétez deux fois et transférez les glissements du couvercle dans un nouveau puits sec.

Ensuite, ajoutez les anticorps secondaires appropriés conjugués à différents fluorochromes dilués dans 1 % B-S-A-P-B-S-T Incuber la température ambiante pendant une heure dans l’obscurité à la fin de l’incubation, le lavage est montré précédemment, puis contre-colorer l’ADN avec DPI pendant cinq minutes à température ambiante dans l’obscurité à la fin de cette incubation, laver le couvercle se glisse une fois dans le PBS, puis monter avec une goutte de montage. Les lamelles de protection montées de taille moyenne doivent être entreposées dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être observées. Au microscope, nous observons et capturons des images de nos échantillons immunomarqués à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser fixé à un microscope à épifluorescence inversée.

Pour commencer la procédure CLSM à une chute d’immersion sur l’objectif et placer le couvercle de la lame de l’échantillon, le glisser sur la platine du microscope, régler le microscope sur un mode visuel et trouver la zone d’intérêt à l’aide des oculaires du microscope, nous sommes maintenant prêts à utiliser le logiciel Leica. Sélectionnez le mode d’acquisition XY zed. Sélectionnez le format cinq 12 par cinq 12 pour les études de colocalisation.

Plus la résolution est élevée, plus l’image est précise. Sélectionnez ensuite le mode X bidirectionnel, qui augmentera la vitesse de numérisation et aidera à réduire le blanchiment des photos. Configurez les paramètres de balayage séquentiel.

Cliquez dans la fonction SEC, puis sélectionnez entre les lignes. Sélectionnez les faisceaux laser en fonction des fluorochromes conjugués aux anticorps secondaires. 4 0 5 nanomètres pour DPI 4 88 nanomètres Pour Alexa, Fluor 4 88 et 5 61 nanomètres.

Pour trixy, activez respectivement les tubes photomultiplicateurs un, deux et trois. Configurez le haut et le bas de la pile ou de la série Z. Ensemble suivant, taille du pas Zed à 0,2 micromètre.

RIA Mencius est un diplo occus et comme chaque caucus a un diamètre approximatif de 0,5 micromètre, une taille de pas Z de 0,2 micromètre augmente la probabilité de balayer chaque caucus au moins deux fois. Réglez les paramètres de balayage finaux en sélectionnant une moyenne de ligne de trois pour améliorer le rapport signal/bruit en cliquant sur Démarrer. Les images à double ou triple coloration sont obtenues par balayage séquentiel à différentes longueurs d’onde et en utilisant le mode entre les lignes pour chaque canal afin d’éliminer la diaphonie entre les différents chromophores.

Pour une indication de colocalisation de deux fluorochromes, sélectionnez la fonction de superposition pour fusionner les canaux sélectionnés en une seule image. Par exemple, lorsque Alexa 4 88 et trissy Fluor Chromes colocalisent la couleur jaune apparaîtra dans l’image superposée pour Une reconstruction 2D requise pour visualiser une éventuelle colocalisation compile Zed pile ou série à l’aide de la fonction de projection maximale. Après l’acquisition de la pile Z ou de la série, traitez vos données pour obtenir une image orthogonale pour la visualisation de la localisation intracellulaire de divers éléments.

La quantification de la colocalisation est effectuée à l’aide du logiciel Vol City de la fourniture IMP. Pour commencer à créer une bibliothèque avec des images CLSM, sélectionnez le focus étendu dans l’image dans la barre supérieure. Cet outil combinera Zacks dans une image 2D à analyser.

Sélectionnez maintenant l’outil de COLOCALISATION. Les deux canaux à analyser doivent avoir la même profondeur de couleur. Sélectionnez la zone qui va être quantifiée.

Définissez le seuil pour supprimer tout arrière-plan. Créez une sortie de colocalisation en sélectionnant Générer la colocalisation. Des statistiques de colocalisation seront générées pour les régions d’intérêt sélectionnées précédemment.

Ensuite, sélectionnez les coefficients de mander R et ny. Enfin, exportez nos valeurs statistiques vers un document Excel pour la présentation des données montrant ici les résultats représentatifs de l’imagerie confocale des cellules endothéliales du cerveau humain infectées par le méninga cockeye pendant huit heures. L’emplacement des bactéries est indiqué en rouge.

Alors que l’emplacement de l’alpha-actinine est indiqué en vert, les flèches indiquent les régions où un degré élevé d’accumulation d’alpha-actinine semble s’être produit autour des bactéries. Dans cette image de superposition, il y a plusieurs régions dans lesquelles la couleur jaune-orange apparaît, suggérant une colocalisation entre le méninga occi et l’alpha actinine. Dans l’image suivante, la dissection optique d’une monocouche infectée H-B-M-E-C indique une colocalisation autour de bactéries intracellulaires situées à la base d’une cellule.

Lorsque des images tridimensionnelles de monocouches H-B-M-E-C infectées ont été traitées, une vue oblique de la surface apicale montre une bactérie Durant colorée en rouge indiquée par la flèche rouge tandis que plusieurs bactéries se sont localisées vers les surfaces basales des cellules endothéliales indiquées par la flèche jaune. Une position basale distinctement orange, de couleur jaune, peut être plus clairement observée dans cette coupe transversale de l’endon XZ. Contrairement à afar, les expériences sur l’actinine dans lesquelles le marquage des bactéries internalisées et du menton ou de l’actine a été effectué révèle une colocalisation occasionnelle avec l’actine, mais une colocalisation rare avec la fermentation dans les cellules H-B-M-E-C.

Comme observé dans les expériences précédentes, Retin était concentré autour de plusieurs bactéries internalisées indiquées par les flèches blanches. Les données ont également été analysées pour obtenir un chevauchement relatif. Le coefficient R, qui selon Manda, représente le véritable degré de colocalisation IE, le nombre de pixels qui colocalisent par rapport au nombre total de pixels et les valeurs NY pour l’alpha actinine, menting et l’actine globale dans H-B-M-E-C infecté par l’OPC exprimant le méningocoque, un chevauchement supérieur à 25 % de la rêne chez un méningocoque a été obtenu.

Le coefficient et Y est une mesure de la fréquence d’une monnaie du signal de rêne le plus abondant chaque fois que le signal de méninga cacao moins abondant se produit. Cette mesure montre un niveau frappant d’occurrence de l’alpha actinine au voisinage de la méninga intériorisée. Nous vous montrons simplement comment visualiser et quantifier l’introduction de bactéries internalisées avec des éléments du cytosquelette dans cette expérience.

Il est important de se rappeler de suivre strictement les protocoles de fixation et de tige immunitaire pour maintenir l’intégrité des structures et éviter un arrière-plan élevé. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.