Name: Mesure de lactivité calpaïne dans des cellules fixées et de la Vie par cytométrie en flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Découvrez comment mesurer l'activité calpaïne dans des cellules fixées et vivantes par cytométrie en flux. Cette méthode utilise le substrat fluorescent BUC, LMC MAC pour surveiller l'activité protéasique.

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Soutenu par des subventions des Instituts canadiens de recherche en santé, La Société de leucémie et lymphome du Canada et la Fondation Lymphome du Canada.

Préparer des réactifs Note: Tous PBS contient Ca 2 + et Mg 2 + <ol><li> Réactif de détection Ajouter 20μM 7-amino-4-chlorométhyl coumarine, t-BOC-Leucine-méthionine amide (BOC-LM-CMAC) à la température ambiante du PBS. Chaque suspension cellulaire exigera réactif de détection 2mL. </li><li> Paraformaldéhyde 1% (cellules fixées) Diluer 4% paraformaldéhyde solution stock à la température ambiante du PBS. Paraformaldéhyde Aliquoter 1mL de 1% à chaque tube FACS. Trois tubes FACS sont requis pour chaque condition expérimentale (ex. 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 besoin de 9 tubes FACS) </li><li> PD150606 (inhibiteur de calpaïne) Reconstituer PD150606 dans le DMSO à une concentration finale de 100 mM. Protégez ce réactif et de toutes les cellules traitées avec elle de la lumière pendant la durée de cette expérience. </li><li> PD98059 (MEK1 inhibiteur) Reconstituer PD98059 dans le DMSO à une concentration finale de 50 mM. </li></ol> Préparer les cellules <ol><li> Cultiver des cellules 32Dkit à 5 x 10 5 à 1 x 10 6 cellules par millilitre dans les médias Opti-MEM supplémenté avec 5% de sérum bovin fœtal, WEHI-3 surnageant comme une source d'IL-3 (ou toute autre source d'IL-3 tels comme protéine recombinante), 0,1% de 2-mercaptoéthanol et des antibiotiques. </li><li> Prélever 12 x 10 6 cellules dans des tubes Falcon 32Dkit trois 15mL (4 x 10 6 cellules par tube). </li><li> Pellet les cellules à 1000 rpm pendant 5 minutes à 15 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant. Resuspendre les cellules dans 2 ml de PBS température ambiante. </li><li> Traiter une suspension cellulaire avec 50 microns PD150606. S'assurer que l'échantillon est protégé de la lumière en couvrant le tube Falcon de papier d'aluminium. Vortex brièvement puis incuber pendant vingt à trente minutes à température ambiante dans l'obscurité. </li><li> Traiter la suspension cellulaire seconde avec 20μM PD98059. Assiette des cellules dans une boîte de culture tissulaire de 35 mm et incuber pendant 2 heures à 37 ° C. </li></ol> Assay calpaïne dans des cellules fixées <ol><li> Alors que les échantillons sont incubation avec PD150606, commencer le dosage calpaïne sur les échantillons non traités. Commencez par ajouter 2mL réactif de détection à chaque suspension cellulaire. Immédiatement ajouter 1ml de la suspension cellulaire / mélange de réactifs de détection pour les tubes préalablement préparé FACS avec du paraformaldéhyde 1% (0 point dans le temps minutes). </li><li> Incuber les suspensions cellulaires avec le réactif de détection pendant 5 minutes à température ambiante. Puis ajoutez 1 ml de la suspension cellulaire dans un tube à FACS avec 1mL paraformaldéhyde 1%. </li><li> Poursuivre l'incubation des suspensions cellulaires avec le mélange de détection pour un