Name: Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Apprenez à générer des virus de la grippe recombinants à partir d'ADN plasmidique par transfection de cellules 293T et MDCK. Cette méthode permet d'étudier la biologie virale et de développer des vaccins potentiels.

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Les auteurs tiennent à remercier les membres passés et présents dans la Adolfo García-Sastre et Peter Palese laboratoires pour le développement des techniques de génétique inverse de la grippe et les plasmides. La recherche dans les laboratoires de AG-S est partiellement financé par CRIP, un centre financé par le NIAID d&#39;excellence pour la recherche sur l&#39;influenza et de surveillance (HHSN266200700010C) et par des subventions NIAD R01AI046954, U01AI070469 et P01AI058113. La recherche en LM-S laboratoire est partiellement financé par le NIAID octroi RO1AI077719.

1. Transfection grippe du virus de secours Virus Influenza A appartient à la famille des Orthomyxoviridae des virus à ARN négatif brin enveloppé. La grippe A génome du virus est constitué de huit gènes de l'ARN de polarité négative différents qui codent au moins 11 protéines virales (figure 1) 4. Nous allons nous concentrer, dans ce rapport, sur le sauvetage de l'un de la souche de laboratoire la plus courante, la grippe A/PR/8/34, 5 l'aide de plasmides ambisens (PDZ) contenant les huit segments de la grippe A/PR/8/34 virale ( Figure 2). Pour le sauvetage des virus grippaux recombinants à partir d'ADN plasmidique, nous recommandons trois transfections indépendantes pour chaque virus recombinant. Si plus d'un sauvetage virus recombinant est tenté, à l'échelle les étapes suivantes accordantly le nombre de virus pour être sauvés. La transfection suivants et le protocole de l'infection est établie pour 6-bien-assiettes. Une représentation schématique du protocole est illustré à la figure 3. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) mélange: Préparer 250 pi de médias OptiMEM et 6-8 pl d'LPF2000 transfection par. Incuber pendant 5-10 minutes à température ambiante (RT). Pendant ce temps, préparer le mélange de transfection de plasmide. </li><li> Mélange de transfection plasmidique: Préparez le cocktail de transfection plasmidique dans 50 ul de médias OptiMEM. Nous utilisons habituellement 1 ug de chaque ADN plasmidique par la grippe sauvetage. Ajouter 1 pl des plasmides PDZ (à 1 ug / ul) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M et NS dans un tube contenant 50 ul de médias OptiMEM. </li><li> OptiMEM-LPF2000 ADN plasmidique mélange: Ajouter 250 pi de l'étape 1.1 dans le mélange d'ADN plasmidique de la grippe de transfection (étape 1.2). Incuber ce mélange pendant 20-30 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, préparer des suspensions de cellules 293T et MDCK pour la transfection. </li><li> Préparation de la co-culture 293T/MDCK: Avant de commencer, mettre le PBS 1X, DMEM 10% FBS 1% PS médias, et de l'EDTA-trypsine mélange à 37 ° C. La densité des cellules doit être à 80-90% de confluence le jour de la transfection. Habituellement, un plat de 100 mm confluents du 293T et un plat de 100 mm confluentes de cellules MDCK peuvent être utilisés pendant 10-12 sauvetages. Nous allons utiliser 250 pl de cellules par puits. Les deux lignées cellulaires seront remises en suspension dans un total de 3 ml de DMEM 10% FBS PS 1%. <ul><li> Soigneusement resuspendre chaque lignée cellulaire dans 10 ml de DMEM 10% FBS PS 1% dans un tube à centrifuger de 15 ml. Vous aurez un tube de cellules 293T et un tube de cellules MDCK. </li><li> Resuspendre les cellules 293T dans 3 ml de DMEM 10% FBS PS 1% et quand resuspendues, livrer les 3 ml pour les cellules MDCK pour resuspendre ces cellules. Cela vous donnera le mélange de cellules 293T et MDCK à utiliser pour vos co-culture. </li><li> Ajouter 250 ul de cellules par puits 293T/MDCK (10-12 6 puits puits). </li></ul></li><li> Après 20-30 minutes d'incubation RT (étape 1.3), ajouter 1 ml de DMEM 10% FBS PS 1% à le mélange d'ADN OptiMEM-LPF2000-grippe