supplément de 5 minutes à température ambiante. Puis ajoutez 1 ml de la suspension cellulaire dans un tube à FACS avec 1mL paraformaldéhyde 1%. </li><li> Répéter test calpaïne sur les cellules 32Dkit qui ont été traités avec des inhibiteurs. </li><li> Fixer les cellules pendant la nuit dans l'obscurité à 4 ° C. </li><li> Le lendemain un culot cellulaire à 1800 rpm pendant 5 minutes à 15 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant. Resuspendre les cellules dans 750uL PBS. Placez les cellules sur la glace et de garder dans l'obscurité. </li></ol> Acquérir des données pour des cellules fixées <ol><li> Analyser les cellules en utilisant une II LSR (BD Bioscience). Les filtres sont fixés pour l'Xcyte Lightwave (UV) au laser, ligne d'excitation 355nm 25mW et laser de puissance, l'émission de 405 et 450 nm pour le substrat et le produit respectivement. Filtres passe-bande pour le substrat et de produit sont 405/20 450/50 et. Filtres passe longue pour le substrat et de produit sont 405 et 450. La tension a été mis sur le PMT 350-375 pour le substrat et 325-350 pour le produit. </li><li> Mise en place d'une expérience BD FACSDiva avec les paramètres suivants: diffusion vers l'avant; diffusion latérale; indo-1 Blue (log); Indo-1 Violet (log). Sur la feuille de calcul mis en place les graphiques suivants: diffusion vers l'avant vs dot plot côté de dispersion avec une porte sur des cellules vivantes (figure 1a), indo-1 histogramme bleu, indo-1 histogramme Violet, indo-1 Blue vs indo-1 Violet dot plot. </li><li> Calibrer le LSR II avec AlignFlow et AlignFlow ainsi perles fluorescentes (Invitrogen). La tension PMT devrait être ajusté à placer le pic de l'histogramme de fluorescence billes dans le même canal avant chaque expérience. </li><li> Commencer à acquérir des données en utilisant les cellules 32Dkit au point 0 minutes de temps. Ajustez les tensions paramètre comme nécessaire. Acquérir et enregistrer 10.000 manifestations par échantillon. </li><li> Répétez l'acquisition pour chaque échantillon, le rinçage de la machine avec un tampon de FACS entre chaque tube. </li><li> Exporter les données. Assurez-LSR II est nettoyé conformément aux directives de l'institut. </li></ol> Assay calpaïne dans des cellules vivantes <ol><li> Préparer les suspensions de cellules comme ci-dessus, sans PD150606. Apportez les échantillons au LSR II et mettre en place des filtres et des paramètres comme ci-dessus. Mettre en place la feuille de calcul que ci-dessus. Inclure une dot plot grand format indo-1 bleu en fonction du temps. Régler le programme d'acquisition de la NUM maximalenombre d'événements (pas de porte d'arrêt). </li><li> Ajouter 50 microns PD150606 à une suspension cellulaire de cellules 32Dkit. Conserver l'échantillon dans l'obscurité et incuber à température ambiante pendant 20-30 minutes. </li><li> Commencer à acquérir des données sur la suspension cellulaire 32Dkit sans PD150606. Utilisez un faible débit de 200-300 événements par seconde. Après 30 secondes à 1 minute, retirer le tube de la machine. Ajouter 20μM BOC-LM-CMAC dans les cellules. Vortex brièvement puis continuer l'acquisition des données. </li><li> Acquérir des données pendant 10-20 minutes ou jusqu'à ce que les plateaux d'activité calpaïne. </li><li> Répétez les étapes 3 et 4 avec des cellules traitées avec 32Dkit PD150606. </li><li> Exporter les