plasmide. </li><li> Ajouter le ml 1.3 (étape 1.5) dans les puits avec les 250 ul de cellules 293T/MDCK (étape 1.4). </li><li> Secouez la 6-bien-assiette et laisser incuber l'transfection nuit (ON) dans l'incubateur à 37 ° C et CO 2 5%. </li><li> Le lendemain, environ 16-24 heures post-transfection, changer le support de transfection et incuber les cellules transfectées dans BA DMEM 0,3% à 1% PS contenant 1 ug / ml de trypsine TPCK pendant 48 heures. </li><li> Après 48 heures de l'évolution des médias, le transfert du surnageant des cellules transfectées dans un microtube. </li><li> Centrifuger le surnageant de culture de tissu dans une microcentrifugeuse pendant 1-2 minutes, 13000 rpm. </li><li> Infect frais cellules MDCK en plaques 6 puits (plaqué la veille) ou des oeufs de poulet de 10 jours, âgé de embryonnés avec 200 pi de centrifugé surnageants de culture tissulaire de l'étape 1.10. Incuber les cellules et / ou des œufs à 37 ° C pendant 2-3 jours. <ol><li> L'infection des œufs de poule de 10 jours, âgé de embryonnés: Toutes les procédures d'infecter les œufs de poule embryonnés sont effectuées dans des conditions stériles. <ol><li> Bougie des oeufs de 10 jours en utilisant une vieille boîte à lumière-mirage de voir l'interface entre le sac d'air et de la cavité allantoïdienne. Faire une marque au crayon sur la frontière de l'interface. </li><li> Avec une aiguille seringue de 5 ml faire un trou dans la coquille. </li><li> Avec une seringue de 1 ml, d'infecter chaque oeuf avec 200 pi des surnageants de culture tissulaire de l'étape 1.10. </li><li> Couvrir le trou dans la coquille d'oeuf avec de la cire fondue en utilisant un coton-tige. </li><li> Incuber les œufs infectés à 37οC pendant 2-3 jours. </li></ol></li><li> L'infection de nouvelles cellules MDCK: Le jour avant le passage du surnageant de culture tissulaire de la 293T/MDCK co-cultures, préPare plats plaque à 6 puits avec des cellules MDCK pour atteindre 80-90% de confluence lendemain. Habituellement, une plaque de culture confluente 100 mm de tissu peut être divisé en 6-8 puits. Laver les cellules deux fois avec du PBS 1X, trypsiniser et préparer les plaques à 6 puits. Secouez doucement la main les plaques afin d'avoir une distribution uniforme des cellules. Culture des cellules, ON, dans les 37 ° C incubateur, 5% de CO 2. Avant l'infection, vérifier les cellules sous le microscope pour confirmer une monocouche, puis procéder à l'infection: <ul><li> Laver les cellules deux fois avec 1 ml de PBS 1X. </li><li> Infecter avec l'ul 200 de centrifugé surnageants de culture tissulaire pendant 1 heure à température ambiante. Ne laissez pas les piles sèches. Rock the 6-bien la plaque toutes les 10 minutes. </li><li> Après 1 heure d'absorption virale, retirez le support de l'infection des cellules MDCK et ajouter 2 ml de DMEM BA de 0,3% à 1% PS contenant 1 ug / ml de trypsine TPCK. </li><li> A 48-72 heures après le passage, en fonction de l'efficacité de transfection et de la charge virale, un effet cytopathogène (ECP) sera observée dans les cellules MDCK infectées. CPE suggère un sauvetage réussi. Toutefois, un test HA (partie 2) doivent encore être effectués pour confirmer la présence du virus dans les surnageants de culture de tissus. </li></ul></li></ol></li><li> Récolte de liquide allantoïdien d'oeufs embryonnés de poulets infectés: Toutes les procédures de récolter le liquide allantoïdien d'œufs infectés sont effectuées dans des conditions stériles. Environ 8 à 12 ml de liquide allantoïdien peut être récoltée à partir de chaque œuf de 10 jours-old-infectés. Avant la récolte du liquide allantoïdien, incuber les oeufs de poulet pendant 2 heures (ou ON) à 4 ° C pour tuer l'embryon de poulet et de coaguler le sang. <ul><li> Laver les coquilles avec de l'éthanol à 70% pour établir des conditions stériles. </li><li> Ouvrez l'œuf, avec soin, au cours de la cavité d'air en tapotant avec une cuillère. Retirer la coquille cassée avec l'aide de forceps. </li><li> Avec une aiguille de 1 ml, enlever la membrane allantoïdienne sans casser le jaune de l'œuf. </li><li> Stabiliser l'embryon de poulet avec une spatule pendant que vous guidez une pipette de 10 ml dans le liquide allantoïdien. Recueillir le liquide allantoïdien autant que possible dans un tube à centrifuger de 15 ml sur la glace dans un seau à glace sans se casser ou de recueillir toute de jaune de l'œuf. Utiliser un tube à centrifuger de 15 ml pour chaque oeuf. </li><li> Centrifuger pendant 5 minutes à 4 ° C et le transfert du fluide allantoïdien (sans prendre granulés de globules rouges) à un 15 nouveaux tubes de centrifugation ml. </li><li> Stocker les tubes contenant le liquide allantoïdien centrifugé à 4 ° C jusqu'à ce qu'ils soient vérifiés pour la présence de virus récupéré avec une hémagglutination (HA) de dosage. </li></ul></li></ol> 2. Dosage de HA pour confirmer le sauvetage des virus grippaux recombinants Test d'hémagglutination (HA) est couramment utilisé pour détecter la présence du virus dans les cellules MDCK sauvé surnageants de culture des tissus et / ou le liquide allantoïdien d'œufs récoltés. Alternativement, des tests d'immunofluorescence (IFA) peut être également effectuée. Une fois un test identifie la présence du virus a sauvé, le virus doit être purifié sur plaque et de la composition génétique du virus sera confirmée par RT-PCR et séquençage. La présence du virus dans les surnageants de culture de tissus MDCK et / ou dans le liquide allantoïdien d'œufs infectés peut être déterminé en utilisant macroscopiquement HA de poulet (ou autre source) des globules rouges (RBC). La présence du virus induit hémagglutination de RBC tandis que l'absence de virus permet la formation d'une pastille rouge dans le fond du puits (figure 4). Dans le cas du virus de la grippe, on croit qu'environ 10 3 -10 4 unités formant plaque (UFP) sont nécessaires pour donner un signal positif dans le dosage de HA, par conséquent, une PRI peut être effectuée en parallèle avec le dosage de HA pour confirmer un résultat vrai négatif. IFA avec primaire des anticorps anti-grippe est plus sensible que le test HA car moins de 103 à 104 virus peuvent être détectés avec cette technique. Il est possible que les surnageants ou liquide allantoïdien qui sont HA-négatifs sont positifs par IFA. Dans ce cas, le virus doit être amplifié par passage, à nouveau, dans les cellules MDCK ou des œufs. Liquide allantoïdien et / ou de surnageants de culture de tissus provenant du second passage doit désormais être clairement positif dans le test HA. Dosages HA sont réalisées en V-bottom plaques de 96 puits. Négative (par exemple, PBS 1X) et positive (surnageants de culture des tissus et / ou liquide allantoïdien d'une infection par le virus de la grippe) des échantillons de contrôle doivent toujours être inclus dans tout dosage HA pour le valider. <ul><li> Déposer 50 ul de PBS 1X dans chaque puits de la V-96 puits à fond plat. </li><li> Ajouter 50 ul dules surnageants MDCK culture de tissus et / ou liquide allantoïdien d'œufs infectés du pour le bien premier et, faire deux dilutions successives pour les puits suivants. Jeter le surplus de 50 ul du puits dernier. </li><li> Ajouter 50 ul de 0,5% -1,0% de cellules rouges du sang de poulet (préparé dans du PBS 1X) à chaque puits. </li><li> Incuber le V-96 puits à fond plat pendant 30-45 minutes (jusqu'à ce qu'un point rouge est visible au fond d'un échantillon de PBS témoin négatif) sur la glace. Lisez et interpretate les résultats comme indiqué dans la figure 4. </li></ul> 3. Passage de surnageants de culture de tissus Un résultat négatif dans le test HA peut être le résultat de l'efficacité de transfection faible avec de faibles niveaux de virus présent être dans le surnageant de culture tissulaire et / ou liquide allantoïdien. Passage de ces échantillons dans des œufs frais MDCK et / ou embryonnés permettra l'amplification du virus (comme indiqué dans la figure 3) Les infections sont réalisées comme précédemment décrit dans la section 1.11.2. 