données. Assurez-LSR II est nettoyé conformément aux directives de l'institut. </li></ol> Assay calpaïne dans le Complexe populations cellulaires (Mixte) * Cette expérience permettra d'identifier les cellules 32Dkit dans une suspension de cellules récoltées à partir d'un rate de souris. <ol><li> Récolte de la rate de chaque souris. Lyse des globules rouges avec NH 4 Cl pendant 10 minutes à température ambiante. </li><li> Préparer les suspensions de cellules simples dans 2mL de PBS. </li><li> Diviser chaque suspension cellulaire en deux. Traiter une suspension cellulaire avec 50 microns PD150606 pendant 20-30 minutes à température ambiante dans l'obscurité. </li><li> Procédez comme précédemment pour le dosage de la calpaïne dans des cellules fixes (étapes 1-6) </li><li> Aspirer le surnageant. Laver les cellules dans 500μL de PBS. Aspirer le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules dans un tampon de coloration 200 pl avec BSA 2%. Incuber pendant 15 minutes à température ambiante. </li><li> Préparer l'anticorps primaire (FITC anti-souris CD117). L'anticorps doit être utilisé à une dilution 1:200 dans la coloration de mémoire tampon. Assurer l'anticorps est maintenu dans l'obscurité. </li><li> Ajouter 200 ul d'anticorps primaires pour les cellules. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante dans l'obscurité. </li><li> Ajouter 400μL de PBS pour augmenter le volume pour la cytométrie de flux. Placez les cellules sur la glace et de garder dans l'obscurité. </li><li> Procédez comme décrit dans l'acquisition de données pour les cellules fixes. Ajouter FITC aux paramètres et notamment un histogramme pour FITC sur la feuille de calcul. </li></ol> Analyse et résultats représentatifs <ol><li> Analyser les données en utilisant FlowJo (Treestar). Porte sur des cellules vivantes en fonction du profil de dispersion vers l'avant et de côté (figure 1a). Déterminer la moyenne de fluorescence pour les Indo-bleu de la porte de cellules viables (figure 1b). </li><li> a) Pour la population de cellules mixtes <ul><li> l'utilisation fluorescence FITC sur des parcelles histogrammes et dot pour identifier la population 32Dkit </li><li> Déterminer la moyenne de fluorescence pour les Indo-bleu de la population 32Dkit </li></ul></li><li> Utilisez Microsoft Excel pour représenter graphiquement la moyenne de fluorescence (figure 2a). Calculer la pente de la ligne entre 5 et 10 minutes. Graphique de la pente comme un diagramme pour déterminer l'activité calpaïne dans les cellules (Figure 2b). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1a.jpg" alt="Figure 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1a"> Figure 1a. Déterminer les cellules vivantes en fonction du profil de dispersion avant et latérale. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1b.jpg" alt="Figure 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1b"> Figure 1b. Variation moyenne de fluorescence plus de 10 cours du temps minute. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2a.jpg" alt="Figure 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2a"> Figure 2a. Représentant graphique de la fluorescence moyenne. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2b.jpg" alt="Figure 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2b"> Figure 2b. Activité de la calpaïne dans les cellules avec des inhibiteurs 32Dkit.