4. Les résultats représentatifs Le succès de secours virus de la grippe sera confirmée par la présence d'un dosage de HA positifs (figure 4). De plus, l'existence de CPE dans les cellules infectées avec le surnageant de culture de tissus ou avec le liquide allantoïdien d'oeufs proposera un sauvetage viral positif. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Structure de virus de la grippe: le virus de la grippe est entouré par une bicouche lipidique contenant les deux glycoprotéines virales (HA, NA) et, également, la protéine du canal ionique M2. HA est la protéine de fixation virale, responsable de la liaison à l'acide sialique contenant des récepteurs. NA est responsable de la libération viral à partir de cellules hôtes. Sous la bicouche lipidique, est une protéine de la couche composée de la protéine de matrice surface de l'enveloppe interne 1, M1, qui joue un rôle dans l'assemblage et le bourgeonnement du virion et la protéine nucléaire exportation (NEP), requise pour l'exportation nucléaire de ribonucleocapsids virale. Le noyau du virus est constitué d'une ribonucléoprotéine (RNP) complexe, composé de 8 à simple brin d'ARN négatif gènes viraux encapsidé par la nucléoprotéine virale NP. Associé avec le complexe RNP sont les virale ARN-dépendante ARN polymérase sous-unités PA, PB1, PB2 et. Les protéines non structurales NS1 et PB1-F2, codées par des segments d'ARN du NS et PB1, respectivement, ne font pas partie de la structure du virion. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Plasmides grippe sauvetage du virus: Le virus de la grippe huit gènes clonés dans le plasmide ambisens PDZ sont indiqués. plasmidique PDZ 6, dérivé du plasmide d'expression de protéines pCAGGS 7, est un vecteur plasmidique bidirectionnelle avec un ARN polymérase humaine, je promoteur et une séquence de terminaison de souris qui code l'ARN génomique négative sens; en orientation opposée à la polymérase I unir, une polymérase II cassette de transcription (poulet β-actine promoteur et polyA) code pour les protéines virales à partir du même gène viral. ADNc de chaque segment viraux sont générés par RT-PCR avec des amorces avant et arrière contenant le site de Sapi endonucléase de restriction et les régions non codantes de chaque segment (boîtes noires à l'extrémité des gènes viraux). Le produit de PCR est cloné dans le PDZ digéré par Sap-I. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Huit à base de plasmide système de sauvetage de la grippe: les plasmides contenant les gènes PDZ 8 virus de la grippe sont co-transfectées, en suspension, en 293T-MDCK cellules co-cultures (jour 1). Vingt-quatre heures après la transfection, les médias sans FBS, mais contenant TPCK / trypsine est remplacée (jour 2). Quarante-huit heures après avoir changé les médias, surnageant de culture tissulaire est récolté et utilisé pour infecter des cellules MDCK ou 10 jours d'âge des œufs de poule embryonnés (jour 4). 48-72 heures post-amplification, les surnageants de culture de tissus provenant MDCK cellules infectées ou le liquide allantoïdien d'œufs sont récoltés et analysés pour la présence du virus par HA (jour 6). Si aucun virus n'est détecté, les surnageants mêmes et / ou liquide allantoïdien peut être re-passages en cellules MDCK fraîches et / ou des œufs embryonnés. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. L'hémagglutinine dosage (HA): Hémagglutination de RBC par particule virale est visible macroscopiquement et est la base pour détecter les particules virales dans le surnageant de culture de tissus et / ou liquide allantoïdien. Bien que le dosage de HA ne fait aucune discrimination entre les particules virales qui sont infectieux et les particules qui sont dégradées et ne sont plus en mesure d'infecter les cellules, le dosage est un bon indicateur de présence de virus dans des échantillons. A) l'absence (en haut) de la présence (en bas) du virus dans les échantillons biologiques est déterminée par la présence de RBC dans le fond de l'assiette ou de leur absence, respectivement. B) Un résultat représentatif à partir d'un dosage de HA avec aucune des niveaux détectables de virus (en haut) ou la présence (en bas) du virus est montré.

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Mount Sinai School of Medicine a droits de propriété intellectuelle dans le domaine des virus grippaux recombinants, et AG-S est un inventeur de cette propriété intellectuelle.

Sauvetage des virus grippaux recombinants de l&#39;ADN plasmidique est un processus simple et direct une fois le protocole est systématiquement réalisée dans le laboratoire, mais au début, de multiples choses peuvent aller mal. Il est impératif d&#39;avoir une bonne préparation de plasmide pour générer le virus. Un bon entretien des lignées cellulaires (293T et MDCK) est crucial pour un sauvetage réussi virale. Traditionnellement, un marqueur génétique est inséré dans une gène de la grippe plasmide codant, par mutagénès...

Les lignées cellulaires 293T (numéro de catalogue CRL-11268) et MDCK (numéro de catalogue CCA-34) des lignées de cellules sont maintenues dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 dans du DMEM 10% FBS, 1% de PS. Les cellules sont disponibles sous forme de l&#39;American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, en Virginie. 20110-2209 USA). Œufs de poule embryonnés Oeufs embryonnés de poulet de 10 jours anciens peuvent être obtenus auprès de Charles River Laboratories, spécifiques d&#39;alimentation pathogènes aviaire Fee (SPAFAS) Produits et Services aviaire. Communes Franklin, 106 Route 32, au nord de Franklin, CT 06254 USA. Les œufs sont incubés à 37 ° C avant et après l&#39;infection virale. Avant et après l&#39;infection virale, les œufs sont mirés pour déterminer la viabilité des embryons. Il est très important de chercher des oeufs morts, avant et après l&#39;infection virale. Avant l&#39;infection d&#39;un œuf mort peut être facilement repéré par l&#39;absence de vaisseaux sanguins ainsi que l&#39;absence de mobilité embryon. Lorsque mirés, embryons vivants se déplacer. Après l&#39;infection virale d&#39;un oeuf mort (probablement liée à l&#39;infection du virus de la grippe) seront facilement repérés par le mauvais aspect de l&#39;œuf comme on le voit par le volume plus petit et sanglante du liquide allantoïdien. Infected-œufs sont jetés dans un double sac autoclavable et autoclavés suivant les procédures standard. Cellules de sang de poulet rouges (RBC) Poulet RBC peuvent être achetés auprès de fermes Truslow, 201 Valley Road, Chestertown, MD 21620. Conserver à 4 ° C. Pour les dosages HA, laver 5 ml de la RBC de poulet avec 45 ml de PBS 1X dans un tube à centrifuger de 50 ml. Centrifuger pendant 5 minutes à 1000 RPM, RT. Jeter soigneusement le surnageant et d&#39;utiliser une dilution de 1:1000 de l&#39;granulés en PBS 1X RBC (concentration finale de 0,5-1,0% RBC). Surnageants de culture de tissus et liquides allantoïdiens Les deux, les surnageants de culture de tissus et les liquides allantoïdien peut être conservé à 4 ° C pendant une courte période de temps. Après avoir confirmé le sauvetage du virus, les virus à partir de surnageants de cellules ou de fluide allantoïdien sont stockés à -80 ° C. Les plasmides Tous les plasmides sont préparés en utilisant les recommandations d&#39;un fabricant maxi kit plasmidique suivant. Tous les plasmides sont aliquot à des concentrations de 1 ug / ml dans le trou DDH 2 O et stocké à -20 ° C. Pour stockage à court terme, le plasmide peut être garder à 4 ° C. La concentration de l&#39;ADN plasmidique purifié est déterminée par spectrophotométrie à 260 nm, avec une pureté d&#39;être estimée en utilisant le ratio 260:280 nm. Préparations à 1,8 à 2,0 nm 260:280 ratios sont considérés comme affectés à des fins de sauvetage virus. De plus, la concentration et la pureté plasmidique doit être confirmé par chromatographie sur gel d&#39;agarose. Ambisens PDZ plasmides (6) contenant les huit gènes viraux de la grippe A/PR/8/34 (7) sont illustrés dans la Figure 2. Virus Le protocole décrit pour le sauvetage de la grippe A/PR/8/34 peut être effectuée sous du niveau de biosécurité (BSL) 2 conditions. Le matériel contaminé, y compris les surnageants de culture des tissus et des œufs embryonnés, doivent être stérilisés avant leur élimination. Sauvetage des virus de la grippe d&#39;autres peuvent exiger des conditions BSL supérieur et, par conséquent, des conditions particulières / mesures de sécurité devront être respectées. Milieux de culture tissulaire et des solutions DMEM 10% FBS 1% PS: 445 ml de milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 50 ml de sérum fœtal bovin (FBS), et 5 ml de 100X pénicilline / streptomycine (PS). Conserver à 4 ° C. Ce support sera utilisé pour maintenir les cellules 293T et MDCK ainsi que pour les transfections. BA DMEM 0,3% à 1% PS: 495,7 ml de DMEM, 4,3 ml de 35% d&#39;albumine bovine (BA). Conserver à 4 ° C. Juste avant utilisation, ajouter la trypsine TPCK traitée à une concentration finale de 1 ug / ml. Les médias infectieuses. Phosphate 10X saline tamponnée (PBS): 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 2 g de KH 2 PO 4. Ajouter ddH 2 O jusqu&#39;à 1 litre. Ajuster le pH à 7,3. Stériliser par autoclave. Stocker à température ambiante. PBS 1X: Diluer PBS 10X 1:10 avec ddH 2 O. Stériliser par autoclave et stocker à température ambiante.

génération de virus recombinants de la grippe des adn plasmidique

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Les efforts déployés par un certain nombre de groupes de recherche sur la grippe ont été crucial dans le développement et l&#39;amélioration de la grippe A génétique inverse du virus. Initialement créé en 1999<sup&gt; 1,2</sup&gt; À base de plasmide techniques de génétique inverse pour générer des virus recombinants ont révolutionné le domaine de recherche sur la grippe à cause des questions spécifiques ont été répondues par génie génétique, infectieuse, virus grippaux recombinants. De telles études incluent la réplication du virus, la fonction des protéines virales, la contribution des mutations spécifiques dans les protéines virales dans la réplication virale et / ou la pathogénie et, aussi, en utilisant des vecteurs viraux virus grippaux recombinants exprimant des protéines étrangères<sup&gt; 3</sup&gt;.

Sauvetage des virus grippaux A partir de l&#39;ADN plasmidique est une technique de base et essentiels expérimentale qui permet aux chercheurs de la grippe pour générer des virus recombinants pour étudier les multiples aspects de la biologie du virus de la grippe, et pour être utilisés comme vecteurs potentiels ou de vaccins.

Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

Les efforts de plusieurs groupes de recherche sur la grippe ont été déterminants dans le développement et l'amélioration de la génétique inverse du virus de l'influenza A. À l'origine...

L'objectif général de l'expérience suivante est de produire un virus de la grippe recombinant à partir d'ADN plasmidique. Cette étape est réalisée en transfectant les huit plasmides d'ADN codant pour les gènes de la grippe dans une co-culture de cellules 293T et MDCK à l'aide de Lipofectamine 2000 comme seconde étape. Le surnageant de culture cellulaire sera utilisé pour infecter des cellules MDCK fraîches et/ou des œufs embryonnés de poulet âgés de 10 jours, ce qui permettra d'amplifier le virus présent dans le surnageant des cellules transfectées.Ensuite, nous récolterons les surnageants des cultures tissulaires et le liquide d'Alan Toic provenant d'œufs embryonnés de poulet infectés. Afin de confirmer la présence du virus à l'aide d'un test d'hémagglutination (HA), les résultats obtenus indiquent la présence du virus en fonction de la présence d'agglutination. Bonjour, je suis Luis Martinez Rito du Département de microbiologie et d'immunologie de l'Université de Rochester.Aujourd'hui, je vais vous montrer comment isoler des virus de la grippe recombinants à partir d'ADN plasmidique. Nous utilisons cette technique dans notre laboratoire pour étudier de multiples aspects de la biologie du virus de la grippe et pour développer des vecteurs et des vaccins potentiels. Commençons donc.Avant de commencer la transfection, porter à 37 degrés Celsius les réactifs de culture cellulaire, soit le phosphate tamponné saline (PBS-EDTA), la trypsine et le milieu de Eagle modifié par KO (DMEM) contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (PS). Ensuite, préparer 250 microlitres de milieu Opti-MEM et de six à huit microlitres de Lipofectamine 2000 par transfection, puis incuber à température ambiante pendant cinq à dix minutes. Préparer le mélange de transfection au plasmide en ajoutant un microgramme d’ADN plasmidique dans un tube contenant 50 microlitres de milieu Opti-MEM. Ajouter un microgramme de chacun des huit plasmides PDZ contenant des segments viraux.PB deux PB un pa ha np na m et N MS. Ajouter 250 microlitres de milieu opti MEM à température ambiante contenant 2000 PFU par mL dans le mélange de transfection des plasmides ADN de la grippe et incuber de 20 à 30 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, préparer des suspensions de cellules 293T et MDCK pour la transfection. La densité des cellules 293T et MDCK doit être comprise entre 80 et 90 % de confluence.Le jour de la transfection, laver environ cinq fois dix puissance six cellules par boîte de 100 millimètres, détacher les cellules et les centrifuger en utilisant des techniques standards de culture cellulaire. RÉSUSPENDRE les cellules 293T dans trois millilitres de DMEM-FBS-PS. Une fois resuspendues, ajouter les trois millilitres aux cellules MDCK pour resuspension.Ceci permettra d'obtenir le mélange de cellules 293T et MDCK destiné à être utilisé en co-culture. Ajouter 250 millilitres des cellules 293T-MDCK par puits dans une plaque à six puits. Après 20 à 30 minutes, ajouter un millilitre de DMEM contenant 10 % de FBS et 1 % de PS à chacun des mélanges de plasmides d'ADN de grippe opti M-E-M-L-P-F 2000.Ensuite, ajoutez dans les puits 250 millilitres de cellules 293T-MDCK. Agitez doucement la plaque à six puits et laissez la transfection s'incuber toute la nuit dans l'incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le jour suivant, 16 à 24 heures après la transfection, changez le milieu de transfection et incubez les cellules transfectées dans du DMEM contenant 0,3 % d'albumine bovine ou BA et 1 % de PS, ainsi qu’un microgramme par millilitre de L-tosyl-lado-2-phényl-éthyl-chlorométhylcétone ou trypsine traitée au TPCK, pendant 48 heures.Si une infection de MDCK est souhaitée, ensemencer de nouvelles cellules MDCK un jour avant l'infection ou deux jours après la transfection virale initiale, puis 48 heures après le changement du milieu, transférer le surnageant SUP des cellules transfectées dans un tube de microcentrifugeuse. Centrifuger le surnageant de culture cellulaire dans une microcentrifugeuse pendant une à deux minutes à 13 000 tr/min avant l'infection des cellules MDCK. Vérifier les cellules au microscope afin de confirmer la présence d'une monocouche, puis procéder à l'infection. Laver les cellules deux fois avec un millilitre de PBS 1×.Ajoutez 200 microlitres de surnageants de culture cellulaire centrifugés provenant des étapes précédentes et incubez pendant une heure à température ambiante. Agitez doucement la plaque toutes les 10 minutes afin d'éviter le dessèchement des cellules après une heure d'adsorption virale. Retirez le milieu d'infection des cellules MDCK et ajoutez deux millilitres de DMEM contenant 0,3 % de BA, 1 % de PS et un microgramme par millilitre de trypsine TPCK.Un effet cytopathogène sera observé dans les cellules MDCK infectées entre 48 et 72 heures après le passage. Selon l'efficacité de la transfection et la charge virale, les effets cytopathogènes consistent en un arrondissement des cellules, leur mort et leur détachement de la surface, entre autres. Ensuite, isoler le surnageant des cellules MDCK pour le test afin de confirmer la présence du virus en culture tissulaire.Centrifuger les surnageants en microcentrifugeuse pendant une à deux minutes à 13 000 tr/min pour éliminer les débris cellulaires, puis transférer dans un nouveau tube d'essai pour infecter des œufs embryonnés de poulet. Observer aux rayons lumineux les œufs âgés