<ol><li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li>
<li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li>
<li>Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+ERK%2FMAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li>
</ol>

L&#39;activité calpaïne dans les cellules 32Dkit fixe et la vie a été déterminée dans ce protocole vidéo. Traitement de la lignée cellulaire avec l&#39;inhibiteur de calpaïnes PD150606 entraîné une inhibition complète de l&#39;activité calpaïne dans les cellules. En outre, le traitement avec l&#39;inhibiteur de MEK1 PD98059 entraîné une inhibition complète de l&#39;activité calpaïne dans les cellules. ERK est un important activateur de la calpaïne-2 3. Ces résultats suggèrent que l&#39;activité calpaïne-2 est...

<table><tbody><tr><td>PBS BOC-LM-CMAC 4 % paraformaldéhyde</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Dissoudre 4 g de paraformaldéhyde dans 100 mL de PBS. Dans la hotte, chauffer l'échantillon avec agitation jusqu'à obtention d'une solution limpide.&lt;br/&gt;Laisser refroidir, puis conserver à 4 °C.&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>PD150606</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Utilisez du PD150606 fraîchement reconstitué pour une inhibition maximale de la calpaïne.</td></tr><tr><td>PD98059</td><td>Cell Signaling Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlignFlow, AlignFlow plus tubes FACS avec billes fluorescentes</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>&lt;br/&gt;Le surnageant de cellules WEHI-3 est utilisé comme source d'IL-3 dans ces expériences. Chaque prélèvement de surnageant de WEHI-3 est titré afin de déterminer la concentration optimale utilisée pour la croissance des cellules 32Dkit. </td></tr></tbody></table>

mesure de l&#39;activité calpaïne dans des cellules fixées et de la vie par cytométrie en flux

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Les calpaïnes sont omniprésents intracellulaire, sensible au calcium, cystéine-protéases neutres<sup&gt; 1</sup&gt;. Les calpaïnes jouent un rôle crucial dans de nombreux processus physiologiques, y compris la signalisation, le remodelage du cytosquelette, la régulation de l&#39;expression des gènes, l&#39;apoptose et la progression du cycle cellulaire<sup&gt; 1</sup&gt;. Les calpaïnes ont été impliqués dans de nombreuses pathologies, y compris les dystrophies musculaires, cancer, diabète, maladie d&#39;Alzheimer et la sclérose en plaques<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaïne la réglementation est complexe et incomplètement compris. les niveaux d&#39;ARNm et de protéine faible corrélation avec l&#39;activité, limitant l&#39;utilisation de techniques d&#39;expression de gènes ou de protéines pour mesurer l&#39;activité des calpaïnes. Ce protocole décrit une vidéo cytométrie en flux développé dans notre laboratoire pour mesurer l&#39;activité calpaïne dans les cellules fixes et vivant. Cette méthode utilise le substrat fluorescent BOC-LM-CMAC, qui est clivée spécifiquement par la calpaïne, pour mesurer l&#39;activité des calpaïnes.<sup&gt; 2</sup&gt; Dans cette vidéo, l&#39;activité calpaïne dans fixes et vivant des cellules de leucémie murine 32Dkit, seul ou comme partie d&#39;une population de splénocytes est mesuré en utilisant une LSRII (BD Bioscience). Cellules sont 32Dkit montré une activité élevée par rapport aux splénocytes normaux.

Cet article détaillera le protocole de mesure de l&#39;activité calpaïne dans les cellules fixes et de vie en utilisant la cytométrie de flux.

Mesure de l&#39;activité calpaïne dans des cellules fixées et de la Vie par cytométrie en flux

Les calpaïnes sont des protéases à cystéine neutres, ubiquitaires et sensibles au calcium 1. Les calpaïnes jouent des rôles cruciaux dans de nombreux processus physiologiques, ...

Les calpaïnes sont des protéases à cystéine neutres, sensibles au calcium intracellulaire, omniprésentes, qui jouent des rôles cruciaux dans de nombreux processus physiologiques, notamment la signalisation, le remaniement du cytosquelette, la régulation de l'expression génique, l'apoptose et la progression du cycle cellulaire. Pour mesurer l'activité des calpaïnes dans des cellules fixées et vivantes, le substrat fluorescent BUC, LMC MAC est ajouté. Buc LMC MAC est spécifiquement clivé par la calpaïne, entraînant une augmentation de la fluorescence. La variation de fluorescence est surveillée par cytométrie en flux, ce qui révèle une activité accrue des calpaïnes dans les cellules 30 2D kit par rapport aux cytes normaux.Bonjour, je suis Christina Farr du laboratoire du Dr Stewart Berger à l'Université de Toronto, Département d'immunologie et Réseau universitaire de santé. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment mesurer l'activité de la calpaïne dans des cellules fixes et vivantes à l'aide d'un test basé sur la cytométrie en flux. Nous utilisons ce test dans notre laboratoire pour étudier l'activité de la calpaïne dans les cellules de leucémie et de lymphome.Commençons. Avant de c

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