de 10 jours à l’aide d’un candélabre lumineux afin de visualiser l’interface entre la chambre à air et la cavité allantoïque. Marquer au crayon la frontière de l’interface à l’aide d’une aiguille de seringue de cinq millilitres.Percez un trou dans la coquille de l'œuf à l’aide d’une seringue d’un millilitre. Infectez chaque œuf avec 200 microlitres des surnageants de culture tissulaire obtenus précédemment. Recouvrez le trou dans la coquille d’œuf avec de la cire fondue à l’aide d’un coton-tige.Incuber les œufs infectés à 37 degrés Celsius pendant deux à trois jours avant de récolter le liquide allantoïque. Incuber les œufs de poulet pendant deux heures ou toute la nuit à quatre degrés Celsius afin de tuer l'embryon de poulet et de faire coaguler le sang ensuite. Laver les coquilles d'œufs avec de l'éthanol à 70 % pour établir des conditions stériles.Ouvrir délicatement l'œuf au-dessus de la cavité aérienne en tapotant avec une cuillère. Retirer les morceaux de coquille à l’aide de pinces munies d’une aiguille d’un millilitre. Enlever la membrane allantoïque sans casser le jaune d’œuf.Stabilisez l'embryon de poulet à l'aide d'une spatule et introduisez une pipette de 10 millilitres dans le liquide allantoïque. Recueillez autant de liquide allantoïque que possible. Huit à 12 millilitres dans un tube de centrifugation de 15 millilitres placé sur de la glace pour chaque œuf.Ne cassez ni ne recueillez aucun jaune d'œuf. Centrifugez pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et transférez le liquide alan toïque dans de nouveaux tubes de centrifugation de 15 millilitres placés sur de la glace. Conservez les tubes contenant le liquide alan toïque à quatre degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils soient vérifiés pour la présence d'un virus récupéré à l'aide d'un test d'hémagglutination. Le test d'hémagglutination est réalisé à l'aide de plaques VBO à 96 puits, avec des contrôles négatifs utilisant du PBS 1 X et des contrôles positifs de culture tissulaire.Supinez et/ou utilisez le fluide d'Alan Toic. Le fluide provenant d'une infection par un virus de la grippe non résistant doit toujours être inclus dans le test NAHA. Distribuez 50 microlitres de PBS 1X dans chaque puits d'une plaque 96 puits en fond V, ajoutez 50 microlitres des surnageants de culture tissulaire MDCK et/ou du fluide d'Alan Toic provenant des œufs infectés dans le premier puits, puis effectuez des dilutions sérielles deux fois pour les puits suivants.Jetez les 50 microlitres supplémentaires du dernier puits. Ajoutez 50 microlitres de 0,5 à 1 % de globules rouges de poulet dans chaque puits, puis incubez la plaque 96 puits en fond V pendant 30 à 45 minutes sur de la glace, ou jusqu’à ce qu’un dépôt rouge soit visible au fond de l’échantillon témoin négatif au PBS. La présence de virus dans les surnageants de culture tissulaire MDCK et/ou dans le liquide allantoïque d’œufs infectés peut être déterminée macroscopiquement à l’aide de l’hémagglutinine des globules rouges de poulet.La présence de virus induit une hémagglutination, tandis que l'absence de virus permet la formation d'un culot rouge au fond du puits. De plus, l'apparition de lésions cytopathogènes telles que l'arrondissement, la mort et le détachement des cellules de la surface, entre autres, dans les cellules infectées par les surnageants de culture tissulaire ou par le liquide allantoïque d'œufs, suggère un isolement viral positif. Dans le cas du virus de la grippe, environ 10³ à 10⁴ unités formant des plaques (pfu) sont nécessaires pour obtenir un signal positif dans le test d'hémagglutination (HA). Par conséquent, un test d'immunofluorescence peut être réalisé en parallèle du test HA afin de confirmer un résultat négatif réel.Étant donné que la présence de particules virales individuelles peut être détectée en colorant les cellules infectées avec des anticorps marqués au fluorochrome, il est possible que des surnageants négatifs pour l’HA ou des liquides d’Alan Toic soient positifs lorsqu’on utilise des dosages d’immunofluorescence. Dans ce cas, le virus doit être amplifié en le reconditionnant dans des cellules MDCK ou dans des œufs. Le liquide d’Alan Toic et/ou les surnageants de culture cellulaire provenant du deuxième passage devraient désormais être clairement positifs dans le test d’HA.Nous venons de vous montrer comment isoler des virus de la grippe à partir d'ADN plasmidique. L'isolement de virus de la grippe à partir d'ADN plasmidique est un processus simple et direct. Premièrement, le protocole a été initialement mis au point en laboratoire pour l'isolement de virus de la grippe recombinants à partir d'ADN plasmidique.Nous recommandons trois transfections indépendantes par virus recombinant. Si plusieurs tentatives de récupération de virus grippal recombinant sont effectuées, ajustez les étapes en fonction du nombre de virus à récupérer. Le protocole de transfection et d'infection suivant pour la récupération de virus grippaux recombinants à partir d'ADN plasmidique est adapté à des plaques de six puits.Toutes les procédures de prélèvement des fluides LAN toiques à partir d'œufs infectés sont effectuées en conditions stériles. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Cette vidéo montre la génération de particules pseudo-virales de la grippe (VLP) dans un système de mammifères. Lors de l’expression de trois vecteurs d’expression eucaryotes – codant pour différentes protéines structurelles virales – dans des cellules hôtes de mammifères appropriées, les protéines virales exprimées s’auto-assemblent en VLP sur la membrane plasmique de l’hôte et se libèrent par bourgeonnement à partir de la surface cellulaire.

Technique de génération de particules semblables à un virus de la grippe par l’intermédiaire d’un système de mammifère

La vidéo présente une méthode pour créer des virus grippaux recombinants adaptés au froid. Il s’agit de transfecter des cellules humaines avec des plasmides bidirectionnels, suivi d’une incubation à basse température pour produire des virus adaptés à la production de vaccins, caractérisés par une réplication réduite dans des conditions plus chaudes.

Génération de virus grippaux vivants atténués recombinants pour les vaccins

Nous décrivons ici un moyen pour exprimer des antigènes de surface du virus de l'influenza correctement repliés et fonctionnels dérivés du nouveau virus H7N9 chinois dans des cellules d'insectes. La technique peut être adaptée pour exprimer ectodomaines de toutes les protéines virales ou cellulaires superficiels.

L&#39;expression de l&#39;hémagglutinine recombinante fonctionnelle et la neuraminidase du virus de la nouvelle grippe H7N9 à l&#39;aide du système d&#39;expression baculovirus

Un protocole rapide et modulaire pour la génération de virus de vaccinia recombinants exprimant des protéines fluorescentement marquées simultanément utilisant la méthode de sélection dominante transitoire est décrit ici.

Méthodologie pour la génération efficace de protéines du virus de la vaccine marquées par fluorescence

Il y a un manque général de connaissances sur le fonctionnement des vaccins. Ici, nous proposons l’utilisation combinée de la génétique inverse et de souris chimériques de la moelle osseuse pour mieux comprendre les réponses immunitaires précoces de l’hôte aux vaccins, en mettant l’accent sur les cellules dendritiques et l’immunité des lymphocytes T.

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Expression et purification de particules de virus-like pour la vaccination

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Production de particules pseudotypées de grippe infectieuse à haut régime avec des glycoprotéines d'enveloppe provenant de virus H5N1 hautement pathogènes et de virus H7N9 aviaires

La génération de rotavirus recombinants à partir de l’ADN plasmide fournit un outil essentiel pour l’étude de la réplication et de la pathogénie du rotavirus, et le développement de vecteurs et de vaccins d’expression de rotavirus. Ici, nous décrivons une approche simplifiée de génétique inverse pour générer des rotavirus recombinés, y compris des souches exprimant des protéines fluorescentes de reporter.

Méthode simplifiée de génétique inversée pour récupérer les rotavirus recombinés exprimant des protéines reporter

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Génération rapide et transparente de poxvirus recombinés à l’aide de la gamme d’hôtes et de la sélection visuelle

Apprenez à générer des virus de la grippe recombinants à partir d'ADN plasmidique par transfection de cellules 293T et MDCK. Cette méthode permet d'étudier la biologie virale et de développer des vaccins potentiels.

Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

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